Summary
activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l'âge.
Abstract
Microglie, qui sont des cellules neuro SNC-résidents, transforment leur morphologie et la taille en réponse aux dommages CNS, le passage à un état activé avec des fonctions distinctes et les profils d'expression génique. Les rôles de l'activation de la microglie dans la santé, les blessures et la maladie restent encore mal compris en raison de leur régulation dynamique et complexe en réponse à des changements dans leur microenvironnement. Il est donc essentiel de surveiller de manière non invasive et analyser des changements dans l'activation microgliale au fil du temps dans l'organisme intact. Des études in vivo de l'activation de la microglie ont été retardés par des limitations techniques de suivi du comportement des microglies sans altérer l'environnement CNS. Cela a été particulièrement difficile pendant la neurodégénérescence chronique, où les changements à long terme doivent être suivis. La rétine, un organe CNS prêtent à l'imagerie en direct non-invasive, offre un puissant système de visualiser et de caractériser la dynamique de l'activation de la microglie lors de troubles chroniques.
l'imagerie in vivo de la rétine de la microglie, en utilisant ophtalmoscopie confocale (ALSC) et souris / + rapporteurs CX3CR1 GFP, de visualiser la microglie avec une résolution cellulaire. Aussi, nous décrivons des méthodes pour quantifier les changements mensuels dans l'activation des cellules et de la densité dans les grands sous-ensembles de cellules (200-300 cellules par la rétine). Nous confirmons l'utilisation de la zone de autosomique une mesure utile pour le suivi en direct de l'activation de la microglie dans la rétine en appliquant automatisé analyse morphométrique basé sur un seuil d'images in vivo. Nous utilisons ces acquisition d'images en direct et des analyses des stratégies pour surveiller les changements dynamiques dans l'activation de la microglie et microgliose durant les premiers stades de la neurodégénérescence rétinienne dans un modèle de souris du glaucome chronique. Cette approche devrait être utile pour enquêter sur les contributions de la microglie à baisse neuronale et axonale dans les troubles chroniques du système nerveux central qui affectent la rétine et du nerf optique.
Introduction
Ces cellules microgliales neuroimmunes qui résident exclusivement dans le système nerveux central (SNC), depuis le développement embryonnaire précoce et tout au long de l'âge adulte. Equipé d'un répertoire complexe de récepteurs, l'activité de la microglie et l'hétérogénéité régionale sont régies par leur interaction bidirectionnelle avec les neurones voisins, gliales, barrière hémato-encéphalique et infiltrant les cellules neuro-inflammatoires 1,2. Fonctions microgliales basales contribuent à l'entretien et la réparation physiologique, comme ils échantillonnent leur territoire pour des perturbations de l'homéostasie 3,4. Pendant une lésion du SNC ou de la maladie, les microglies sont les premiers intervenants à des signaux neuronaux qui déclenchent alors leur transition vers un phénotype réactif, appelé "activé microglie 2,5-7. l'activation de la microglie implique un cycle complexe de gènes et expression de la protéine, qui sont couplés à soma des cellules et processus de redimensionnement et le remodelage 6-9. activation de cellules microgliales, ainsi que la redistribution de la cellule etclustering, peut être accompagnée de l'augmentation globale locale dans le nombre de cellules (de microgliose appelé). Cela peut résulter de la prolifération cellulaire et l'auto-renouvellement, avec ou sans le recrutement de monocytes dérivés du sang 3,4,7,10-14. Dans un large éventail de maladies du SNC, chroniques dépendant de l'âge, soutenue microgliose et l'activation de la microglie maladie parallèle progression 15-19. Comment microglie l'impact neurodégénérescence reste incertaine, principalement parce qu'ils jouent deux rôles neuroprotecteurs et délétères qui peuvent avoir diverses contributions à l'apparition et la progression de la maladie. Études d'imagerie en direct visant à comprendre la maladie chronique du système nerveux central ont surveillé le comportement de la microglie dans le SNC endommagé des modèles animaux et des humains, et a démontré que des altérations microgliales sont début détectable à des stades précoces de la maladie 15-17,19,20. Ainsi, il est essentiel de développer des approches pour détecter et surveiller l'activation des microglies in vivo.
Dete non-invasivection des changements régionaux dans l'activation des microglies du cerveau a été créé comme un indicateur important dans vivo de progression de la maladie neurodégénérative, en utilisant l'imagerie moléculaire ou bioluminescence et la tomographie par émission de positons ou imagerie par résonance magnétique 18,21,22. Ces méthodes d'imagerie moléculaire et nucléaire hautement quantitatives et non invasives détectent gliose avec une résolution régionale. Alternativement, deux photons imagerie confocale en CX3CR1 GFP / + souris a permis l'observation de la microglie du cerveau avec une résolution cellulaire 3,4,9,20,23-28. Cependant, cette approche limite à long terme et l'observation répétée d'altérations microgliales chroniques, étant donné le risque potentiel de perturber leur comportement par des procédures d'imagerie cérébrale, même minimalement invasives 29. Alternativement, la rétine offre des conditions optimales pour la visualisation directe, dans vivo et la surveillance répétée de la microglie dans leur niche CNS intact tout au long vieillissement, suite à une blessure aiguë, etpotentiellement au cours de maladies neurodégénératives chroniques. Ainsi, des études récentes ont prouvé la faisabilité d'imagerie à haute résolution de la microglie rétiniennes exprimant la GFP en adaptant la ophtalmoscopie confocale à balayage laser (ALSC) à l'image en direct CX3CR1 GFP de souris / +. Cela a été utilisé pour suivre les variations hebdomadaires GFP + cellulaires numéros dans les souris individuelles pour un maximum de 10 semaines après une lésion aiguë induite ou d'hypertension oculaire 30-36.
Nous avons étendu cette approche pour réaliser une imagerie à long terme sur plusieurs mois, et de suivre quantitativement les changements dans l'activation de la microglie basés sur la taille de soma en utilisant une analyse morphométrique. Somal taille a été définie comme une mesure utile de l'activation de la microglie dans les études d'imagerie en direct à deux photons en utilisant la microscopie confocale en tranches corticales pour effectuer l'imagerie in vivo de CX3CR1-GFP + 9 microglie. Ces et d'autres études ont également démontré la corrélation entre la taille de autosomique et les niveaux d'expression de la protéine Iba1, which augmente également avec l'activation 9,37. Ainsi, la microglie activée peut être identifiée dans des souris vivantes, et leur nombre et leur répartition contrôlée dans le temps au cours de la santé et de la maladie du SNC.
Ce protocole décrit des méthodes pour ALSC acquisition d'images en direct et d'analyse pour surveiller le nombre de cellules microgliales, la distribution et l'activation morphologique au cours cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) de la dégénérescence (Figure 1). Ainsi, cette étude utilise: 1) un modèle de souris du glaucome héréditaire (DBA / 2J) qui subit dépend de l'âge du nerf optique et de la neurodégénérescence rétinienne et présente une variabilité remarquable progression de la maladie entre 5 et 10 mois de 38,39 ans, 2) mois ALSC imagerie in vivo pour la visualisation à long terme de cellules GFP + dans la rétine et du nerf optique non myélinisées de hétérozygotes CX3CR1 GFP / + DBA / 2J souris âgées de 3 à 5 mois, 3) en temps réel une analyse de formation d'image par segmentation et d'un seuil pour isoler des corps cellulaires des cellules et mesure lazone ir. Ces stratégies sont appliquées pour évaluer la cinétique de états d'activation de la microglie rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique.
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Protocol
Imagerie in vivo est effectuée dans des installations exemptes d'agents pathogènes en utilisant des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de l'Utah.
Remarque: Ce protocole d'imagerie est utilisé pour des souris rapporteurs dans lequel la microglie rétiniennes et les monocytes / macrophages infiltrants expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du locus du récepteur de la fractalkine (CX3CR1).
1. imagerie in vivo de la rétine GFP + microglie par microscopie confocale à balayage laser ophtalmologique (ALSC)
- Allumez le système de chauffage contrôlé par l'eau, mettre à stabiliser la température de la souris entre 35-37 ºC durant la procédure, et de connecter deux coussins chauffants.
- Démarrer le système confocal ophtalmoscope laser à balayage (ALSC) (figure 2A). Ouvrez le programme d'ALSC, entrez les informations qui permettra d'identifier la souris individuelle et en une courbure cornéenne de 2 mm (menu Données du patient).
- Préparez-vous à imaGing. Adapter en toute sécurité un grand champ 55º lentille propre objectif sur son socket. Préparer la plate-forme d'imagerie de ophtalmoscope en obtenant un coussin chauffant recouvert de papier propre. Utilisez des pinces pour aplatir le tampon et le papier et les empêcher de bloquer le mouvement de l'objectif.
- Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 1,3% de 2,2,2-tribromoéthanol et 0,8% d'alcool tert-amylique (250 mg / kg de poids corporel; 0,5 ml / 25 g de poids corporel) en utilisant une aiguille G 30½ monté sur un 1 ml à usage unique seringue. Souris revenir à sa cage, gardé sur un coussin chauffant.
NOTE: La livraison de l'anesthésie par injection contre l'inhalation permet un positionnement plus facile de la souris pour l'imagerie et un libre accès pour les yeux, libre de cônes de nez et les tubes. - Une fois l'animal arrête de bouger et ne répond pas au pincement de la queue, de provoquer la dilatation des pupilles avec Tropicamide et la phényléphrine (0,5% chacun), en positionnant l'animal couché et couvrant à la fois les yeux avec des gouttes pour 7 min.
- Après 5 min, placer la souris sujettes au centre de la plate-forme de ophtalmoscope, et lentilles de contact ajustement sur les deux yeux, en appliquant une pression minimale.
NOTE: Les lentilles de contact sont petites et fragiles, mais peuvent être manipulés avec soin avec les doigts, bien forceps peuvent être utilisés à la place 40. L'utilisation de lentilles de contact est facultative, mais recommandée, car elle minimise la sécheresse oculaire et préserve la transparence de la cornée lors de l'imagerie. - Après 7 minutes, orienter la souris avec l'œil droit face à l'objectif et l'orbite parallèle à la lentille de l'objectif, en gardant l'animal effrénée près du bord de la plate-forme (figure 2B). Pour récupérer des images de la saturation et de l'orientation comparable, de maintenir constamment la distance de l'œil à lentille d'objectif, ainsi que l'alignement de l'œil à la trajectoire de la lumière tout au long de sessions d'imagerie. Clips longues moustaches interférant avec l'observation de l'œil.
NOTE: Pour la prochaine 8-10 min, la souris ne se déplace pas ou clignote, et la volonté souffle avec mouvement doucements, qui sont suivis par l'ALSC Eye Tracking ART mode (automatique en temps réel), qui ajuste la position de la tête de balayage sur la base de points de repère du fond d'œil avec un contraste élevé. Passé ce moment-là, les souris commencent à clignoter et haletant, faisant imagerie impraticable. - Si l'imagerie est réalisée sans utiliser des lentilles de contact, appliquer PBS tombe à deux yeux tous les 2-3 min pour les empêcher de sécher.
- Récupérer une image de fond de la vascularisation de la rétine et de la papille optique, axée sur la rétine interne.
- Sélectionnez le mode infrarouge (IR) et ajuster les paramètres à 820 nm excitation, 100% de la puissance laser, 40-60% de sensibilité (figure 2C).
- Travailler en mode haute vitesse (12,6 images / sec), de localiser l'œil en utilisant le joystick pour conduire l'ophtalmoscope. A faible grossissement, inspecter la cornée et le cristallin de blessure ou de l'opacité, et exclure des yeux de l'étude avec des défauts ou des blessures qui affecteront l'imagerie de la rétine (figure 3A).
- Localisez la zone de disque optique (la surface dela tête du nerf optique, ONH) en rapprochant l'œil de l'objectif, puis centrer l'image sur elle et verrouiller cette position par vissage de la manette. Cet alignement de l'œil à l'ophtalmoscope est la clé pour obtenir même se concentrer et d'émission à travers l'image.
- Visualiser les plans intérieurs de la rétine, ainsi que la ONH, en utilisant les principaux vaisseaux sanguins situés sur la surface vitréenne de la rétine comme un plan de référence central (59 et 60 D), ou plus profond (55 D) dans les yeux montrant optique excavé les disques. La mise au point optimale devrait résoudre les cellules sanguines circulantes dans les principaux vaisseaux sanguins, avec leur lumière et les murs bien distinctes.
- Optimiser saturation de l'image en ajustant la molette sur le panneau de contrôle à écran tactile, jusqu'à un halo blanc d'éclairage uniforme couvre dans la plupart du champ 55º de fond autour du disque optique (à l'aide légère surexposition). Ensuite, abaisser la saturation pour optimiser le contraste jusqu'à ce que les cellules sanguines se déplacent le long des grands navires peuvent être clairement résolus. Si sombre focalezones persistent, pas due à des lésions rétiniennes, réaligner l'œil à la caméra jusqu'à ce qu'une image uniformément lumineux est obtenue. Cet ajustement est fondamentale pour capturer ensembles reproductibles d'images en position et la qualité.
- Recueillir une image infrarouge à haute résolution de la rétine centrale (1,4-1,7 mm de diamètre, en fonction de l'âge), avec une moyenne de 30 images en temps réel (4,7 images / s; normalisé), pour améliorer le rapport signal-sur-bruit (figure 2D ).
- Immédiatement, acquérir une image de fluorescence de GFP + microglie et / ou monocytes infiltrants localisées aux plans internes de la rétine et de la papille optique.
NOTE: L'optimisation de l'image du fond d'oeil IR de la rétine détermine la résolution de l'image de fluorescence de cellules GFP +, ainsi que l'étendue de la rétine interne étalonné. Défaut de concentrer les plans intérieurs de la rétine, qui peut être détectée par une faible résolution de la vascularisation, se traduira par GFP + cellulaires vues grisés (figure 3B). Un mauvais réglage IR saturation affecte correctement et uniformément l'image de fluorescence (FA), présentant des variations d'artefact dans GFP + intensité et la taille des cellules (figure 3C).- Swich à la fluorescence mode d'imagerie (FA) dans le panneau de l'écran tactile, en utilisant du bleu, l'excitation de 488 nm laser (de 460 à 490 nm filtre barrière de jeu), et les paramètres d'acquisition (100% de la puissance laser et 100-125% de sensibilité), qui sont maintenues constante pour toutes les souris (figure 2E).
- Recueillir un seul point xy, image de fluorescence bidimensionnelle de la rétine, et de capturer immédiatement une image de fond à la position identique (100x moyenne de balayage; 55º angle de balayage pour les deux images; Figure 2F).
- Capturer une image multipoint en sélectionnant «composite» dans le panneau de contrôle (Figure 2G) et en déplaçant le droit de ophtalmoscope et à gauche, panoramique de la rétine à travers l'axe nasal-temporelle (figure 2H).
Remarque: Après la numérisation d'une seule image xy point (s 100xpeut en moyenne), le logiciel automatiquement moyennes nouveaux scans du même et de nouveaux domaines (circonscrites avec un cercle vert pendant la numérisation optimale, ou rouge lorsque l'analyse est impossible), et tous les points xy-positions en temps réel. L'image composite résultant couvre 1,5-1,7 mm sur l'axe horizontal x 3-4 mm de l'axe vertical (55º x 120-124º d'angle de balayage).
- Imagerie complète de chaque souris dans les 15 min après l'induction de l'anesthésie, avant de clignoter et redémarre de mouvement.
- Enlever les lentilles de contact, les yeux d'hydrate avec du PBS et le réexpédier vers sa cage réchauffé, vérifier le comportement jusqu'au rétablissement complet de la motilité.
- Pour les études longitudinales utilisant sessions ALSC-imagerie intermittents dans la même souris individuelle, répéter imagerie pas moins de 3 jours d'intervalle pour éviter la toxicité cumulative de l'anesthésie, ainsi que l'irritation de la cornée.
2. direct Traitement et analyse d'images
- Alignement de l'image séquentielle:
- Alignerles images du fond d'œil pour une série chronologique de l'oeil en utilisant le même système vasculaire et le disque optique comme des sites d'intérêt. Ouvrez toutes les images dans un programme de présentation du diaporama commerciale, en faisant glisser chaque image au cours de la précédente jusqu'à ce que leurs disques optiques alignés sur le plan xy (l'image du haut apparaît semi-transparent tout en étant traîné), puis faites pivoter l'image du haut jusqu'à ce que son les principaux vaisseaux sanguins se chevauchent avec le système vasculaire dans l'image suivante (mise au point sur des navires les plus éloignés de la papille optique). Notez l'angle de rotation pour chaque image et enregistrer cette série de temps pour référence future, garder la trace de l'identité de la souris et les yeux.
- Aligner la série correspondante d'images de fluorescence xy-point unique en appliquant l'angle enregistré pour corriger la rotation xy à chaque point de temps, en utilisant un programme d'édition graphique de trame. En outre, régler la résolution à 300 dpi (sans mise à l'échelle) et le fond (en mode RVB, sélectionnez Niveaux et goûter à la lumière d'un vaisseau sanguin en noir). Enregistrer ces imagescomme des fichiers TIF, ajoutant "aligné" à leurs noms.
- Microglie segmentation cellulaire:
- Pour identifier les cellules GFP + dans la rétine centrale, ouverte en FluoRender la "aligné" fichier TIF correspondant au premier point dans le temps / l'âge. Agrandir l'image pour remplir l'écran, puis définir la vue Render (composite, orthogonale, interpolée) et ses propriétés (0,58 gamma, 255 point de saturation, 255 luminance, 195 alpha et 1,00 ombrage), sélectionnant les deux canaux de RG que visible (hide B canal en double-cliquant dessus dans le cadre de l'espace de travail; la figure 4A).
- Pour sélectionner des cellules individuelles, seuil du canal rouge (doit être mis en évidence sur le cadre de l'espace de travail), en augmentant le seuil bas jusqu'à ce que la majorité des cellules sont masqués (blanc) avec des processus de recouvrement et de cellules minimales (cyan), tout en maintenant constant le seuil haut (255). La faible valeur de seuil varie entre 100 et 170, en fonction de l'intensité de fluorescence (Figure 4B </ Strong>).
- Enregistrer ce point de vue avec le canal rouge visible uniquement (commande Capture) comme un nouveau fichier TIF, ajoutant "cellsegm" à son nom d'origine (figure 4C). L'utilisation d'un logiciel d'édition graphique de trame générique, inverser son échelle de gris et d'ajuster la résolution à 300 dpi comme ci-dessus, et enregistrer à nouveau en tant que RVB (figure 4D).
REMARQUE: Supprimez les dossiers (projets) créés automatiquement par FluoRender, et sauver le seuil appliqué pour référence future.
- Microglie segmentation du soma et morphométrie:
- Pour identifier GFP + corps cellulaires pour la zone quantification, utiliser un logiciel d'analyse d'image avec des mesures automatisées d'intensité et les capacités de seuil, ainsi que basé sur un seuil objet comptage et mesure. Ouvrez le fichier TIF "de cellsegm", et sélectionnez la méthode de rééchelonnement (spline) et le canal rouge (cliquez sur l'onglet rouge en RVB). Améliorer la visualisation en décochant "vue canal de couleur" (clic droit sur le RG rougeonglet B), et en sélectionnant "complètent couleurs" (Image / Ajuster l'image) pour inverser l'échelle de gris et de voir les cellules en gris / noir sur fond blanc (figure 4E).
- Calibrer l'image à 1,4-1,7 mm en fonction de l'âge, en traçant une ligne horizontale à travers la totalité de l'image (calibrage, étalonnage rapide).
- Segment cellule individuelle corps cellulaires par l'application d'un seuil d'intensité (Figure 4B). Pour cela, le travail sur le canal RVB rouge et ouvrir la fonction seuil d'intensité (Count objet; sélectionnant commande "update de comptage") afin de suivre les paramètres bidimensionnels pour chaque région seuillées d'intérêt (ROI) représentant somata individu.
- Définir le seuil d'intensité de l'histogramme d'intensité, en notant le bas de 50 à 60% des niveaux 255, et d'affiner la valeur de seuil finale en évaluant visuellement le chevauchement entre le masque seuil de couleur (bleu) et du périmètre du corps cellulaire (gris) dans les cellules individuelles (Figure 4E).
- Estimer la précision des masques de soma cellulaire pour représenter les dimensions Somal en mesurant la surface avant et après la segmentation en 10 cellules et accepter la plage de seuil sélectionné si les mesures diffèrent moins de 10% (utiliser la barre d'outils binaire et mesures annotées).
- Identifier manuellement ROI de Somal qui comprennent plusieurs cellules et séparent ces éléments (éliminer ou ROI séparés en utilisant les contrôles binaire barre d'outils, ou le catalogue d'objets), tandis que le basculement / désactiver le binaire de visualiser directement les cellules (Figure 4F).
- Classer les cellules microgliales que ROI avec des zones de Somal plus grand et plus petit que 50-60 um 2 à discriminer soma de cellule correspondant à la microglie activé et désactivé la microglie, respectivement, en utilisant la région Restriction.
Remarque: chaque sous-ensemble de Somal cellulaire est identifié par une couche binaire pseudocolored différent, et peut être caractérisé en outre d'autres paramètres morphologiques (périméter, la circularité, etc.), ainsi que dans les secteurs de la rétine quantifiée discrets (figure 4G). Enregistrer l'image analysée comme un fichier ND2. - Vérifier le processus et la complexité de branchement dans les cellules microgliales activées individuelles, en superposant le masque de autosomique et l'image -point unique xy (contraste augmenté de 50%; Figure 4H). Compter manuellement les processus étendant directement à partir du corps cellulaire ou mesurer le diamètre du polygone englobant l'arbre (utiliser la barre d'outils et de mesures binaire annotées).
REMARQUE: Les cellules activées manquent de processus ou portent peu (<4) et court (<diamètre Somal 2x) ones, contrairement aux procédés non activées cellulaires, qui comprennent un arbre ramifié et étendue (> 3-10x diamètre de Somal) entourant leur relativement petite soma. - Identifier manuellement des cellules avec somata inférieure à <20 um 2 et / ou l'expression de GFP sous la limite de détection, qui ne sont donc pas détecté par enintensité seuil. Utilisez la commande de la taxonomie dans les annotations de compter éléments identifiés manuellement.
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Representative Results
Nos récentes études in vivo ont utilisé ces méthodes d'acquisition et d'analyse d'image en direct de visualiser et de suivre la cinétique et les modèles de ONH et les changements microgliales rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique et leur relation à la fin de la neurodégénérescence 59. Ici, nous illustrons un protocole d'acquisition d'image ALSC pour visualiser les cellules microgliales sur une grande surface de la rétine centrale dans les différents jeunes hétérozygotes CX3CR1-DBA / 2J GFP rétines (Figure 5). Basé sur la résolution de la cellule haute, nous appliquons image en direct seuil et analyses morphométriques qui permettent la segmentation automatique des cellules GFP + et soma (figure 6) individuels.
Pour suivre l'évolution de microgliose local et / ou l'activation de la microglie à des âges précédentes neurodégénérescence détectable dans ce modèle du glaucome chronique, nous avons mesuré les variations mensuelles de la densité totale de cellules de la microglie dans le jeune individu hétérozygote Cx3CR1-DBA / 2J GFP rétines (n = 10) entre 3-5 mois d'âge (figure 7A). Conformément à la progression variable de la neurodégénérescence dans les yeux individuels 41-44, notre analyse révèle des niveaux variables de l'activation de la microglie rétine et microgliose travers les yeux à chaque âge (figure 7B), et détecte les changements dynamiques de la densité du total et les microglies activées dans rétines individuels (Figure 7C). Visiblement, le nombre de microglies activées sont découplés de changements simultanés dans GFP totale + densité cellulaire. Ces résultats in vivo confirment précédente analyse ex vivo des changements microgliales DBA / 2J souris 45. Ainsi ALSC détection en direct et la mesure de l'activation de la microglie rétine peuvent servir d'indicateurs de progression de la maladie précoce, dans les yeux individuels, et peuvent potentiellement être lié à des événements initiateurs de glaucome pathogenèse.
Figure 1:. L'acquisition d'images en direct, le traitement et l'analyse flux ALSC a été utilisé pour l'image des centaines de cellules GFP + de monocytes périphériques microgliales / localisées à la centrale ~ 1,7 mm 2 de la rétine interne de la souris. images de fluorescence (FA) ont été acquises par mois pour les mêmes souris, et alignés par infrarouge (IR images) du fond d'œil de la vascularisation de la rétine et de la surface vitréenne comme référence. La segmentation des cellules GFP + et somata résulte de l'application de deux étapes séparées d'intensité-seuil à FA images rétiniennes. L'analyse morphométrique de la binaire représentant corps cellulaires a permis la mesure des zones de Somal individuels. GFP + cellules d'une superficie de plus de 50 um autosomique 2 ont été classés comme activé. Densité de cellules GFP + totales et activés a été mesurée pour chaque images rétiniennes FA, et l'examen de l'extension de l'arbre et de la complexité de branchement a été réalisé par l'observation directe d'images FA.
Figure 2: en direct des contrôles d'acquisition d'image dans ALSC Spectralis (A) de panneau d'affichage de l'écran tactile Manuel sur l'initiation.. (B) de la fenêtre d'imagerie du logiciel ALSC, montrant la tête d'une souris vivante. (C) Les paramètres sélectionnés pour l'imagerie infrarouge (allumé en bleu). (D) l'image du fond d'œil de la rétine lors de l'acquisition réelle de temps (à gauche) et la moyenne (panneau de droite). commande de normalisation indiqué avec cercle noir. Artères et veines rayonnant à partir de la tête du nerf optique sont visibles (entre parenthèses), comme le sont les faisceaux optiques axonales (flèches) entre les vaisseaux sanguins. (E) les paramètres sélectionnés pour l'imagerie de fluorescence dans un point de xy unique. (F) à point unique fluorescence (FA, 488 nm) imagerie lors de l'acquisition (moyenne). Til plus petit l'image (à gauche) montre une analyse individuelle, la plus grande image (à droite) montre la progression de l'intensité moyenne. (G) les paramètres sélectionnés pour l'acquisition d'un multipoint (composite), image de fluorescence. (H) Multipoint acquisition d'imagerie de fluorescence, montrant la numérisation en cours, dont le logiciel identifie avec un cercle vert (ou rouge lorsque l'acquisition est pas possible). Les barres d'échelle représentent ~ 5 mm (B) ou 250 um (DH) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. .
Figure 3: des défauts oculaires clés et erreurs d'imagerie qui peuvent empêcher l'imagerie de ALSC correcte de cellules microgliales (A - C) dommages ou des défauts oculaires, ainsi que l'erreur d'acquisition d'image.s peut empêcher imagerie fiable de cellules GFP + localisée aux plans les plus intimes de la rétine. (A) Certains défauts oculaires bruts sont facilement détectables dans les images du fond d'œil, y compris la cornée ou de l'opacité du cristallin, ou de blessure et l'approfondissement de la zone de disque optique, qui éviter imagerie claire de cellules GFP +. (B) de mise au point soit au-dessus (les parois des vaisseaux deviennent impossibles à distinguer de la lumière) ou au-dessous de la surface interne de la rétine (les vaisseaux sont à peine visibles) réduit la détectabilité de la GFP émission de fluorescence à partir des cellules situées à la cellule de fibre nerveuse et ganglion couches. Niveaux (C) Saturation de manière incorrecte ou inégalement définies peut résulter en des images lumineuses, mais sursaturées (avec des cellules dépourvues de la résolution) ou des images avec des zones masquées. La barre d'échelle représente 250 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Binary quantification basée seuillage-du nombre de cellules microgliales et zone de autosomique (A - D) Étapes de la segmentation des cellules dans FluoRender (A) La fenêtre de navigation avec vue rendu d'une image de fluorescence unique de point représentatif de la microglie dans la rétine centrale.. (panneau supérieur); propriétés de rendu (panneau inférieur) correspondant. (B) La même image pendant une routine de segmentation de la cellule, considérée comme RGB, avec des réglages de seuil (panneaux inférieurs) correspondant. Seuillées cellules sont représentées par des pixels blancs et superposées pour leurs processus en cyan. (C) l'image de masques de cellules obtenues après la segmentation des cellules. (D) de masque précédente avec des valeurs de niveaux de gris inversées pour un traitement ultérieur de l'image. (E - H) Étapes de autosomique seuil et la quantification. (E) Utilisation de seuil d'intensité de segmenter la microglie somata basé sur leur segmentation de la cellule précédente. L'histogramme de l'intensité RGB (à gauche) permet seuillage par la sélection directe de la gamme inférieure de 50-60% des intensités (0 à 127-153). Cette segmentation crée un masque quantifiable qui isole somata microglial individuelle (bleu). Les images sont rééchelonnées en utilisant la fonction spline (ovale à droite). (F) Les mesures automatiques à seuil de ROI individuelle / soma (en haut) et silhouettes de ROI (Object catalogue, panneau inférieur) utilisés pour corriger ROI chevauchent l'aide des outils binaires (panneau de droite) pour la séparation manuelle ou l'érosion. (G) Classification des zones de Somal individuels par zone Restriction (panneau en haut à gauche). Somata sectorielle sont classés comme ROI inférieures et supérieures à 50-60 um 2, et les couches binaires pour chaque classe de soma sont affectés différents pixels de couleur (vert unee magenta, respectivement). (H) Superposition de la soma segmentée (vert) sur l'image originale (avec un contraste accru) utilisé pour l'observation directe de la complexité des processus dans les cellules activées individuelles (panneau de gauche). Vue de tonnelles cellulaires agrandie. Les barres d'échelle représentent 250 um (AH) ou 50 um (H, en médaillon). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: haute résolution visualisation de CX3CR1- GFP + microglie / monocytes localisée à la rétine de souris intérieure par confocale en direct imagerie laser à balayage (A) le point xy image unique ALSC montrant cellules GFP + au sein de la centrale. rétine dans un âgé de 2 mois DBA / 2J souris (à gauche). Vue agrandie (à droite) montrant la zone ONH (cercle), les vaisseaux sanguins (lignes) bordée de microglies périvasculaire / macrophages, les microglies et parenchymateuse carrelage de la rétine centrale. L'image (B) Multipoint, recueillies immédiatement après le point unique de visualiser la microglie sur une zone plus large de la rétine (⅓ de la rétine). (C, D) des images identiques, présentés avec échelle de gris inversée pour l'observation optimale de la morphologie cellulaire et la complexité (minimalement ajustés pour le contraste et la résolution). Somal taille et la forme peuvent être résolus dans la plupart des cellules (à gauche). extension de Arbor et ramification de cellules peuvent être résolus dans les cellules avec grande soma (à droite, et 3 cellules individuelles). (E) de l'image du fond d'œil infrarouge de la vascularisation et optiques disque utilisé pour xy alignement Plane d'images séquentielles. Les barres d'échelle représentent 250 um (A, B et E), et 25 um (C, extrême droite).es / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Segmentation des cellules de la microglie et soma (A) cellules GFP + rendus par la segmentation en 2D utilisant FluoRender. (B) de corps cellulaires de la cellule correspondante, détecté par un seuil en utilisant un logiciel d'analyse d'image confocale. (C) de masque binaire de la cellule somata favorable à l'analyse quantitative. (D) Classification des corps cellulaires segmentée par zone de discriminer activé les cellules microgliales (> 50-60 um 2, magenta), et les cellules non activées (<50 um 2, vert). Cellules sombres et petites (<10-20 um 2, l'astérisque jaune) sont identifiés manuellement dans l'image originale avec échelle de gris inversée (
Figure 7:. Suivi longitudinale de la densité des cellules de la microglie et d'activation chez le jeune DBA / 2J rétines (A) Live ALSC fond et FA images du même oeil, acquis 3-5 mois. FA images séquentielles ont été utilisés pour quantifier les changements au fil du temps dans le nombre total de CX3CR1-cellules GFP + localisées dans le centre de ~ 1,7 mm 2 de la rétine. Comtes inclus parenchymateuse et la microglie périvasculaire, mais les cellules exclus groupées à l'ONH (position indiquée avec cercle blanc). (B) d'analyse timecourse de densité de cellules de la microglie et l'activation de la rétine à des âges précédentesneurodégénérescence DBA / 2J glaucome chronique (n = 10 rétines par âge). Numéros de cellules GFP + totales et des cellules microgliales activées (de la zone autosomique> 50 um 2) par mm 2 de la rétine centrale. Chaque point de données représente une seule rétine, et des moyens pour chaque âge sont représentés par une ligne horizontale. (C) le suivi mensuel du nombre de cellules GFP + totales et des cellules microgliales activées dans une seule rétine. Des changements parallèles mais quantitativement différentes de la densité totale de cellules activé, et avec une variation plus dynamique de la densité des cellules morphologiquement activés. La barre d'échelle représente 250 um (A). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le suivi direct du nombre de cellules de la microglie et morphologique au cours de l'activation d'une maladie neurodégénérative nécessite l'utilisation de procédés d'imagerie non invasifs permettant la visualisation détaillée des caractéristiques de la cellule. Après l'imagerie, les cellules microgliales doivent être isolés (segmenté) pour l'analyse morphométrique par l'utilisation de plusieurs étapes de seuil pour évaluer la taille de autosomique et / ou de la complexité des processus de lectures pour les microglies activation. Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes d'acquisition d'images en direct en utilisant ALSC, et l'analyse quantitative de l'activation de la microglie basée sur la cellule séquentielle et soma segmentation. Nous appliquons ces stratégies pour évaluer la cinétique de l'activation de la microglie rétine et microgliose plus de 2 mois dans le contexte d'une maladie neurodégénérative chronique de la rétine.
souris rapporteurs et les monocytes périphériques types de la microglie / cellulaires
L'utilisation de souris qui expriment la GFP sous le contrôle du récepteur de la fractalkine (CX3CR1)locus 46 permet une identification fiable de la microglie résidente, et l'expression de la GFP robuste permet remarquable dans la visualisation in vivo 30-32,34,36. Ici, nous utilisons un substrain de DBA / 2J, obtenue par rétrocroisement C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J 46 souris dans le DBA / 2J fond génétique 59. Monocytes et les macrophages périphériques, qui peuvent envahir le SNC cours de la maladie ou de blessure, expriment également la GFP tag 15,46,47.
Études d'imagerie en direct de la microglie dans la rétine neurodégénérative
Notre suivi in vivo de CX3CR1-GFP / + cellules rétiniennes utilisant ALSC se fonde sur des études antérieures qui a suivi l'évolution de la rétine GFP + nombre de cellules après une lésion aiguë pour un maximum de 10 semaines 30-32,34,48. Ici, nous visualisons CX3CR1-GFP / + microglie / monocytes périphériques avec une résolution cellulaire, par imagerie mensuel de la rétine de l'ALSC cours de la progression précoce du glaucome chronique. UNEn outre, nous utilisons l'analyse automatisée basée seuil-image en direct pour détecter et quantifier le redimensionnement de la cellule et le remodelage avec assez de résolution spatiale et temporelle pour surveiller les changements dans activés et le total des chiffres de la microglie dans les yeux des particuliers et entre les individus.
Limitations techniques de l'imagerie de la GFP ALSC + microglie dans la rétine
Nous avons trouvé la qualité de l'imagerie d'être cohérent et reproductible, comme illustré par une comparaison des images unique ou multi-point xy obtenus en une seule séance (figure 5). Toutefois, l'acquisition GFP + cellule imagerie constante et reproductible, en une seule séance et dans le temps, est étroitement liée à la sélection des paramètres stables pour l'imagerie de fluorescence fond et ALSC. Alignement de l'œil et optiques disque à l'objectif d'ALSC détermine l'uniformité des niveaux de saturation et de la mise au point sur le plan confocal d'intérêt 49. / Ou specificati inexactes et non uniformesur des niveaux de saturation peut générer des variations artefacts dans la détection de la GFP, autofluorescence fond, et de la cellule et de la résolution de l'arbre. Pour mettre l'accent sur la microglie correctement localisés de la fibre nerveuse et les couches de cellules ganglionnaires, il est essentiel d'aligner et de mettre l'accent sur les vaisseaux sanguins de la rétine et de faisceaux axonales à la surface de fond IR vitréenne par imagerie. Ceci permet d'obtenir un plan de référence pour localiser les cellules GFP + par FA. Le recentrage nécessaire requis pour passer d'IR à FA peut être guidé par l'acquisition de plusieurs images FA légèrement différentes profondeurs (55-60 D) dans chaque session expérimentale. Cela peut aussi aider à compenser les différences anatomiques dues à l'âge, dilatation de la pupille et la pathologie (optique excavation de disque). Depuis la résolution de l'image et les détails de la cellule dépend de la spécification optimale des niveaux de saturation à travers le fond, et un alignement précis de l'œil par rapport à la caméra 49, des séquences d'images acquises au fil du temps pour le même œil doit montrer des images fond IR avec conformément accent et comparables, l'éclairage, la résolution et la rétine durée de domaine. Des comptages manuels de numéros de GFP + cellulaires totaux en images acquises en une seule séance (1,5-1,7 mm 2 de la rétine, n = 13 rétines, âgés de 3-5 mois) a confirmé la quantification cohérente et reproductible des cellularité (3-4% de variation; données non représenté). Cela est nécessaire pour les images pour se prêter pour la GFP + segmentation cellulaire via l'analyse de seuil basée sur une gamme d'intensité similaire, et la comparaison des changements au fil du temps.
Seuil et analyses morphométriques de la microglie dans la rétine des images en direct d'ALSC
Seulement récemment, la visualisation in vivo des microglies du cerveau avec une résolution cellulaire élevée par deux photons microscopie confocale a permis l'analyse quantitative des paramètres de soma et processus microgliales et la discrimination de la microglie activé morphologiquement 9,50. Comme montré par ces auteurs, la taille de Somal est le plus remarquable morphologiqueparamètre détectable au fil du temps en temps réel à deux photons imagerie confocale de la microglie du cerveau, en utilisant un seuil basé sur l'intensité itérative pour réduire les variations de signal à bruit 9. En outre, les changements de taille de autosomique corrélation avec la régulation positive de l'expression dans les cellules activées Iba1 9. Ici, nous utilisons ALSC images en direct et appliquons la segmentation séquentielle comparable de cellules microgliales et soma, suivie d'une analyse morphométrique de quantifier le nombre de cellules activées totale et CX3CR1-GFP + localisées à la rétine.
Nous utilisons un logiciel de rendu confocale spécialisée (FluoRender) à cellules GFP + de segments dans la rétine centrale. Ces images sont en outre seuillés en utilisant un logiciel d'analyse d'image confocale disponible dans le commerce, afin de permettre en fin de compte la segmentation automatique et la quantification à seuil de zone de autosomique. Notre image en direct analyses a confirmé l'utilisation de la taille de soma comme une métrique morphologique de l'activation de la microglie dans l'analyse de l'image en direct 9. SomalChiffres à seuil permis de caractériser les modèles et les augmentations de microgliose rétinienne, comme l'a précédemment démontré ex vivo analyse d'image 50. Nous constatons que ALSC détecte GFP + microglie avec la meilleure résolution et une précision dans la rétine centrale de la souris (<2 mm 2), où les cellules peuvent être visualisés dans le même plan confocal. Vers la périphérie rétine, le signal de fluorescence présente une variabilité et des distorsions qui empêchent traitement d'imagerie et d'analyse identique de seuil de cellules GFP + détectées dans la rétine centrale plate. Enfin, notre protocole montre que ALSC in vivo analyse d'image de la microglie rétinienne offre un débit relativement élevé. Le nombre de microglies parenchymateuse qui pourrait être visuellement isolé et quantifié dans la rétine centrale varié entre ~ 200-300 cellules totales, et ~ 10-180 cellules activées. Ainsi, la microglie rétine de souris offre une population optimale pour étudier in vivo leur transformation et les rôles dors de la pathogenèse de la neurodégénérescence.
Application à d'autres maladies chroniques du système nerveux central
Les méthodes in vivo d'analyse d'image décrits ici devraient être applicables pour évaluer les changements microgliales aiguës ou chroniques dans d'autres maladies de la rétine de souris et modèles de lésion. En outre, ce protocole peut servir à évaluer les modifications de la rétine microglie / monocytes périphérique résultant de pathologies du système nerveux central chroniques, comme la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et la sclérose en plaques, étant donné que la rétine et du nerf optique sont ciblés pour la neurodégénérescence dans ces maladies 51-56. Dans cette optique, l'utilisation de la détection en temps réel de la rétine et ONH pathologie pour la gestion de la maladie d'Alzheimer précoce est sous intense 54,57,58 d'étude.
En conclusion, nos résultats suggèrent que, le suivi et la quantification des changements dans le nombre de microglies rétiniennes et activation morphologique longitudinale en direct, ne peuvent servir aussi fiableuroimaging biomarqueurs pour détecter l'apparition de la maladie et sa progression rapide. Ces imagerie in vivo et l'analyse méthodologie applique au glaucome liée à l'âge, et potentiellement à d'autres maladies neurodégénératives qui touchent la rétine et du nerf optique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
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