Introduction
Devre uyarılabilirliğinin Kolinerjik modülasyon biliş temel yönlerine katkıda bulunur ve değişmiş kolinerjik modülasyonu Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık 1-4 olmak üzere nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların bir özelliğidir. CNS'de sinaptik iletim kolinerjik kolaylaştırılması kurulan bir mekanizma, ön-sinaptik olarak lokalize nAChR'lerin doğrudan aktivasyonu yoluyla olmaktadır. Dolaylı olarak bazı nAChR alt tipleri ve nispeten yüksek kalsiyum iletkenlik hem doğrudan, bağlı ile hücre içi sinyal iletim - bu pre-sinaptik reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi Ca + 2 ([Ca2 +] i) ön-sinaptik terminallerindeki sebep olur 5, bu şekilde nörotransmitter salgılanmasını zenginleştirmek. Aslında, pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyonu da dahil olmak üzere, glutamat nörotransmitterlerin çok çeşitli GABA, ACh, serbest değişikliklerle bağlantılı olan birnd dopamin 6-10. Bu işlem, dolaylı, çeşitli sinapslarda elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenmiştir, ancak optik habercilerin [Ca2 +] i ve sinaptik vezikül dönüştürme pre-sinaptik olayların daha doğrudan ve zamansal olarak hassas ölçümü sağlar.
NAChR'lerin pre-sinaptik lokalizasyon elektron mikroskobik (EM) düzeyinde 11,12 olarak nAChR'lerin doğrudan bağışıklık altın etiketleme ile ikna edici kanıtlanmıştır. Birkaç diğer teknikler de kültürlü nöronlar 13,14 nAChRs subunit- floresan protein kimeralar yerleri tespit da dahil olmak üzere, dolaylı nAChR yerelleştirme hitap için kullanılır olmuştur, sinaptik terminallerde 15,16 yılında nAChR akımların elektrofizyolojik kayıt, [içinde Ca nikotin kaynaklı değişiklikleri izleme sinaptik terminalinde canlı hücre görüntüleme 17 ve nörotransmitter salınımı dolaylı izlenmesi sinaptik sinir terminallerinde 2 +] istiril amfipatik FM boyalar (FM1-43 ve FM4-64) ve / veya synapto-pHluorin ve bu tür glutamat ACH ve iGluSnFr için CNiFERs gibi özel flüoresan nörotransmiter muhabir, tarafından izlendi sinaptik veziküllerin ekzositozu de dahil olmak üzere, floresan göstergesi olan canlı hücre görüntüleme teknikleri 18-20. Genel olarak, nAChR'lerin pre-sinaptik localisation belirlenmesi için, bu mevcut yaklaşımlar karmaşıktır ve güvenilir bir kimlik ve pre-sinaptik aktivitenin fizyolojik izleme sağlamak için özel bir sistem ve teknikler gerektirir.
Belirlemek ve sinaptik iletim öncesi ve post-sinaptik bileşenleri hem de analiz doğrudan erişim sağlayan nükleus akumbens (NACC) devre - Burada bir ventral hipokampal (vHipp) in vitro ko-kültür sistemi protokolleri ve ekipmanlar açıklar. Biz pre-sinaptik nAChR'lerin lokalizasyonu ve Ca 2 + sinyalizasyon ve nörotransmitter bırakma alo aracılı nAChR'nin canlı hücre görüntüleme örneklerini göstermektedirng vHipp aksonlar. Burada sunulan protokol doğal (ve basit) uzantısı farklı genotipleri gelen nöronların oluşan öncesi ve post-sinaptik temasların hazırlanmasıdır. Bu şekilde, modülasyon öncesi ve / veya post-sinaptik mekanizma belirli bir gen ürününün katkı, doğrudan tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri (2012 revize NIH Yayınları No. 80-23) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca yürütüldü ve çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Stony Araştırma Komiteleri için kullanın edildi Brook Üniversitesi (# 1618 ve # 1792).
1. vHipp-NACC Sinaptik Co-kültürler
- Kurban fareleri (doğum sonrası gün 0 - vahşi tip (WT) ya da α7 nAChRs transgenik fare hattı 3) CO2 ile. Her yavru başını kesmek ve post facto genotipleme için 1,5 ml santrifüj tüpüne kuyruk kaydedin. Steril kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.
- Tüm beyin ortaya çıkarmak için makas ve forseps ile kafatası üst çıkarın. Birbirini kaudalde serebral korteks bölümü, bir mikroskop altında vHipp 5,21 olmak üzere arka korteks içeren bir koronal bölümü elde noktada başlatılıyor.
- V teşrihGelişmekte olan bir fare beyin atlası 22 (Şekil 1A) göre CA1-subiculum bölgesini dışarı içeren Hipp doku şeritleri. Soğuk kültür ortamı (4 ° C) içeren 35 mm kültür çanak transfer, küçük ince dilim (um 100 civarında × 100 mikron microslices) oyulmuş.
- 37 ° C'de inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca kültür ortamı (~ 500 ul) ile 24 oyuklu doku kültürü plakaları içindeki 12 mm poli-D-lisin / laminin ile kaplanmış cam lamelleri önceden inkübe edin. Microslices kaplama önce ortamı çıkarın.
- (Microslices arasında ~ 20 parçalarını içeren ~ 50 ul) ortam az miktarda lamel merkezi bir ateş cilalı Pastör pipeti ile Plaka eksplant bağlanmasını kolaylaştırmak için. Tek bir hayvandan kaynaklanan Plaka vHipp microslices (ya + / + veya - / - transgenik α7 hattının genotip) her lamel.
- Eksplantlar lamel üzerine yerleşmek sonra, yavaşça th ek medya (~ 100 ul) ekleyinE duvar böylece medyanın düzeyi değil, bu lamel merkezinde, tamamen çevre üzerinde eksplantlar karşılamak için yeterince yüksek.
- 37 ° C de bir O / N inkübasyondan sonra,% 5 CO2 kuluçka makinesi, doğum sonrası gün 1 ila farelerde embriyonik gün 18'den NACC nöronlar dağılması ve eksplantlar ekleyin.
- Gelişmekte olan bir fare beyin atlas 20 (Şekil 1B) göre NACC dokuları dışarı parçalara ayır.
- 15 ml tüp ve transfer (500 500 mikron microslices × um civarında) küçük parçalar halinde kesin.
- 37 ° C'de 15 dakika boyunca% 0.25 tripsin (2 mi) ile tedavi edin. Yıkama doku parçaları soğuk yıkama ortamı ile üç kez (5 mi, 4 ° C) soğuk bir kültür ortamı içinde bir yıkama, ardından (5 mi, 4 ° C). Süspansiyon her yıkama aşamasında 5 dakika dinlenmeye ve sonra dikkatlice süpernatant dökmek için izin verin.
- Hafif ateş cilalı Pastör pipeti ile kültür ortamı 2 ml dikkatlice toz haline getirilerek hücreleri ayırmak.
- Trans5 dakika boyunca 2,000 x rpm'de bir 15 ml tüp ve santrifüj ferin hücre süspansiyonu. Süpernatantı ve 6 yavrular başına 1 ml kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. Yumuşak bir ateş cilalı Pastör pipeti ile ortam birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtılır.
- VHipp eksplant ile her bir lamel dağılmış NACC hücrelerinin 0.25 ml ilave edilir.
- Nemlendirilmiş bir 37 ° C kültürleri bakımı,% 5 CO2 kuluçka. Mekanik sinaps oluşumunu kolaylaştıran, stabilize ve nemi muhafaza etmek nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine kültür tabak yerleştirin.
2. İmmünositokimya
- Kültürleri saptamak -% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz (5 in vitro 7 gün) / PBS (~ lamel 500 ul, 20 dakika, RT).
- % 0.25 Triton X-100 / PBS ile Permeabilize kültürler (~ lamel 500 ul, 5 dakika, RT).
- PBS içinde% 10 normal eşek serumu ile blok kültürleri (~ lamel 500 ul, 30 dakika, RT) Antibod öncesindeY boyama. 4 ° C 'de O / N primer antikorlar ile inkübe edin. Anti-veziküler glutamat taşıyıcı 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100):;: Anti-nAChRs (anti-α 5 alt birimleri, 1 500 500 α 4 -ECD 1:) Aşağıdaki primer antikorlar kullanın.
- (Lamel haftada 3 kez / ~ 500 ul, 5 dakika) PBS ile primer antikor yıkayın ve daha sonra (~ lamel 500 ul, 1: 500), Alexa 488 konjüge edilmiş sekonder antikor kültürleri inkübe ya lamel ortalama Alexa 594 (~ 500 ul , 1: 37 ° C'de 1 saat süre ile 500).
- Önceden etiketlenmesi yüzeyi α7 * nAChR'lerin için tespit için 37 ° C'de 45 dakika boyunca (kültür ortamı 1000 ~ lamel 500 ul, 1) Alexa 594 konjüge αBgTx kültürleri inkübe edin.
- Dağı ve mühür lamelleri.
- Plan-Apochromat hedefleri (0.8 NA veya 1.4 NA ile 63X yağ ile 20X) ile donatılmış bir floresan mikroskop ve CCD kamera ile görüntüleri yakalayın.
3. FM1-43 Tabanlı Veziküler Fusion
- Bir görüntüleme odasında - (in vitro 7 gün 5) Disk konfokal mikroskop iplik üzerine odasına monte kültürleri korumak. Sürekli oda sıcaklığında HBS kokteyli ile (1 mi / dak) perfüze.
- 90 sn için 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) (boyama) içinde 10 uM FM1-43 perfüzyon ve yük kültürleri dur, Ca2 + ADVASEP-7 (0.1 mM) ihtiva eden serbest HBS ile birlikte 15 dakika boyunca uzaklıkta dış boyayı zara bağlı FM1-43 temizlemek için.
- 120 saniye FM1-43 olmadan 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) (destaining) ile kültürleri teşvik aynı koşullar kullanılarak FM1-43 ile kültürleri yeniden ve Ca ile tekrar içeren 2+ ücretsiz HBS yıkama ADVASEP-7 için 15 dk.
- CCD kamera ile Plan-Apochromat objektif (1.4 NA ile 60X su, uyarma 488 nm, emisyon 530 nm) ve yakalama görüntüleri ile donatılmış iplik diski konfokal mikroskop ile FM1-43 floresan görüntüler elde.
- 1 dakika boyunca bazal FM1-43 floresan görüntüleri (her 2 sn toplayın) Önceden nikotin kontrol olarak; 1 dakika boyunca hızlı bir perfüzyon (2 ml / dakika) ile nikotin (1 uM) uygulanır, ve daha sonra HBS kokteyli ile nikotin yıkayın. 5 dakika boyunca her 2 saniyede sırasında ve nikotin uygulamadan sonra, daha önce yakalama time-lapse görüntüleri tutun.
- Önce FM1-43 floresan (F boyama) ve sonrası (F destaining) her sinaptik bouton de nikotin uygulamasını ölçmek.
- Öncesi ve nikotin uygulaması (mesafe kadar taşınmış = F boyama -F destaining) sonra FM1-43 floresan yoğunluğu farkını miktarının tarafından vHipp akson boyunca salınabilir FM1-43 floresan toplam miktarını hesaplayın. Aşağıdaki denklemle nikotin sonra floresan yoğunluğu azalma kısmını analiz: F azalma% = mesafe kadar taşınmış / F boyama.
4. Kalsiyum Görüntüleme
- Daha sonra (5 mcM Fluo-4 Ca 2 + göstergesi ile kültürleri yük normal HBS hızla - (in vitro 7 gün 5) kültürleri durulayınAM ester) ve 37 ° C de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 boyunca HBS'de% 0.02 Pluronic F-127 (2 mi) eklendi.
- (3 kez / 5 dk) HBS ile Flu-4 çözüm yıkayın. (37 ° C /% 5 CO2), en azından 30 dakika boyunca kuluçka kültürler dönün.
- Aynı görüntüleme odası ve FM1-43 göre veziküler füzyon bölümünde tarif edildiği gibi aynı şartlarda kültürleri muhafaza (adım 3.1).
- Bir Plan-Apochromat objektif (1.4 NA ile 60X su, uyarma 488 nm, emisyon 530 nm) ve bir CCD kamera ile vHipp mikro dilim aksonal projeksiyonlar Fluo-4 floresan görüntüleri toplayın.
- 1 dakika boyunca hızlı bir perfüzyon (2 ml / dakika) ile nikotin (1 uM) uygulanır, ön-nikotin kontrol olarak temel Fluo-4 floresans görüntüleri (2 dakika süre ile, her 10 saniye) toplamak, ve daha sonra HBS kokteyli ile nikotin yıkayın. 30 dakika boyunca her 10 saniyede sırasında ve nikotin uygulamadan sonra, daha önce yakalama time-lapse görüntüleri tutun.
- Bir dizi olarak ham fluo-4 floresan görüntüler, ihracat tüm kareleri kaydetDaha fazla analiz için TIFF formatında görüntüler.
- Önce vHipp akson boyunca ve nikotin uygulamadan sonra fluo-4 floresan entegre yoğunluğu toplayın.
- Aşağıdaki denklem ile entegre bir floresan Normalize: kadar taşınmış / F = 0 (FF 0) / F 0 artalan-düzeltilmiş önceden nikotin entegre floresans şiddetidir ve F'den her biri bir zaman noktasında vHipp akson boyunca entegre floresan yoğunluğu F 0, Nikotin uygulaması sonrası. Analiz ve normalize entegre floresan arsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
kullanılan preparat, in vitro olarak vHipp-NACC devreler gen, kimerik ko-kültürler oluşur. VHipp microslices kaynaklanan Projeksiyonlar, pre-sinaptik akson girdi olarak, post-sinaptik hedefler NACC dağılmış nöronlar ile sinaptik kişileri yapabilirsiniz. VHipp tarafından innerve NACC nöronlardan glutamaterjik iletimin bir sürekli (≥ 30 dk) kolaylaştırma kaynaklı nikotin pre-sinaptik α7 * nAChRs aracılığıyla vHipp aksonlar 5 boyunca sinyal 21 ve uzamış kalsiyum aksonları.
Şekil 1 vHipp mikro dilim projeksiyonlar (vGluT1 pozitif) glutamaterjik olduğunu ve doğrudan temas gösteriyor NACC gelen dağınık GABAerjik orta dikenli nöronlar ile yapılır ki (YAB pozitif, Şekil 1C, D). (Α4 ve α5 alt birimlerinin dahil) α7 * ve non-α7 Hem * nAChR'ler sitelerinde özellikle vHipp akson (Şekil 1E-G) ve birlikte bulundunerede vHipp projeksiyonları NACC nöronlar başvurun. Bu NACC gelen dağınık nöronlar α7 * nAChRs (Şekil 1H) ifade etmeyen dikkat edilmelidir; yani kişiler de reseptör kümeleri kesinlikle (Şekil 1I) presinaptik olan da Referans 5 Şekil 1.
Kimerik ko-kültürler tespit edildikten sonra, canlı görüntü [Ca2 +] i ve sinaptik ve / veya nikotin nöronlar için herhangi bir belirgin bir zarar vermeden en fazla 30 dakika için kaydedilebilir olmayan vHipp aksonları boyunca füzyon vezikül.
Örnek görüntüler, nikotin kaynaklı fluo-4 [Ca2 +] i vHipp aksonları boyunca sinyal için zaman atlamalı film ve sayımsal Şekil 2 ve Ek film 1 ve 2'de gösterilmiştir. Nikotin indükler göre vHipp nAChR aktivasyonunun Ca sürekli mu pre-sinaptik aksonlar halinde 2 + akışı (Şekil 2A, d). sürekli faz[Ca2 +] i vHipp aksonları boyunca sinyal nikotin kaynaklı artışlara spesifik α7 * nAChR antagonisti αBgTx ancak olmayan α7 * nAChR antagonisti DHβE (Şekil 2A-C) ile bloke edildi.
Aktivite bağımlı FM1-43 boya endositoz ve ekzositoz Doğrudan görselleştirme dolaylı presinaptik nörotransmitter salınımını 23, 24 izlemek için kullanılır olmuştur. Burada FM1-43 tarafından görüntülendi vHipp aksonlar boyunca nikotin kaynaklı veziküler füzyon için temsili resimler ve miktar Şekil gösterilmiştir 3 (Şekil 3A, C). pre-sinaptik α7 varlığı * nAChR'ler maksimal nikotin kaynaklı vezikül füzyon ve nörotransmiter serbest bırakın (Şekil 3B, C) için gereklidir.
NACC ile vHipp Şekil 1. Sinaptik ko-kültür sınavı değerlendirmenin sağlarnAChR pre-sinaptik lokalizasyon n. (AC) ventral hipokampüs / subiculum (A) 'nın ayrı bir kaplama ile hazırlanabilir genotip-özgü in vitro devreleri (C)' nin şematik çizgi. / - - bireysel WT veya α7 gelen dilimleri WT çekirdekten fare ve dağınık nöronların (B) akkumbens. Aq, su kemeri (Sylvius); DG, dentat girus; MM, medial mememsi çekirdek; PMCo, posteromedial kortikal amigdaloid çekirdek, rf, rhinal fissür, ATK, korpus kallosum küçük forseps, LV, yan ventrikül; Tu, koku tüberkül; VP ventral pallidum. (D) vHipp microslices GAD65 pozitif (yeşil) ile irtibata vGluT1 pozitif (kırmızı) aksonal projeksiyonlar NACC nöronlar (beyaz oklar bu iletişim siteleri örnekleridir) uzanır. Ölçek çubuğu: 10 mikron (E.-G)), Yeşil vGluT1 olan WT vHipp akson Örnek mikrograflan (boyama α4 için gösterilmiştir * nAChR (E), α5 * nAChR (F) ve bir yüzey α7 * kırmızı kümeleri (beyaz oklar) nAChR (G) boyama. Ölçek çubuğu.:. 5 mikron (H) hiçbir yüzey α7 yalnız NACC dağılmış GABAerjik nöronların üzerinde * nAChR kümeleri (GAD65 pozitif) vardır yüzey α7 * nAChR (beyaz oklar) (I) Kırmızı "kümeler" Bu görülebilir dağılmış nöronlar ortak-kültürlenir vHipp microslices ile. Ölçek çubuğu:. 5 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NACC ile vHipp Şekil 2. Sinaptik ko-kültür nikotin kaynaklı kalsiyum sinyal muayene izin verirvHipp aksonları boyunca ing. Kalsiyum (A) Temsilcisi fluo-4 görüntüleri WT vHipp akson önce (Üst), 1 boyunca Flu-4 sahte renk skalasında bağlı '(Orta) ve 30' nikotin uygulamadan sonra (Alt). nikotin kaynaklı Ca2 + cevabının sürekli fazı (30 '), α7 eklenmesiyle ortadan * nAChR seçici antagonisti αBgTx (100 nM) ile (B) fakat olmayan α7 * nAChR seçici antagonist DHβE eklenmesiyle (1 uM) (C). Ölçek çubuğu: 5 mikron 1 dakika boyunca nikotin (1 uM) ile perfüze canlı WT vHipp akson gelen normalize fluo-4 entegre floresan yoğunluğu (D) Temsilcisi arsa.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NACC ile vHipp Şekil 3. Synaptic ko-kültür vHipp akson boyunca (FM1-43) ile nikotin kaynaklı veziküler nörotransmitter salınımı incelenmesine olanak tanır. (A) önce (en üst) ve (alt) nikotin uygulamadan sonra (FM1-43, yeşil yüklü) WT vHipp akson Örnek görüntüler. (B) FM1-43 yüklü WT vHipp akson Örnek görüntüleri (, α7 ile önceden tedavi * (üst) ve sonra (en alt) nikotin uygulama öncesi nAChR seçici bir antagonist, 15 dakika boyunca αBgTx). Ölçek çubuğu.:. 5 mikron (C) nikotin yokluğunda tedavi (WT) ya da α7 ait * nAChR antagonisti varlığı (WT + αBgTx) Aşağıdaki akson FM1-43 floresan (F azalış) değişikliklerin ölçümü gösterir tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Ek Film 1: vHipp akson boyunca bazal Flu-4 / Ca 2+ floresan Time-lapse canlı görüntüleme.
vHipp aksonları boyunca Fluo-4 / Ca2 + floresan zaman atlamalı görüntüler dönen bir disk konfokal mikroskop ile 30 dakika boyunca bir 60x objektif su lens ile her 10 saniye elde edildi. Edinsel görüntüleri sözde renk skalası üzerinde belirtilen ve s başına 2 kare bir film olarak oynatılan bulundu. Bu film boyunca HBS kokteyl ile perfüze WT vHipp akson canlı Flu-4 / Ca 2+ floresan aktivitesinin taban çizgisini gösterir.
Ek Movie 2: kaynaklı nikotin Time-lapse canlı görüntüleme fluo-4 / Ca 2+ sürekli vHipp akson boyunca floresan> kadar.
vHipp aksonları boyunca Fluo-4 / Ca2 + floresan zaman atlamalı görüntüler dönen bir disk konfokal mikroskop ile 30 dakika boyunca bir 60x objektif su lens ile her 10 saniye elde edildi. Edinsel görüntüleri sözde renk skalası üzerinde belirtilen ve saniyede 2 kare bir film olarak oynatılan bulundu. Bu film nikotin gösterir (zaman noktasında 43 at perfüze 1 uM, zaman noktasında 49'da HBS kokteyl ile yıkanmış) boyunca WT vHipp akson canlı Flu-4 / Ca 2+ floresan faaliyetine neden. Nikotin uygulama vHipp aksonlar boyunca fluo-4 / Ca 2+ floresan arttı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ko-kültür hazırlanması açıklanan yeniden taahhüt eder in vitro ventral hipokampal-accumbens devreleri. pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyon glutamaterjik iletimi 5, 21 gelişmiş ortaya çıkaran hangi mekansal ve zamansal profillerin Bu preparat izin oldukça basit ve güvenilir bir sınav.
Co-kültürlerinde in vivo benzeri işlev göstermek için, in vitro olarak fizyolojik koşulları sağlayan bir çanak içinde farklı spesifik hücre tiplerinin büyümesi olarak tanımlanır. Konvansiyonel nöron nöron ko-kültürler, farklı hücre tipleri arasında sinaptik etkileşimleri incelemek için nörolojik araştırma tanıtıldı oylandı. Ancak, öncesi ve bu ko-kültürlerinde sinaps sonrası siteleri belirlemek zordur. Bu microslice-ayrışmış nöron ko-kültür protokolü pre-sinaptik akson ve post-sinaptik hedeflerin kolay tanınmasını izin verir. Beynin farklı bölgelerinden kullanma microslices ofarklı floresan proteinleri eksprese eden ön transgenik fare hattı, bu protokol, aynı zamanda akson-akson etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir.
Bu microslice-ayrışmış nöronlar ko-kültür protokolünün kritik aşama eksplant eki için izin vermek için istikrarlı bir ortam sağlayan, projeksiyonların akıbet ve sinaps oluşumu. Medya minimal hacimde microslices Kaplama ve nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine kültür plakaları muhafaza microslice eki ve sinaps oluşumu için iki önemli adımlardır. Bu ko-kültür protokolünün ana sınırlama tüm dağılmış değil NACC nöronlar vHipp akson ile fonksiyonel sinaps oluşturur olmasıdır.
Öncesi ve sonrası sinaptik bileşenlerin genotip değiştirerek, bu hazırlık sinaptik plastisite öncesi ve post-sinaptik mekanizmaları incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar. Bu hazırlık üç farklı özellikleri bu çalışmalar için ideal hale getirmektedir. Beyin rgenellikle muhafaza, ya da hali hazırda, akut dilim tespit edilemez lif yolları aracılığıyla in vivo olarak bağlanır egions Bu in vitro bir preparasyonda kombine edilebilir. Öncesi ve post-sinaptik bileşenler öncesi ya da post-sinaptik genotip ya bağımsız değişiklik sağlayan farklı farelerden alınan yapmak geliyor. Farklı zamanlarda öncesi ve post-sinaptik bileşenler kaplama ile, seçici öncesi ya da post-sinaptik nöron ya dışsal genleri ifade etmek mümkündür.
Nikotin kültürlenmiş nöronlar, astrositler bildirilmiştir nAChR'lerin aktivasyonu ve nAChRs 25-27 ifade çeşitli hücre hatlarında (dakika aralığına saniye olarak) Ca + 2 geçişlerini uyardı. Ancak bu çalışmaların çoğu uzun vadeli etkileri uzun süreli görüntüleme sırasında fotoğraf hasar nedeniyle büyük ölçüde kısa zaman nikotin maruziyeti (10 dakika boyunca) tespit etmedi. Ve hızlı iplik disk konfokal resim koleksiyonu yukarıda açıklanan kültür protokolü kullanılarak,nikotin kaynaklı Ca 2 + sinyalizasyon, sinaptik vezikül füzyon ve glutamat salma nöronlara görünürde herhangi bir zarar vermeden kadar 1 saat kaydedilebilir (Ek Film 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
