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Neuroscience

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52730

Introduction

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência 1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 + intracelular ([Ca 2+] i) nos terminais pré-sinápticos - tanto directamente, devido à relativamente elevada condutância de cálcio de certos subtipos de nAChR, e indirectamente, por cascatas de sinalização intracelular 5, aumentando, assim, a libertação de neurotransmissores. De facto, a activação dos nAChRs pré-sinápticos tem sido associada com mudanças na libertação de uma grande variedade de neurotransmissores, incluindo glutamato, GABA, acetilcolina, umND dopamina 6-10. Embora este processo tem sido estudada usando métodos electrofisiológicos indirectamente em diversas sinapses, indicadores ópticos de [Ca2 +] i e a reciclagem das vesículas sinápticas permitir uma medição mais directa e temporalmente precisa dos fenómenos pré-sinápticos.

Localização pré-sináptica dos nAChRs foi demonstrada de forma convincente com rotulagem imuno-ouro direta de nAChRs na microscopia eletrônica (EM) nível 11,12. Várias outras técnicas também têm sido utilizados para tratar a localização do nAChR indirectamente, incluindo a detecção de locais de nAChRs subunit- quimeras de proteína fluorescente em neurónios cultivados 13,14, electrofisiológico gravação de correntes de nAChR em terminais sinápticos 15,16, monitorização de nicotina induziu alterações na [Ca 2 +] i em terminais nervosos sinápticas por imagens ao vivo de células 17 e monitoramento indireto da liberação do neurotransmissor no terminal sináptico portécnicas de imagem de células vivas com indicadores fluorescentes, incluindo exocitose das vesículas sinápticas vistos por estirilo corantes anfip�icos FM (FM1-43 e FM4-64) e / ou synapto-pHluorin e por repórteres fluorescentes neurotransmissores específicos, como CNiFERs para ACh e iGluSnFr para glutamato 18-20. No geral, essas abordagens atuais para identificar a localização pré-sináptica dos nAChRs são complicadas e exigem sistemas e técnicas especiais para permitir a identificação confiável e monitorização fisiológica da atividade pré-sináptica.

Aqui nós descrevemos protocolos e equipamentos para um sistema in vitro de co-cultura de um hipocampo ventral (vHipp) - núcleo accumbens (NACC) circuito que fornece acesso direto para identificar e analisar os dois componentes pré e pós-sinápticos de transmissão sináptica. Mostramos exemplos de localização pré-sináptica dos nAChRs ea imagens de células vivas de nAChR mediada sinalização de Ca2 + e liberação de neurotransmissores aloaxônios ng vHipp. Uma extensão natural (e direta) do protocolo apresentado aqui é a preparação de contatos pré e pós-sinápticos composta de neurônios de diferentes genótipos. Deste modo, a contribuição de um produto de gene em particular para o pré e / ou de mecanismos pós-sinápticos de modulação pode ser avaliada directamente.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80-23, revisado 2012) e estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use para Comitês de Pesquisa em Stony Brook University (# 1618 e # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturas

  1. Camundongos Sacrifice (pós-natal dias 0-3, a partir do tipo selvagem (WT) ou nAChRs α7 linha de camundongo transgênico) com CO 2. Decapitar cada filhote e salvar a cauda em um tubo de 1,5 ml de centrífuga para post facto genotipagem. Execute as seguintes etapas em uma capa esterilizado.
  2. Remover o topo do crânio com tesouras e pinças para expor todo o cérebro. Começando na junção onde os córtices cerebrais em parte, de um ao outro caudalmente, obter uma secção coronal que contém os córtices posteriores incluindo o vHipp 5,21 sob um microscópio de dissecação.
  3. Dissecar vHipp tiras de tecido contendo a região CA1-subículo de acordo com um desenvolvimento atlas de cérebro de ratinho 22 (Figura 1A). Transferir para um prato de cultura de 35 milímetros contendo meio de cultura frio (4 ° C), cortadas em pequenas fatias finas (cerca de 100 mm x 100 mm microslices).
  4. Pré-incubar 12 milímetros poli-D-lisina / laminina revestidos por lamelas de vidro dentro de 24 placas de cultura de tecidos com meio de cultura (~ 500 mL) durante pelo menos 30 min no incubador a 37 ° C. Remova a mídia antes do plaqueamento microslices.
  5. A placa com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo no centro da lamela com uma quantidade mínima de meio (~ 50 ul, contendo ~ 20 peças de microslices) para facilitar a fixação dos explantes. Placa microslices vHipp provenientes de um único animal (ou a + / + ou - / - genótipo da linha α7 transgênico) em cada lamela.
  6. Após os explantes resolver sobre a lamela, adicione delicadamente mídia adicional (~ 100 mL) por the parede de modo que o nível dos meios de comunicação é alta o suficiente para cobrir completamente os explantes sobre a periferia, mas não os que estão no centro da lamela.
  7. Depois de uma O / N de incubação em 37 ° C, 5% de CO2, dispersar NACC neurónios embrionários do dia 18 ao dia pós-natal uma ratinhos WT e adicionar aos explantes.
    1. Dissecar tecidos NACC de acordo com um atlas do mouse cérebro em desenvolvimento 20 (Figura 1B).
    2. Cortar em pequenos pedaços (cerca de 500 mm × 500 mm microslices) e transferir para um tubo de 15 ml.
    3. Trata-se com 0,25% de tripsina (2 ml) durante 15 min a 37 ° C. Lavar pedaços de tecido três vezes com meio de lavagem frio (5 ml, 4 ° C), seguido por uma lavagem em meio de cultura frio (5 ml, 4 ° C). Permitir suspensão para descansar por 5 minutos em cada etapa de lavagem e, em seguida despeje cuidadosamente o sobrenadante.
    4. Separar as células por trituração suave em 2 ml de meio de cultura com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo levemente.
    5. Transsuspensão de células fer para outro tubo de 15 ml e centrifugar a 2000 x rpm durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura em 1 ml por 6 filhotes. Dispersar as células com cuidado pipetando em mídia várias vezes com uma pipeta Pasteur polida-fogo.
    6. Adicionar 0,25 ml de células NACC dispersos para cada lamela com explantes vHipp.
    7. Manter as culturas numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2. Coloque placas de cultura de compressas de gaze estéril umedecido para estabilizar mecanicamente e manter a umidade, facilitando a formação de sinapses.

2. Immunocytochemistry

  1. Fix culturas (5-7 dias in vitro) em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose / PBS (~ 500 ul por lamela, 20 min, RT).
  2. Permeabilizar as culturas com 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul por lamela, 5 min, RT).
  3. Culturas em bloco com 10% de soro de burro normal em PBS (~ 500 mL por lamela, 30 min, RT) antes de Antibody coloração. Incubar com anticorpos primários o / n a 4 ° C. Use os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti- (nAChRs α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunidades, 1: 500), anti-vesicular transportador de glutamato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
  4. Lavar anticorpos primários com PBS (3 vezes / ~ 500 ul por lamela, 5 min) e depois incubar as culturas em anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 (~ 500 mL por lamela, 1: 500) ou Alexa 594 (~ 500 mL por lamela , 1: 500) durante 1 hora a 37 ° C.
  5. Incubar em culturas αBgTx conjugados com Alexa 594 (~ 500 mL por lamela, 1: 1000 em meio de cultura) durante 45 min a 37 ° C, antes da fixação para rotulagem superfície α7 * nAChRs.
  6. Montagem e vedação lamelas.
  7. Capturar imagens com um microscópio de fluorescência equipado com objectivos Plan-Apocromática (20X com 0,8 NA ou 63X de petróleo com 1,4 NA) e uma câmera CCD.

3. FM1-43 Based vesicular Fusão

  1. Manter culturas (5-7 dias in vitro) em uma câmara de imagem, montar a câmara no disco giratório microscópio confocal. Continuamente perfundir (1 ml / min) com HBS cocktail à TA.
  2. Parar de perfusão e de carga culturas com 10 uM FM1-43 em 56 mM de K + ACSF (~ 500 mL) durante 90 segundos (coloração), lavar corante externo afastado durante 15 min com Ca 2+ livre HBS contendo ADVASEP-7 (0,1 mM) para eliminar FM1-43 ligada à membrana.
  3. Estimular as culturas com 56 mM de K + ACSF (~ 500 mL) sem FM1-43, durante 120 segundos (descoloração), recarregar as culturas com FM1-43 utilizando as mesmas condições, e lava-se novamente com o Ca2 + livre de HBS contendo ADVASEP-7 para 15 min.
  4. Adquirir FM1-43 imagens de fluorescência com disco giratório microscópio confocal equipado com uma objectiva Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e capturar imagens com uma câmera CCD.
  5. Coletar imagens FM1-43 fluorescência de base (a cada 2 s por 1 min) Como o controlo de pré-nicotina; aplicam-se a nicotina (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Mantenha lapso de tempo imagens de captura antes, durante e após a aplicação de nicotina cada 2 s por 5 min.
  6. Quantificar FM1-43 intensidade de fluorescência antes (F coloração) e depois (F descoloração) aplicação de nicotina em cada bouton sináptica.
  7. Calcular quantidade total de fluorescência FM1-43 libertado ao longo dos axónios vHipp pela quantificação da diferença de FM1-43 intensidade de fluorescência antes e após a aplicação de nicotina (Af = F coloração -F descoloração). Analisar fração de diminuição da intensidade de fluorescência após a nicotina com a seguinte equação: F diminuição% = Af / F coloração.

Imagem 4. Cálcio

  1. Enxágüe culturas (5-7 dias in vitro) rapidamente com HBS normal, em seguida, carregar culturas com 5 Indicador de Fluo-4 Ca 2+ (Éster AM) e 0,02% de Pluronic F-127 em HBS (2 ml) durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Lave a Fluo-4 com solução HBS (3 vezes / 5 min). Retorno culturas para incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante pelo menos 30 min.
  3. Manter as culturas na mesma câmara de imagem e mesmas condições que as descritas na secção de fusão vesicular com base FM1-43 (veja o passo 3.1).
  4. Coletar imagens Fluo-4 fluorescência de projeções axonais dos micro-fatias vHipp com um objectivo Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e uma câmera CCD.
  5. Recolha de linha de base de Fluo-4 imagens de fluorescência (a cada 10 segundos durante 2 minutos) como o controlo de pré-nicotina, nicotina aplica (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Manter lapso de tempo de captura de imagens, antes, durante e após a aplicação da nicotina a cada 10 segundos durante 30 minutos.
  6. Salve todas as molduras dos fluo-4 imagens de fluorescência-primas, a exportação como uma série deImagens em formato TIFF para posterior análise.
  7. Recolha a intensidade integrada de fluo-4 fluorescência ao longo vHipp axónios antes e após a aplicação de nicotina.
  8. Normalizar a intensidade de fluorescência integrada com a seguinte equação: Af / F 0 = (FF 0) / 0 F, em que F representa a 0 pré-nicotina intensidade de fluorescência integrada corrigida-fundo e F é a intensidade de fluorescência integrada ao longo dos axónios vHipp em cada ponto temporal após a aplicação de nicotina. Analisar e traçar normalizada intensidade de fluorescência integrada.

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Representative Results

A preparação utilizada consiste de gene quimérico co-culturas de circuitos vHipp-NACC in vitro. Projeções que emanam microslices vHipp, como entrada axonal pré-sináptico, pode fazer contatos sinápticos com metas pós-sinápticos, os neurônios dispersos de NACC. A nicotina induziu um (≥ 30 min) facilitação sustentado de transmissão glutamatérgica de neurônios NACC inervados por vHipp axônios sinalização ao longo vHipp axônios 5 via α7 pré-sináptica * nAChRs 21 e prolongada de cálcio.

A Figura 1 demonstra directamente que as projecções dos micro-cortes vHipp são glutamatérgicos (VGLUT1 positivo) e que os contactos são feitos com dispersos GABAérgicos neurónios espinhosos médios do NACC (GAD positivo, figura 1C, D). Ambos α7 * e não α7 * nAChRs (incluindo α4 e subunidades α5) foram encontrados ao longo dos axônios vHipp (Figura 1E-G) e, especificamente, em locaisonde projeções vHipp contato com neurônios NACC. Deve notar-se que os neurónios dispersas de NACC não expressam nAChRs α7 * (Figura 1H); ou seja, os grupos de receptores em contatos são estritamente pré-sináptico (Figura 1I), também veja a Figura 1 em 5 de Referência.

Uma vez que os quiméricos co-culturas foram estabelecidas, imagens ao vivo de [Ca2 +] i e vesículas sinápticas fusão ao longo dos axónios vHipp com e / ou sem nicotina pode ser gravada por até 30 minutos, sem qualquer dano aparente para os neurônios.

Imagens representativas, filmes e quantificações de lapso de tempo para induzida por nicotina fluo-4 [Ca2 +] i sinalização ao longo de axônios vHipp são apresentados na Figura 2 e Suplementar Filme 1 e 2. Descobrimos que a ativação de vHipp nAChRs por nicotina induz sustentada Ca 2+ influxo axónios pré-sinápticos (Figura 2A, D). A fase sustentadade nicotina induziu aumentos em [Ca2 +] i de sinalização ao longo dos axónios vHipp foi bloqueada pelo α7 específica * nAChR antagonista αBgTx mas não pela não-α7 * nAChR antagonista DHβE (Figura 2A-C).

Visualização directa da actividade dependente de FM1-43 corante endocitose e a exocitose tem sido utilizada para monitorizar a libertação de neurotransmissores indirectamente pré-sináptico 23, 24. Aqui, imagens representativas e quantificação de fusão vesicular induzida por nicotina ao longo dos axónios vHipp visualizadas por FM1-43 são mostrados na figura 3 (Figura 3A, C). A presença de α7 pré-sináptica * nAChRs é necessária para a fusão das vesículas nicotina induzida máxima e a libertação de neurotransmissores (Figura 3B, C).

Figura 1
Figura 1. Synaptic co-cultura de vHipp com NACC permite examination de localização pré-sináptica dos nAChRs. (AC) desenhos esquemático de circuitos in vitro específicas de genótipo (C) preparado por plaqueamento em separado do hipocampo ventral / subiculum (A).   fatias de um indivíduo WT ou α7 - / - neurônios de rato e dispersos de WT núcleo accumbens (B). Aq, aqueduto (Sylvius); DG, giro denteado; MM, medial núcleo mamilar; PMCO, póstero núcleo cortical amígdala; rf, fissura rhinal, fmi, forceps menor do corpo caloso; VE, do ventrículo lateral; Tu, tubérculo olfativo; VP , pallidum ventral. microslices (D) vHipp estender VGLUT1 positivo (vermelho) projeções axonal que contatam GAD65 positivo (verde) neurônios NACC (setas brancas são exemplos desses sites de contacto). Barra de escala: 10 um (E.-G) Micrografias representativas dos axónios WT vHipp (coloração com VGLUT1, verde) são mostradas para α4 nAChR * (E), α5 * nAChR (F) e α7 superfície * nAChR (L) coloração em aglomerados vermelhos (setas brancas). Barra de escala:.. 5 um (H) Não há α7 superfície * aglomerados nAChR sobre neurónios GABAérgicos dispersos GAD65 (positivo) de NACC sozinho (I) Red "clusters" de superfície α7 * nAChR (setas brancas) pode ser visto em aqueles neurônios dispersos co-cultivados com microslices vHipp. Barra de escala:. 5 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Synaptic co-cultura de vHipp com NACC permite o exame do sinal de cálcio nicotina induzidaing junto axônios vHipp. (A) representativos fluo-4 imagens de cálcio ligado fluo-4 na escala de cores ao longo de uma pseudo axônio WT vHipp antes (Top), 1 '(Médio) e 30 "(Inferior) após a aplicação de nicotina. A fase contínua (30 ') da resposta de Ca 2+ induzida por nicotina é eliminado pela adição do α7 * antagonista selectiva do nAChR αBgTx (100 nM) (B), mas não por adição do não-α7 * nAChR antagonista selectivo DHβE (1 uM) (C). Barra de escala: 5 mm (D) trama Representante da normalizado fluo-4 intensidade de fluorescência integrada a partir de um axônio WT vHipp ao vivo perfundidos com nicotina (1 PM) durante 1 min.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Synaptic co-cultura de vHipp com NACC permite o exame de nicotina induziu a libertação de neurotransmissores vesicular (com FM1-43) ao longo de axônios vHipp. (A) Imagens representativas de axônios WT vHipp (carregados com FM1-43, verde) antes (superior) e depois (inferior) a aplicação de nicotina. (B) Imagens representativas de axônios WT vHipp (carregados com FM1-43, pré-tratados com α7 * nAChR antagonista selectivo αBgTx durante 15 min) antes (em cima) e após (em baixo) a aplicação de nicotina. Barra de escala:. 5 um (C) mostra a quantificação das alterações no axonal FM1-43 fluorescência (F diminuição) na sequência de tratamento com nicotina na ausência (WT) ou na presença (+ αBgTx WT) do α7 * antagonista do nAChR. favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mover 1
Filme Suplementar 1: Time-lapse imagens ao vivo de basal Fluo-4 / Ca 2+ fluorescência ao longo dos axónios vHipp.

As imagens de lapso de tempo de Fluo-4 / Ca2 + fluorescência ao longo dos axónios vHipp foram adquiridas com uma lente objectiva de 60x de água a cada 10 segundos durante 30 minutos com um microscópio confocal de disco giratório. Imagens adquiridas foram indicados na escala de cores pseudo e reproduzido como um filme em dois quadros por s. Este filme mostra a linha de base de Fluo-4 / Ca 2+ atividade de fluorescência ao longo viver WT vHipp axônio perfundidos com HBS cocktail.

Filme 2
Filme Suplementar 2: Time-lapse imagens ao vivo da nicotina induzida sustentada Fluo-4 / Ca 2+ fluorescência ao longo dos axónios vHipp.

As imagens de lapso de tempo de Fluo-4 / Ca2 + fluorescência ao longo dos axónios vHipp foram adquiridas com uma lente objectiva de 60x de água a cada 10 segundos durante 30 minutos com um microscópio confocal de disco giratório. Imagens adquiridas foram indicados na escala de cores pseudo e reproduzido como um filme em dois quadros por segundo. Este filme mostra nicotina (1 �, perfundidos em pelo ponto de tempo 43, lavadas com HBS cocktail no ponto de tempo de 49) induzida Fluo-4 / Ca 2+ atividade de fluorescência ao longo viver WT vHipp axônio. Aplicação de nicotina aumentou a / Ca intensidade fluo-4 2 + fluorescência ao longo dos axónios vHipp.

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Discussion

A preparação de co-cultura descrito re-circuitos do hipocampo ventral cede-accumbens in vitro. Esta análise permite preparação relativamente simples e de confiança dos perfis espaciais e temporais pelo qual a activação de nAChRs pré-sinápticos eliciar melhoradas transmissão glutamatérgica 5, 21.

Co-culturas são definidos como o crescimento de diferentes tipos de células específicas em um prato que pode proporcionar condições fisiológicas in vitro para demonstrar in vivo -like função. Convencionais neurônio-neurônio co-culturas foram introduzidas para pesquisa em neurociência para estudar as interações sinápticas entre diferentes tipos de células. No entanto, é difícil identificar o pré e pós-sinapses em locais de estas co-culturas. Este protocolo neurônio co-cultura dissociada-MicroSlice permite um fácil reconhecimento dos axônios pré-sinápticos e metas pós-sinápticos. Usando microslices de diferentes regiões do cérebro de of linha de ratinho transgénico expressando diferentes proteínas fluorescentes, este protocolo pode também ser usado para estudar as interacções axónio-de axónios.

O passo crítico deste neurónios dissociados-MicroSlice protocolo de co-cultura é proporcionar um ambiente estável para permitir a fixação dos explantes, a excrescência das projecções e a formação de sinapses. Plaqueamento das microslices num volume mínimo de meios de comunicação e manutenção das placas de cultura de compressas de gaze estéril umedecido são as duas principais etapas para fixação MicroSlice e formação de sinapses. A principal limitação deste protocolo co-cultura é que os neurônios NACC nem todos dispersas formam sinapses funcionais com axônios vHipp.

Ao alterar o genótipo dos componentes pré- e pós-sinápticos, esta preparação fornece uma abordagem informativo para estudar os mecanismos de pré- e pós-sinápticos de plasticidade sináptica. Três características distintas deste preparação tornam ideal para esses estudos. Cérebro regiões que estão normalmente ligados in vivo através de percursos de fibra que não pode ser mantida, ou são prontamente identificados em fatias agudas, podem ser combinadas nesta preparação in vitro. Pré e pós-sinápticos componentes vêm de diferentes ratos fazem permitindo alteração independente, quer do pré ou pós-sináptica genótipo. Por plaqueamento componentes pré- e pós-sinápticos em momentos diferentes, é possível expressar genes exógenos em selectivamente quer a pré- ou neurónios pós-sinápticos.

A nicotina induzida transientes de Ca2 + (em segundos a minutos gama) através da activação de nAChRs foram relatados em culturas de neurónios, astrócitos e em várias linhas de células que expressam nAChRs 25-27. No entanto, a maioria desses estudos não detectaram os efeitos a longo prazo (mais de 10 minutos) de exposição à nicotina curto espaço de tempo, em grande parte devido a danos foto durante a imagem a longo prazo. Usando o protocolo de cultura descrito acima e rápido giro de disco coleção da imagem confocal,nicotina induzida sinalização de Ca2 +, a fusão das vesículas sinápticas e liberação de glutamato pode ser gravado até 1 hora sem nenhum dano aparente para os neurônios (Filme suplementar 1, 2).

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

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References

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Neurociência Edição 100 nicotina receptor de acetilcolina nicotínico a imagem latente de cálcio os axônios pré-sinápticos a libertação de neurotransmissores a transmissão sináptica
Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons
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Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L.More

Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

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