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माउस ग्लूकोमा में Confocal Ophthalmoscopic इमेजिंग और सेल morphometry: neurodegeneration के दौरान रेटिना microglial सक्रियण के vivo गतिशीलता में

Published: May 11, 2015 doi: 10.3791/52731
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

Summary

Microglia सक्रियण और microgliosis पुरानी neurodegeneration करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया कर रहे हैं। यहाँ, हम इन विवो, कोंफोकल ophthalmoscopy द्वारा रेटिना CX3CR1-+ GFP microglial कोशिकाओं की लंबी अवधि के दृश्य के लिए तरीके मौजूद है, और सीमा और morphometric के लिए पहचान करने और उनके सक्रियण यों के लिए विश्लेषण करती है। हम उम्र से संबंधित मोतियाबिंद के प्रारंभिक दौर के दौरान microglial परिवर्तन की निगरानी।

Abstract

सीएनएस निवासी neuroimmune कोशिकाएं हैं जो Microglia, विशिष्ट कार्यों और जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ एक सक्रिय राज्य के लिए स्विचन, सीएनएस क्षति के जवाब में उनकी आकृति विज्ञान और आकार बदलना। स्वास्थ्य, चोट और बीमारी में microglial सक्रियण की भूमिका अधूरे होने के कारण उनके microenvironment में बदलाव के जवाब में उनके गतिशील और जटिल विनियमन समझा रहते हैं। इस प्रकार, यह गैर invasively पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है और बरकरार जीव में समय के साथ microglial सक्रियण में परिवर्तन का विश्लेषण। विवो में microglial सक्रियण की पढ़ाई सीएनएस वातावरण बदलने के बिना ट्रैकिंग microglial व्यवहार करने के लिए तकनीकी सीमाओं की देरी हो चुकी है। इस लंबी अवधि में परिवर्तन लगाया जाना चाहिए जहां पुरानी neurodegeneration के दौरान विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। रेटिना, गैर इनवेसिव रहते इमेजिंग के लिए उत्तरदायी एक सीएनएस अंग, कल्पना और पुरानी बीमारियों के दौरान microglia सक्रियण की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है।

की, vivo इमेजिंग, सेलुलर संकल्प के साथ microglia कल्पना करने के लिए, कोंफोकल ophthalmoscopy (cSLO) और CX3CR1 GFP / + संवाददाता चूहों का उपयोग करने के लिए तरीके की रूपरेखा। इसके अलावा, हम बड़े सेल सबसेट में सेल सक्रियण और घनत्व में मासिक परिवर्तन (रेटिना प्रति 200-300 कोशिकाओं) यों की विधियों का वर्णन। हम इन विवो छवियों की स्वचालित दहलीज आधारित morphometric विश्लेषण लगाने से रेटिना में microglial सक्रियण का जीना नज़र रखने के लिए एक उपयोगी मीट्रिक के रूप में somal क्षेत्र के उपयोग की पुष्टि करें। हम इन लाइव छवि अधिग्रहण का उपयोग करें और जीर्ण मोतियाबिंद के एक माउस मॉडल में रेटिना neurodegeneration के प्रारंभिक दौर के दौरान microglial सक्रियण और microgliosis में गतिशील परिवर्तन की निगरानी करने के लिए रणनीति का विश्लेषण करती है। यह दृष्टिकोण रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका को प्रभावित करने वाले पुरानी सीएनएस विकारों में neuronal और axonal गिरावट के लिए microglia की योगदान की जांच के लिए उपयोगी होना चाहिए।

Introduction

Microglia विशेष रूप से जल्दी भ्रूण के विकास के बाद से और वयस्कता के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में रहते हैं कि neuroimmune कोशिकाओं रहे हैं। रिसेप्टर्स की एक जटिल प्रदर्शनों की सूची से लैस है, microglial गतिविधि और क्षेत्रीय विविधता पड़ोसी न्यूरॉन्स, glia, रक्त मस्तिष्क बाधा और neuroinflammatory कोशिकाओं 1,2 घुसपैठ के साथ अपने द्विदिश परस्पर क्रिया द्वारा विनियमित रहे हैं। वे समस्थिति 3,4 में perturbations के लिए अपने क्षेत्र का नमूना के रूप में बेसल microglial कार्य, शारीरिक रखरखाव और मरम्मत के लिए योगदान करते हैं। सीएनएस चोट या बीमारी के दौरान, microglia तो एक प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप को अपने संक्रमण है कि ट्रिगर न्यूरोनल संकेतों के लिए पहली responders हैं, "microglia 2,5-7 सक्रिय करार दिया। Microglia सक्रियण सेल सोम और प्रक्रिया आकार और 6-9 remodeling के लिए मिलकर कर रहे हैं, जो जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति, की एक जटिल चक्र शामिल है। Microglia सक्रियण, साथ ही सेल पुनर्वितरण औरक्लस्टरिंग, कोशिकाओं की संख्या (करार दिया microgliosis) में स्थानीय समग्र वृद्धि के साथ जा सकता है। इस के साथ या रक्त प्राप्त monocytes 3,4,7,10-14 की भर्ती के बिना सेल प्रसार और आत्म नवीकरण, से परिणाम कर सकते हैं। उम्र पर निर्भर है, पुरानी सीएनएस रोगों की एक विस्तृत रेंज में, microgliosis और microglia सक्रियण समानांतर रोग प्रगति 15-19 निरंतर। कैसे microglia प्रभाव neurodegeneration वे रोग शुरुआत और प्रगति के लिए विविध योगदान हो सकता है कि दोनों न्यूरोप्रोटेक्टिव और हानिकारक भूमिका निभाते हैं, जिसका मुख्य कारण स्पष्ट नहीं हुआ है। पुरानी सीएनएस बीमारी को समझने के उद्देश्य से लाइव इमेजिंग अध्ययन पशु मॉडल और मनुष्यों के क्षतिग्रस्त सीएनएस में microglial व्यवहार पर नजर रखी, और microglial परिवर्तन जल्दी रोग के चरणों 15-17,19,20 में पहचाने जाने लगे हैं प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, यह पता लगाने के लिए और इन विवो में microglial सक्रियण की निगरानी करने के लिए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

गैर इनवेसिव देतेमस्तिष्क microglia सक्रियण में क्षेत्रीय परिवर्तन की ction के आणविक इमेजिंग या bioluminescence और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग 18,21,22 का उपयोग कर, neurodegenerative रोग प्रगति का सूचक विवो में एक महत्वपूर्ण के रूप में स्थापित किया गया था। ये बेहद मात्रात्मक और गैर इनवेसिव आणविक और परमाणु इमेजिंग तरीकों क्षेत्रीय संकल्प के साथ gliosis का पता लगाने। वैकल्पिक रूप से, CX3CR1 GFP + / चूहों में दो photon इमेजिंग confocal सेलुलर संकल्प 3,4,9,20,23-28 के साथ मस्तिष्क microglia के अवलोकन की अनुमति दी है। हालांकि, इस दृष्टिकोण भी कम आक्रामक ब्रेन इमेजिंग प्रक्रियाओं के 29 से उनके व्यवहार को परेशान करने के संभावित खतरे को देखते हुए लंबी अवधि के और क्रोनिक microglial परिवर्तन के दोहराया अवलोकन सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से, रेटिना गंभीर चोट निम्नलिखित विवो दृश्य में प्रत्यक्ष के लिए इष्टतम स्थितियों, और उम्र बढ़ने भर में उनके बरकरार सीएनएस आला में microglia की दोहराया निगरानी प्रदान करता है, औरसंभवतः पुरानी neurodegenerative रोगों के दौरान। इस प्रकार, हाल के अध्ययनों से छवि के लिए confocal स्कैनिंग लेजर ophthalmoscopy (cSLO) लाइव CX3CR1 GFP / + चूहों आदत डाल द्वारा व्यक्त GFP रेटिना microglia की उच्च संकल्प इमेजिंग की व्यवहार्यता साबित कर दिया है। इस तीव्रता से प्रेरित चोट या आंख का उच्च रक्तचाप 30-36 निम्नलिखित अप करने के लिए 10 सप्ताह के लिए व्यक्तिगत चूहों में + GFP सेल नंबर में साप्ताहिक परिवर्तन ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हम कई महीनों से अधिक लंबी अवधि के लिए इमेजिंग प्रदर्शन, और मात्रात्मक morphometric विश्लेषण का उपयोग सोमा आकार के आधार पर microglia सक्रियण में परिवर्तन ट्रैक करने के लिए इस दृष्टिकोण का विस्तार किया है। Somal आकार CX3CR1-+ GFP microglia 9 के vivo इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए cortical स्लाइस में दो फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग रहते इमेजिंग अध्ययन में microglia सक्रियण के एक उपयोगी मीट्रिक के रूप में परिभाषित किया गया था। ये और अन्य अध्ययनों से यह भी क, somal आकार और Iba1 प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के बीच संबंध का प्रदर्शनआईसीएच भी सक्रियण 9,37 के साथ बढ़ जाती है। इस प्रकार, सक्रिय microglia लाइव चूहों में पहचाना जा सकता है, और उनकी संख्या और वितरण सीएनएस स्वास्थ्य और रोग के दौरान समय के साथ नजर रखी।

इस प्रोटोकॉल cSLO लाइव छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए तरीके microglial सेल नंबर, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) अध: पतन (चित्रा 1) के दौरान वितरण और रूपात्मक सक्रियण की निगरानी करने का वर्णन है। इस प्रकार, इस अध्ययन का उपयोग करता है: 1) उम्र पर निर्भर ऑप्टिक तंत्रिका और रेटिना neurodegeneration और प्रक्रिया से गुजरता है कि विरासत में मिला मोतियाबिंद (डी बी ए / 2J) के एक माउस मॉडल उम्र 38,39 के 5 और 10 महीने के बीच रोग प्रगति में उल्लेखनीय परिवर्तनशीलता से पता चलता है, 2) मासिक लंबी अवधि के रेटिना में GFP + कोशिकाओं के दृश्य और 3-5 महीने, सेल somata और उपाय को अलग करने के विभाजन और thresholding द्वारा 3) रहते इमेजिंग विश्लेषण आयु वर्ग के विषमयुग्मजी Cx3cr1 GFP / + डी बी ए / 2J चूहों के बिना मेलिनकृत ऑप्टिक तंत्रिका के लिए cSLO vivo इमेजिंगआईआर क्षेत्र। इन रणनीतियों जीर्ण मोतियाबिंद के प्रारंभिक दौर के दौरान रेटिना microglial सक्रियण राज्यों के कैनेटीक्स का आकलन करने के लिए लागू कर रहे हैं।

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Protocol

विवो में इमेजिंग यूटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग रोगज़नक़ मुक्त सुविधाओं में किया जाता है।
नोट: इस इमेजिंग प्रोटोकॉल रेटिना microglia और घुसपैठ monocytes / मैक्रोफेज fractalkine रिसेप्टर ठिकाना (CX3CR1) के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त जिसमें संवाददाता चूहों के लिए प्रयोग किया जाता है।

Confocal स्कैनिंग लेजर Ophthalmoscopy द्वारा रेटिना + GFP Microglia के vivo इमेजिंग में 1. (cSLO)

  1. प्रक्रिया के दौरान 35-37 डिग्री सेल्सियस के बीच माउस के तापमान को स्थिर करने के लिए सेट पानी नियंत्रित हीटिंग सिस्टम, चालू है, और दो हीटिंग पैड से कनेक्ट।
    1. कोंफोकल स्कैनिंग लेजर नेत्रदर्शक (cSLO) प्रणाली (2A चित्रा) को प्रारंभ करें। व्यक्तिगत माउस की पहचान और 2 मिमी (रोगी डेटा मेनू) के एक कॉर्निया वक्रता की स्थापना की जाएगी कि जानकारी दर्ज करें, cSLO प्रोग्राम खोलें।
  2. भारतीय सैन्य अकादमी के लिए तैयारging। सुरक्षित रूप से अपने सॉकेट पर एक साफ 55º व्यापक क्षेत्र उद्देश्य लेंस फिट बैठते हैं। साफ कागज के साथ कवर एक हीटिंग पैड प्राप्त करके नेत्रदर्शक इमेजिंग मंच तैयार करें। पैड और कागज समतल और उद्देश्य लेंस की आवाजाही अवरुद्ध से उन्हें रखने के लिए क्लिप का उपयोग करें।
  3. 1.3% 2,2,2-tribromoethanol और 0.8% tert-AMYL शराब की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize (250 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन, 0.5 मिलीग्राम / 25 ग्राम शरीर के वजन) 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल के लिए फिट एक 30½ जी सुई का उपयोग सिरिंज। अपने पिंजरे करने के लिए माउस लौटें, एक हीटिंग पैड पर रखा।
    नोट: साँस लेना बनाम इंजेक्शन द्वारा संवेदनाहारी की डिलीवरी नाक शंकु और ट्यूबिंग से मुक्त इमेजिंग और आंखों को अबाधित पहुंच के लिए माउस, की आसान स्थिति की अनुमति देता।
  4. पशु चलती बंद हो जाता है और पूंछ चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी है एक बार, प्रवण पशु स्थिति और 7 मिनट के लिए बूंदों के साथ दोनों आंखों को कवर करके, Tropicamide और phenylephrine (0.5% प्रत्येक) के साथ छात्र फैलाव प्रेरित।
  5. 5 मिनट, पी के बादकम से कम दबाव लागू करने, दोनों आंखों पर नेत्रदर्शक मंच के केंद्र पर प्रवण माउस, और फिट कॉन्टेक्ट लेंस फीता।
    नोट: संदंश के बजाय 40 का इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि संपर्क लेंस, छोटे और कमजोर कर रहे हैं, लेकिन ध्यान से उंगलियों के साथ संभाला जा सकता है। यह आंख सूखापन को कम करता है और इमेजिंग के दौरान कॉर्निया पारदर्शिता बरकरार रखता है के रूप में संपर्क लेंस का उपयोग वैकल्पिक है, लेकिन सिफारिश की है।
  6. 7 मिनट के बाद, मंच (चित्रा 2 बी) के किनारे के पास अनर्गल पशु रखने, उद्देश्य लेंस और उद्देश्य लेंस को कक्षा समानांतर सामना करना पड़ रहा दाहिनी आंख के साथ माउस पूरबी। तुलनीय संतृप्ति और अभिविन्यास की छवियों को इकट्ठा करने के लिए, लगातार उद्देश्य लेंस को आंख से दूरी, साथ ही इमेजिंग सत्र के दौरान प्रकाश पथ के लिए आंख के संरेखण को बनाए रखने। आँख का अवलोकन के साथ हस्तक्षेप लंबी मूंछ क्लिप।
    नोट: अगले 8-10 मिनट के लिए, माउस ले जाएँ या झपकी, और कोमल चाल के साथ होगा सांस नहीं होगाउच्च विपरीत के साथ बुध्न स्थलों पर आधारित स्कैन सिर की स्थिति समायोजित कर देता है जो cSLO नेत्र ट्रैकिंग एआरटी (स्वत: वास्तविक समय) मोड, द्वारा ट्रैक किए गए हैं जो बयान,। उस समय विगत, चूहों इमेजिंग अव्यावहारिक बना रही है, पुताई और निमिष शुरू करते हैं।
  7. इमेजिंग कॉन्टेक्ट लेंस का उपयोग किए बिना किया जाता है, तो पीबीएस दोनों आंखों को सुखाने से उन्हें रोकने के लिए हर 2-3 मिनट बूँदें लागू होते हैं।
  8. रेटिना vasculature और ऑप्टिक डिस्क की एक बुध्न छवि लीजिए, भीतरी रेटिना पर ध्यान केंद्रित किया।
    1. अवरक्त मोड (आईआर) का चयन करें और 820 एनएम उत्तेजना, 100% लेजर शक्ति, 40-60% संवेदनशीलता (चित्रा -2) के लिए सेटिंग्स समायोजित करें।
    2. उच्च गति मोड (12.6 फ्रेम / सेक) में काम करते हुए, नेत्रदर्शक ड्राइव करने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग कर आँख का पता लगाने। कम बढ़ाई, चोट या अस्पष्टता के लिए कॉर्निया और लेंस का निरीक्षण किया, और रेटिना (चित्रा 3) इमेजिंग को प्रभावित करेगा कि दोष या चोट के साथ अध्ययन आँखों से बाहर।
    3. ऑप्टिक डिस्क क्षेत्र (की सतह का पता लगाएँकरीब नज़र करने के उद्देश्य लाकर ऑप्टिक तंत्रिका सिर, ONH), तो उस पर छवि केन्द्र और जॉयस्टिक पंगा लेना द्वारा इस स्थिति ताला। नेत्रदर्शक के लिए आंख की इस संरेखण भी प्राप्त छवि भर में ध्यान केंद्रित करने और उत्सर्जन के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. खुदाई ऑप्टिक दिखा आँखों में एक संदर्भ फोकल हवाई जहाज़ (59 और 60 डी), या गहरी (55 डी) के रूप में रेटिना के vitreal सतह पर स्थित प्रमुख रक्त वाहिकाओं का उपयोग कर, ONH के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, रेटिना के भीतरी विमानों कल्पना डिस्क। इष्टतम फोकस स्पष्ट रूप से अलग उनके लुमेन और दीवारों के साथ, प्रमुख रक्त वाहिकाओं के भीतर रक्त कोशिकाओं परिसंचारी हल करना चाहिए।
    5. वर्दी रोशनी की एक सफेद प्रभामंडल (मामूली overexposure का प्रयोग करके) ऑप्टिक डिस्क के चारों ओर 55º बुध्न क्षेत्र के अधिकांश में तक फैला है, जब तक टच स्क्रीन नियंत्रण कक्ष पर डायल का समायोजन करके छवि संतृप्ति का अनुकूलन। इसके बाद, प्रमुख जहाजों के साथ आगे बढ़ रक्त कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है जब तक इसके विपरीत अनुकूलन करने के लिए संतृप्ति कम है। फोकल अंधेरा हैक्षेत्रों के नहीं होने के कारण रेटिना को नुकसान के लिए, एक समान रूप से उज्ज्वल छवि प्राप्त किया जाता है जब तक कैमरे के लिए आंख फिर से संगठित करना, जारी रहती है। इस समायोजन की स्थिति और गुणवत्ता में छवियों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेट पर कब्जा करने के लिए मौलिक है।
    6. वास्तविक समय में 30 फ्रेम (4.7 फ्रेम / सेक, सामान्यीकृत) औसत (उम्र पर निर्भर करता है, व्यास में 1.4-1.7 मिमी) केंद्रीय रेटिना के एक उच्च संकल्प आईआर छवि लीजिए संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार करने के लिए, (चित्रा 2 डी )।
  9. इसके तत्काल बाद, + GFP microglia और / या रेटिना और ONH के भीतरी विमानों के लिए स्थानीय घुसपैठ monocytes के एक प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण।
    नोट: रेटिना के आईआर बुध्न छवि का अनुकूलन GFP + कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवि का संकल्प है, साथ ही फैला भीतरी रेटिना की हद तक निर्धारित करता है। Vasculature की गरीब संकल्प से पता लगाया जा सकता है जो रेटिना, के भीतरी विमानों ध्यान केंद्रित करने में विफलता, मंद + GFP सेल के विचार (3B चित्रा) में परिणाम होगा। आईआर Satu को समायोजित करने में विफलताराशन सही ढंग से और समान रूप से + GFP सेल तीव्रता और आकार (चित्रा -3 सी) में artifactual विविधताओं को शुरू करने, प्रतिदीप्ति छवि (एफए) को प्रभावित करता है।
    1. रखा जाता है, जो नीले, 488 एनएम लेजर उत्तेजना (460-490 एनएम बाधा फिल्टर सेट), और अधिग्रहण सेटिंग्स (100% लेजर शक्ति और 100-125% संवेदनशीलता), का उपयोग करते हुए, टच स्क्रीन पैनल में इमेजिंग मोड (एफए) प्रतिदीप्ति को swich सभी चूहों (चित्रा 2 ई) के लिए निरंतर।
    2. एक भी XY-बिंदु, रेटिना के bidimensional प्रतिदीप्ति छवि ले लीजिए, और तुरंत समान स्थिति में एक बुध्न छवि पर कब्जा (100x स्कैन औसत, दोनों छवियों के लिए 55º स्कैन कोण, चित्रा 2 एफ)।
    3. नाक-लौकिक धुरी (चित्रा 2H) भर में रेटिना panning, नियंत्रण कक्ष (चित्रा 2 जी) में "समग्र" का चयन और नेत्रदर्शक सही जा रहा है और छोड़ दिया द्वारा एक बहु छवि पर कब्जा।
      नोट: एक ही XY सूत्री छवि स्कैनिंग के बाद (100x केवास्तविक समय में सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से इष्टतम स्कैन, या स्कैन अव्यावहारिक है जब लाल के दौरान औसत के एक हरे रंग चक्र के साथ घिरा एक ही है और नए क्षेत्रों (के नए स्कैन), और टांके सभी XY-स्थिति,) औसत कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप समग्र छवि ऊर्ध्वाधर अक्ष (55º एक्स 120-124º स्कैन कोण) में क्षैतिज अक्ष एक्स 3-4 मिमी पर 1.5-1.7 मिमी तक फैला है।
  10. निमिष और गति के पुनरारंभ होने से पहले, संज्ञाहरण उत्प्रेरण के बाद 15 मिनट के भीतर प्रत्येक माउस के पूर्ण इमेजिंग।
  11. पीबीएस के साथ संपर्क लेंस, हाइड्रेट आँखें निकालें और गतिशीलता की पूरी वसूली जब तक व्यवहार की जाँच, अपने गरम पिंजरे में पशु लौटने।
  12. एक ही व्यक्ति माउस में रुक-रुक कर cSLO-इमेजिंग सत्र के प्रयोग अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए, संज्ञाहरण का संचयी विषाक्तता, साथ ही कॉर्निया जलन से बचने के लिए कोई कम से कम 3 दिनों के अलावा इमेजिंग दोहराएँ।

2. लाइव इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. अनुक्रमिक छवि संरेखण:
    1. संरेखितस्थलों के रूप में vasculature और ऑप्टिक डिस्क का उपयोग कर एक ही आंख की एक समय की श्रृंखला के लिए बुध्न छवियों। एक वाणिज्यिक स्लाइड शो प्रस्तुति कार्यक्रम में, उनके ऑप्टिक डिस्क xy- विमान पर संरेखित तक एक पूर्ववर्ती (ऊपर छवि घसीटा जा रहा है, जबकि अर्द्ध पारदर्शी दिखाई देता है), तब तक शीर्ष छवि को घुमाने के लिए प्रत्येक छवि को खींचकर सभी छवियों ओपन के अपने प्रमुख रक्त वाहिकाओं (सब से अधिक दूर ऑप्टिक डिस्क से जहाजों पर ध्यान केंद्रित) नीचे की छवि पर वाहिका संरचना के साथ ओवरलैप। प्रत्येक छवि के लिए रोटेशन कोण रिकॉर्ड और माउस और आंख पहचान का ट्रैक रखने, भविष्य में संदर्भ के लिए इस बार श्रृंखला बचाने के लिए।
    2. , हर समय बिंदु पर XY रोटेशन सही करने के लिए दर्ज की गई कोण को लागू करने के लिए एक रेखापुंज ग्राफिक संपादक कार्यक्रम का उपयोग करके एकल XY सूत्री प्रतिदीप्ति छवियों की इसी श्रृंखला संरेखित करें। साथ ही, 300 (rescaling बिना) डीपीआई और पृष्ठभूमि करने के लिए संकल्प समायोजित (आरजीबी मोड, का चयन स्तर में और काले रंग के रूप में एक रक्त वाहिका के लुमेन नमूना)। इन छवियों को सहेजेंTIF फ़ाइलों के रूप में उनके नाम के लिए "गठबंधन" जोड़ने।
  2. Microglial कोशिका विभाजन:
    1. FluoRender में खुला, केंद्रीय रेटिना में जल्द से जल्द समय बिंदु / उम्र के लिए इसी "गठबंधन" TIF फ़ाइल GFP + कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। स्क्रीन फिट करने के लिए छवि ज़ूम, तो (छुपाने के लिए दिखाई दे रूप में आरजी चैनलों दोनों का चयन, प्रस्तुत करना दृश्य (समग्र, ओर्थोगोनल, interpolated) और उसके गुण (0.58 गामा, 255 संतृप्ति बिंदु, 255 Luminance, 195 अल्फा और 1.00 छायांकन) को परिभाषित डबल-क्लिक कार्यक्षेत्र फ्रेम में यह द्वारा बी चैनल, चित्रा -4 ए)।
    2. निरंतर उच्च दहलीज रखते हुए कोशिकाओं का बहुमत है, कम से कम ओवरलैप और सेल प्रक्रियाओं (सियान) के साथ (सफेद) नकाबपोश कर रहे हैं जब तक कम सीमा को बढ़ाने के द्वारा, (कार्यक्षेत्र फ्रेम पर प्रकाश डाला जाना चाहिए) व्यक्ति की कोशिकाओं, सीमा लाल चैनल का चयन करने के लिए (255)। सीमा से कम मूल्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (4B चित्रा <पर निर्भर करता है, 100 और 170 के बीच होती है/ Strong>)।
    3. अपने मूल नाम (चित्रा 4C) के लिए "cellsegm" उनका कहना है, एक नया TIF फ़ाइल के रूप में दिखाई लाल चैनल केवल (कब्जा आदेश) के साथ इस दृश्य को बचा। एक सामान्य रास्टर ग्राफिक संपादक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, अपने greyscale पलटना और ऊपर के रूप में 300 डीपीआई संकल्प समायोजित, और आरजीबी (चित्रा 4D) के रूप में फिर से बचाने के लिए।
      नोट: स्वचालित रूप से FluoRender द्वारा निर्मित फ़ोल्डर (परियोजना) को हटाएँ, और भविष्य में संदर्भ के लिए आवेदन किया दहलीज बचाने के लिए।
  3. Microglial सोमा के विभाजन और morphometry:
    1. क्षेत्र मात्रा का ठहराव के लिए + GFP सेल somata की पहचान करने के लिए, स्वचालित तीव्रता माप और दहलीज क्षमताओं, साथ ही दहलीज आधारित वस्तु गिनती और माप के साथ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। "Cellsegm" TIF फ़ाइल खोलें, और rescaling विधि (पट्टी) और लाल चैनल का चयन (आरजीबी में लाल टैब पर क्लिक करें)। "रंग में देखें चैनल" deselecting द्वारा दृश्य में सुधार (लाल आरजी राइट क्लिक करेंबी टैब), और "रंग के पूरक हैं" का चयन (छवि / greyscale पलटना और सफेद पृष्ठभूमि (चित्रा 4E) पर काले / ग्रे में कोशिकाओं को देखने के लिए) छवि को समायोजित करें।
    2. पूरी छवि (कैलिब्रेशन, त्वरित कैलिब्रेशन) भर में एक क्षैतिज रेखा खींचने से, उम्र के आधार पर 1.4-1.7 मिमी करने के लिए छवि जांचना।
    3. तीव्रता thresholding (चित्रा 4 बी) को लागू करने से खंड व्यक्ति सेल somata। इस के लिए, लाल आरजीबी चैनल पर काम और दहलीज तीव्रता समारोह खोलने (वस्तु गणना, "गिनती अद्यतन" कमांड का चयन) व्यक्तिगत somata का प्रतिनिधित्व ब्याज (आरओआई) में से प्रत्येक thresholded क्षेत्र के लिए bidimensional मापदंडों को ट्रैक करने के क्रम में।
    4. 255 के स्तर की सबसे कम 50-60% का चयन, और नेत्रहीन दहलीज रंग मुखौटा (नीला) और सेल सोम परिधि (ग्रे) में बीच ओवरलैप का आकलन करने से अंतिम दहलीज मूल्य को परिष्कृत करके, तीव्रता हिस्टोग्राम में तीव्रता दहलीज को परिभाषित करें व्यक्ति की कोशिकाओं (एफigure 4E)।
    5. माप कम से कम 10% (बाइनरी टूलबार और एनोटेट माप का उपयोग) भिन्न होते हैं अगर 10 कोशिकाओं में विभाजन से पहले क्षेत्र को मापने के द्वारा और बाद somal आयाम का प्रतिनिधित्व करते हैं और चयनित दहलीज श्रृंखला को स्वीकार करने के लिए सेल सोम मास्क की सटीकता का अनुमान है।
    6. मैन्युअल एकाधिक कोशिकाओं में शामिल हैं और सीधे कोशिकाओं (चित्रा 4F) कल्पना करने के लिए द्विआधारी पर / बंद टॉगल हुए भी इन तत्वों (बाइनरी टूलबार नियंत्रण, या वस्तु सूची का उपयोग खत्म करने या अलग ROIs) अलग है कि somal ROIs की पहचान।
    7. Somal क्षेत्रों बड़ा और छोटे से 50-60 माइक्रोन 2 सक्रिय microglia करने के लिए इसी सेल somata भेदभाव और क्षेत्र के प्रतिबंध का उपयोग करके, क्रमशः microglia निष्क्रिय कर दिया करने के साथ ROIs के रूप में microglial कोशिकाओं वर्गीकृत।
      नोट: प्रत्येक कोशिका somal सबसेट एक अलग pseudocolored द्विआधारी परत के साथ की पहचान की है, और आगे अन्य रूपात्मक मापदंडों के लिए होती जा सकता है (perimeआतंकवाद, घेरा, आदि), के रूप में अच्छी तरह से असतत रेटिना क्षेत्रों (चित्रा 4 जी) के भीतर मात्रा निर्धारित है। एक ND2 फ़ाइल के रूप में विश्लेषण छवि को बचाओ।
    8. Somal मुखौटा और एक XY सूत्रीय छवि overlaying द्वारा, व्यक्ति सक्रिय microglial कोशिकाओं में प्रक्रिया और शाखाओं में बंटी जटिलता सत्यापित (; चित्रा 4H विपरीत 50% की वृद्धि हुई)। मैन्युअल सीधे सेल सोम से देने प्रक्रियाओं गिनती या कुंज (बाइनरी टूलबार और एनोटेट माप का उपयोग) को शामिल बहुभुज के व्यास को मापने।
      नोट: सक्रिय कोशिकाओं प्रक्रियाओं की कमी है या कुछ सहन (<4) और छोटी (<2x somal व्यास) हैं, एक डालियां फैला हुआ है और व्यापक कुंज शामिल है जो गैर-सक्रिय सेल प्रक्रियाओं के विपरीत (> 3-10x somal व्यास) अपेक्षाकृत उनके आसपास छोटे सोमा।
    9. मैन्युअल इसलिए में से नहीं चल पाता जो कर रहे हैं पता लगाने सीमा, नीचे somata से छोटी <20 माइक्रोन 2 और / या GFP अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की पहचानशर्मंदगी thresholding। मैन्युअल रूप से पहचान तत्वों की गिनती के लिए एनोटेशन में वर्गीकरण आदेश का उपयोग करें।

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Representative Results

हमारे हाल के vivo में पढ़ाई के लिए कल्पना और देर neurodegeneration से 59 जीर्ण मोतियाबिंद और उनके रिश्ते के प्रारंभिक दौर के दौरान कैनेटीक्स और ONH और रेटिना microglial परिवर्तन के पैटर्न को ट्रैक करने के लिए इन जीवित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के तरीकों का इस्तेमाल किया। यहाँ हम व्यक्तिगत युवा विषमयुग्मजी Cx3CR1-GFP के डी बी ए / 2J retinas में केंद्रीय रेटिना (चित्रा 5) के एक बड़े क्षेत्र भर में microglial कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक cSLO छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल वर्णन। उच्च सेल संकल्प के आधार पर हम जीवित छवि thresholding लागू करते हैं और morphometric व्यक्ति GFP + कोशिकाओं और somata (चित्रा 6) की स्वचालित विभाजन की अनुमति है कि विश्लेषण करती है।

स्थानीय microgliosis और / या पुरानी मोतियाबिंद के इस मॉडल में detectable neurodegeneration पूर्ववर्ती उम्र में microglia सक्रियण के विकास पर नजर रखने के लिए, हम व्यक्तिगत युवा विषमयुग्मजी Cx में कुल microglia सेल घनत्व की मासिक विविधताओं मापा3CR1-GFP के डी बी ए / 2J retinas के उम्र (चित्रा 7A) के 3-5 महीने के बीच (एन = 10)। व्यक्तिगत आँखों 41-44 में neurodegeneration के चर प्रगति के अनुरूप, हमारे विश्लेषण प्रत्येक आयु (चित्रा 7B) में आंखें भर में रेटिना microglia सक्रियण और microgliosis के चर स्तर का पता चलता है, और कुल के घनत्व में गतिशील परिवर्तन और अलग-अलग retinas के भीतर सक्रिय microglia का पता लगाता है (चित्रा 7C)। ज़ाहिर, सक्रिय microglia की संख्या कुल + GFP सेल घनत्व में समवर्ती परिवर्तन से uncoupled कर रहे हैं। ये इन विवो निष्कर्षों डी बी ए / 2J चूहों 45 में microglial परिवर्तन की पिछली पूर्व vivo विश्लेषण की पुष्टि करें। इस प्रकार cSLO रहते पता लगाने और रेटिना microglial सक्रियण की माप व्यक्ति आँखों के भीतर जल्दी रोग प्रगति के संकेतक के रूप में सेवा कर सकता है, और संभावित मोतियाबिंद रोगजनन की घटनाओं की शुरुआत से जोड़ा जा सकता है।

चित्रा 1:। लाइव छवि अधिग्रहण, प्रोसेसिंग और विश्लेषण कार्यप्रवाह cSLO माउस भीतरी रेटिना के केंद्रीय ~ 1.7 मिमी 2 के लिए स्थानीय + GFP microglial / परिधीय monocyte कोशिकाओं की छवि सैकड़ों करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रतिदीप्ति छवियों (एफए) एक ही चूहों के लिए मासिक हासिल कर ली है, और संदर्भ के रूप में रेटिना vasculature और vitreal सतह की अवरक्त (आईआर) बुध्न छवियों का उपयोग गठबंधन किया गया। GFP + कोशिकाओं और somata के विभाजन एफए रेटिना छवियों तीव्रता-thresholding की दो अलग-अलग चरणों को लागू करने से हुई। बाइनरी का प्रतिनिधित्व सेल somata के morphometric विश्लेषण व्यक्ति somal क्षेत्रों की माप की अनुमति दी। सक्रिय रूप में 50 माइक्रोन 2 से ऊपर somal क्षेत्र के साथ GFP + कोशिकाओं में वर्गीकृत किया गया। कुल और सक्रिय GFP + कोशिकाओं का घनत्व व्यक्ति रेटिना एफए छवियों के लिए मापा जाता है, और कुंज विस्तार की परीक्षा और शाखाओं में बंटी जटिलता एफए छवियों का प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा प्रदर्शन किया गया था। चित्र 2
चित्रा 2: cSLO Spectralis में लाइव छवि अधिग्रहण नियंत्रण (ए) दीक्षा पर मैनुअल टच स्क्रीन पैनल डिस्प्ले।। एक जीवित माउस के सिर दिखा रहा है (बी) cSLO सॉफ्टवेयर इमेजिंग खिड़की,। अवरक्त इमेजिंग के लिए चयनित (सी) सेटिंग (नीले रंग में जलाया)। वास्तविक समय अधिग्रहण (बाएं पैनल) और औसत (सही पैनल) के दौरान रेटिना (डी) बुध्न छवि। सामान्य आदेश के काले सर्किल के साथ संकेत दिया। रक्त वाहिकाओं के बीच में ऑप्टिक axonal बंडलों (तीर) के रूप में धमनियों और ऑप्टिक तंत्रिका सिर से radiating नसों, (कोष्ठक के बीच) दिखाई दे रहे हैं। (ई) सेटिंग्स एक ही XY बिंदु के भीतर प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए चुना। (एफ) एकल बिंदु प्रतिदीप्ति (एफए, 488 एनएम) प्राप्ति (औसत) के दौरान इमेजिंग। टीवह छोटे छवि (बाएं) एक व्यक्ति के स्कैन से पता चलता है, बड़ी छवि (दाएं) तीव्रता औसत की प्रगति को दर्शाता है। (जी) सेटिंग्स एक बहु (संयुक्त), प्रतिदीप्ति छवि के अधिग्रहण के लिए चयन किया। (एच) बहु प्रतिदीप्ति इमेजिंग अधिग्रहण, सॉफ्टवेयर एक हरे रंग की मंडली के साथ दिखाता है, जो प्रगति में स्कैन, दिखा रहा है (या लाल अधिग्रहण संभव नहीं है जब)। स्केल सलाखों ~ 5 मिमी (बी) या 250 माइक्रोन (डीएच) का प्रतिनिधित्व करते हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। ।

चित्र तीन
चित्रा 3: microglial कोशिकाओं के सही cSLO इमेजिंग रोका जा सकता है कि प्रमुख नेत्र दोष और इमेजिंग त्रुटियों (एक - सी) नेत्र क्षति या दोष है, साथ ही छवि अधिग्रहण त्रुटि।एस रेटिना के अंतरतम विमानों के लिए स्थानीय GFP + कोशिकाओं के विश्वसनीय इमेजिंग रोका जा सकता है। (ए) कुछ सकल नेत्र दोष, कॉर्निया या लेंस अस्पष्टता, या चोट सहित और ऑप्टिक डिस्क क्षेत्र की मजबूत बनाने बुध्न छवियों, में आसानी से पहचाने जा रहे हैं जो सभी के लिए GFP + कोशिकाओं का स्पष्ट इमेजिंग रोका जा सके। (वाहिकाओं की दीवारों लुमेन से पृथक हो जाते हैं) के ऊपर या रेटिना (वाहिकाओं मुश्किल से दिखाई दे रहे हैं) की अंदरूनी सतह के नीचे या तो ध्यान केंद्रित (बी) के तंत्रिका फाइबर और नाड़ीग्रन्थि सेल में स्थित कोशिकाओं से GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की detectability कम कर देता है परतें। (सी) संतृप्ति स्तर को गलत ढंग से या असमान छिप क्षेत्रों के साथ या छवियों (संकल्प की कमी कोशिकाओं के साथ) उज्ज्वल लेकिन oversaturated छवियों में परिणाम कर सकते हैं निर्धारित किया है। स्केल बार 250 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4: microglial सेल मायने रखता है और somal क्षेत्र के द्विआधारी thresholding आधारित मात्रा का ठहराव (ए - डी) केंद्रीय रेटिना के भीतर microglia की एक प्रतिनिधि एकल बिंदु प्रतिदीप्ति छवि का गाया दृश्य के साथ FluoRender में सेल विभाजन के लिए कदम (ए) नेविगेशन खिड़की।। (टॉप पैनल); प्रतिपादन गुण (कम पैनल) इसी। दहलीज सेटिंग्स (कम पैनल) इसी के साथ, आरजीबी के रूप में देखा (बी) के एक सेल विभाजन दिनचर्या के दौरान एक ही छवि,। Thresholded कोशिकाओं सफेद पिक्सल द्वारा प्रतिनिधित्व किया है और सियान में उनकी प्रक्रियाओं के लिए मढ़ा जाता है। सेल विभाजन के बाद प्राप्त सेल मास्क (सी) छवि। (डी) आगे इमेज प्रोसेसिंग के लिए उलटा greyscale मूल्यों के साथ पिछले मुखौटा। (ई - एच) Somal thresholding और मात्रा का ठहराव के लिए कदम। उनके पिछले सेल विभाजन के आधार पर खंड microglia somata को तीव्रता दहलीज (ई) का प्रयोग करें। आरजीबी तीव्रता हिस्टोग्राम (बाएं) तीव्रता के निचले 50-60% रेंज (127-153 को 0) के प्रत्यक्ष चयन द्वारा thresholding अनुमति देता है। इस विभाजन व्यक्ति microglial somata (नीला) आइसोलेट्स कि एक quantifiable मुखौटा बनाता है। छवियाँ (सही पर अंडाकार) तख़्ता समारोह का उपयोग rescaled कर रहे हैं। (एफ) व्यक्तिगत आरओआई / somata (शीर्ष पैनल) और मैनुअल जुदाई या कटाव के लिए द्विआधारी उपकरण (सही पैनल) का उपयोग अतिव्यापी ROIs के सही इस्तेमाल आरओआई silhouettes (वस्तु कैटलॉग, नीचे पैनल) की स्वचालित दहलीज आधारित माप। क्षेत्र के प्रतिबंध (ऊपर बाएं पैनल) द्वारा अलग-अलग somal क्षेत्रों (G) वर्गीकरण। खंडों somata ROIs के छोटे रूप में वर्गीकृत और से बड़ा 50-60 माइक्रोन 2, और somata के प्रत्येक वर्ग के लिए द्विआधारी परतों अलग रंग पिक्सल आवंटित कर रहे हैं (हरे रंग की एकएन डी Magenta, क्रमशः)। व्यक्तिगत सक्रिय कोशिकाओं में प्रक्रिया जटिलता का प्रत्यक्ष अवलोकन (बाएं पैनल) के लिए इस्तेमाल किया (बढ़ा विपरीत के साथ) मूल छवि पर खंडों somata (हरा) के (एच) ओवरले। सेल arbors के मद्देनजर बढ़ाया। स्केल सलाखों प्रतिनिधित्व 250 माइक्रोन (मुख्यालय) या 50 माइक्रोन (एच, इनसेट)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: CX3CR1- + GFP microglia की उच्च संकल्प दृश्य / monocytes जीना confocal स्कैनिंग लेजर इमेजिंग द्वारा भीतरी माउस रेटिना के लिए स्थानीय (ए) एकल xy- बिंदु cSLO छवि केंद्रीय भीतर GFP + कोशिकाओं दिखा। एक 2 महीने पुराने डी बी ए / 2J माउस (बाएं) में रेटिना। ONH क्षेत्र (चक्र) दिखा बढ़ाया दृश्य (दाएं), रक्त वाहिकाओं (पंक्तियां) परिवाहकीय microglia / मैक्रोफेज, और केंद्रीय रेटिना खपरैल का छत parenchymal microglia के साथ खड़े हैं। (बी) के बहु छवि, एक व्यापक रेटिना क्षेत्र (रेटिना के ⅓) के पार microglia कल्पना करने के लिए एक बिंदु के तुरंत बाद एकत्र की। (सी, डी) सेल आकृति विज्ञान और जटिलता का इष्टतम अवलोकन के लिए उलटा greyscale के साथ दिखाया समान छवियों, (न्यूनतम विपरीत और संकल्प के लिए समायोजित)। Somal आकार और आकार सबसे कोशिकाओं (बाएं) में सुलझाया जा सकता है। आर्बर विस्तार और सेल शाखाओं में बड़े somata (सही, और 3 व्यक्ति की कोशिकाओं) के साथ कोशिकाओं में हल किया जा सकता है। (ई) अनुक्रमिक छवियों के xy विमान संरेखण के लिए इस्तेमाल किया vasculature और ऑप्टिक डिस्क के अवरक्त बुध्न छवि। स्केल सलाखों 250 माइक्रोन (ए, बी और ई), और 25 माइक्रोन (सी, अभी तक सही) का प्रतिनिधित्व करते हैं।तों / ftp_upload / 52,731 / 52731fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। Microglial सेल और somata के विभाजन (ए) GFP + कोशिकाओं FluoRender का उपयोग कर 2 डी में विभाजन द्वारा प्रदान की गई है। Confocal छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग thresholding द्वारा पता लगाया (बी) इसी सेल somata। (सी) मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए somata उत्तरदायी सेल के द्विआधारी मुखौटा। क्षेत्र द्वारा खंडों सेल somata (डी) वर्गीकरण microglial कोशिकाओं (> 50-60 माइक्रोन 2, मैजेंटा), और गैर सक्रिय कोशिकाओं (<50 माइक्रोन 2, हरा) सक्रिय भेदभाव करने के लिए। मंद और छोटे कोशिकाओं (<10-20 माइक्रोन 2, पीला तारांकन) उल्टा greyscale के साथ मूल छवि (मैन्युअल पहचान कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7:। युवा डी बी ए / 2J retinas में microglial सेल घनत्व और सक्रियण के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग (ए) उम्र के 3-5 महीनों से हासिल कर ली एक ही आंख की cSLO बुध्न और एफए छवियों, जीते। अनुक्रमिक एफए छवियों रेटिना के केंद्रीय ~ 1.7 मिमी 2 के भीतर स्थानीयकृत कुल CX3CR1-GFP की संख्या + कोशिकाओं में समय के साथ परिवर्तन यों के लिए इस्तेमाल किया गया। गिनता parenchymal और परिवाहकीय microglia, लेकिन ONH पर क्लस्टर बाहर रखा कोशिकाओं (स्थिति सफेद वृत्त के साथ संकेत दिया) शामिल हैं। (बी) के पूर्ववर्ती उम्र में रेटिना microglia सेल घनत्व और सक्रियण के timecourse विश्लेषणडी बी ए / 2J जीर्ण मोतियाबिंद (एन = उम्र 10 प्रति रेटिना) में neurodegeneration। कुल GFP + कोशिकाओं की और केंद्रीय रेटिना के 2 मिमी प्रति सक्रिय microglial कोशिकाओं (somal क्षेत्र> 50 माइक्रोन 2) का नंबर। प्रत्येक डेटा बिंदु एक भी रेटिना का प्रतिनिधित्व करता है, और एक क्षैतिज रेखा के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं हर उम्र के लिए इसका मतलब है। कुल GFP + कोशिकाओं की और एक भी रेटिना में सक्रिय microglial कोशिकाओं की संख्या (सी) मासिक ट्रैकिंग। आकृति विज्ञान सक्रिय कोशिकाओं के घनत्व में और अधिक गतिशील परिवर्तन के साथ कुल और सक्रिय सेल घनत्व में समानांतर लेकिन मात्रात्मक विभिन्न परिवर्तन कर रहे हैं। स्केल बार 250 माइक्रोन (ए) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक neurodegenerative रोग दौरान microglial सेल नंबर और रूपात्मक सक्रियण की लाइव निगरानी सेल सुविधाओं का विस्तृत दृश्य की अनुमति है कि गैर इनवेसिव इमेजिंग तरीकों के उपयोग की आवश्यकता है। इमेजिंग के बाद, microglial कोशिकाओं microglia सक्रियण के लिए readouts के रूप में somal आकार और / या प्रक्रिया की जटिलता का आकलन करने के लिए कई दहलीज चरणों के उपयोग के द्वारा morphometric विश्लेषण के लिए (खंडों) अलग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, हम cSLO का उपयोग करते हुए लाइव छवि अधिग्रहण, और अनुक्रमिक सेल और सोमा विभाजन पर आधारित microglial सक्रियण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विधियों का वर्णन। हम रेटिना की एक पुरानी neurodegenerative रोग के संदर्भ में 2 महीनों में रेटिना microglia सक्रियण और microgliosis के कैनेटीक्स का आकलन करने के लिए इन रणनीतियों को लागू करें।

रिपोर्टर चूहों और microglia / परिधीय monocytes सेल प्रकार

fractalkine रिसेप्टर के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP कि चूहों के उपयोग (CX3CR1)लोकस 46 निवासी microglia की विश्वसनीय पहचान की अनुमति देता है, और मजबूत GFP अभिव्यक्ति विवो दृश्य 30-32,34,36 में उल्लेखनीय परमिट। यहाँ, हम डी बी ए / 2J आनुवंशिक पृष्ठभूमि 59 में C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / जम्मू चूहों 46 backcrossing से व्युत्पन्न डी बी ए / 2J चूहों की एक substrain, का उपयोग करें। बीमारी या चोट के दौरान सीएनएस आक्रमण कर सकते हैं जो परिधीय monocytes और मैक्रोफेज, यह भी GFP टैग 15,46,47 व्यक्त करते हैं।

Neurodegenerative रेटिना में microglia की लाइव इमेजिंग अध्ययन

CSLO का उपयोग कर CX3CR1-GFP / + रेटिना की कोशिकाओं की हमारी vivo में ट्रैकिंग के लिए 10 सप्ताह 30-32,34,48 के लिए गंभीर चोट निम्नलिखित रेटिना + GFP सेल नंबर में परिवर्तन नजर रखी कि पिछले अध्ययनों पर बनाता है। यहाँ, हम CX3CR1-GFP / + microglia / जीर्ण मोतियाबिंद के प्रारंभिक प्रगति के दौरान रेटिना के मासिक cSLO इमेजिंग द्वारा सेलुलर संकल्प के साथ परिधीय monocytes कल्पना। एdditionally, हम पता लगाने और सेल का आकार बदलने यों में लाइव छवि स्वचालित दहलीज आधारित विश्लेषण का उपयोग करें और व्यक्तिगत आँखों के भीतर और व्यक्तियों को भर में सक्रिय है और कुल microglia मायने में बदलाव पर नजर रखने के लिए पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ remodeling।

रेटिना में + GFP microglia की cSLO इमेजिंग की तकनीकी सीमाओं

एक ही सत्र में प्राप्त बहु XY बिंदु छवियों (चित्रा 5) बनाम एकल की तुलना से यह साफ, जैसा कि हम इमेजिंग गुणवत्ता सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो पाया। हालांकि, सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य + GFP सेल इमेजिंग अधिग्रहण, एक ही सत्र में और समय के साथ, गंभीर रूप से बुध्न और प्रतिदीप्ति cSLO इमेजिंग के लिए स्थिर मापदंडों के चयन पर निर्भर करती है। CSLO उद्देश्य के लिए आंख और ऑप्टिक डिस्क के संरेखण संतृप्ति स्तर की एकरूपता और ब्याज 49 के confocal विमान पर फोकस निर्धारित करता है। गलत और / या गैर वर्दी SPECIFICATIसंतृप्ति स्तर के पर GFP का पता लगाने, autofluorescence पृष्ठभूमि, और सेल और कुंज संकल्प में artifactual रूपांतरों उत्पन्न कर सकते हैं। सही ढंग से तंत्रिका फाइबर और नाड़ीग्रन्थि सेल परतों के लिए स्थानीय microglia पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, यह पंक्ति और रेटिना की रक्त वाहिकाओं पर और आईआर बुध्न इमेजिंग द्वारा vitreal सतह पर axonal बंडलों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस एफए द्वारा GFP + कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक संदर्भ विमान प्रदान करता है। पिता के लिए आईआर से स्विचन के लिए आवश्यक आवश्यक refocusing की प्रत्येक प्रायोगिक सत्र में थोड़ा अलग गहराई (55-60 डी) में एकाधिक एफए छवियों के अधिग्रहण के द्वारा निर्देशित किया जा सकता है। यह भी उम्र के कारण, छात्र फैलाव और पैथोलॉजी (ऑप्टिक डिस्क उत्खनन) के लिए संरचनात्मक अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने में मदद कर सकते हैं। छवि संकल्प और सेल विस्तार बुध्न भर में संतृप्ति स्तर का इष्टतम विनिर्देश, और कैमरे से 49 नेत्र रिश्तेदार से सावधान संरेखण पर निर्भर करता है, छवि दृश्यों के साथ ग बुध्न आईआर छवियों दिखाना चाहिए एक ही आंख के लिए समय पर प्राप्तonsistent और तुलनीय ध्यान देते हैं, रोशनी, संकल्प और रेटिना क्षेत्र अवधि। एक ही सत्र (1.5-1.7 मिमी रेटिना के 2, एन = 13 retinas के आयु वर्ग के 3-5 महीने) में अधिग्रहण कर लिया छवियों में कुल + GFP सेल नंबर के मैनुअल में गिना जाता है cellularity (3-4% भिन्नता के अनुरूप और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा का ठहराव की पुष्टि की, डेटा नहीं दिखाया गया है)। छवियों दहलीज एक समान तीव्रता श्रेणी के आधार पर विश्लेषण, और समय के साथ परिवर्तन की तुलना के माध्यम से + GFP सेल विभाजन के लिए उत्तरदायी होने के लिए यह आवश्यक है।

थ्रेसहोल्ड और morphometric लाइव cSLO छवियों में रेटिना microglia की विश्लेषण करती है

हाल ही में, दो-फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा उच्च सेलुलर संकल्प के साथ मस्तिष्क microglia की इन विवो दृश्य microglial सोमा मानकों और प्रक्रिया पर मात्रात्मक विश्लेषण, और आकृति विज्ञान सक्रिय microglia 9,50 के भेदभाव के लिए सक्षम है। इन लेखकों द्वारा दिखाया गया है, somal आकार सबसे विशिष्ट रूपात्मक हैचलने का तीव्रता के आधार पर thresholding का उपयोग कर मस्तिष्क microglia, का जीना दो फोटॉन confocal इमेजिंग द्वारा समय पर पता लगाने योग्य पैरामीटर संकेत करने वाली शोर विविधताओं 9 को कम करने के लिए। इसके अलावा, somal आकार परिवर्तन सक्रिय कोशिकाओं 9 में Iba1 अभिव्यक्ति की upregulation के साथ सहसंबंधी। यहाँ, हम रेटिना के लिए स्थानीय CX3CR1-GFP + कोशिकाओं cSLO लाइव छवियों का उपयोग और कुल की संख्या यों के लिए morphometric विश्लेषण के बाद microglial कोशिकाओं और somata के तुलनीय अनुक्रमिक विभाजन लागू करते हैं और सक्रिय है।

हम केंद्रीय रेटिना में खंड GFP + कोशिकाओं को विशेष कोंफोकल प्रतिपादन सॉफ्टवेयर (FluoRender) का उपयोग करें। इन छवियों को आगे अंतत: स्वचालित विभाजन और somal क्षेत्र की दहलीज आधारित मात्रा का ठहराव अनुमति देने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध confocal छवि विश्लेषण पैकेज का उपयोग thresholded कर रहे हैं। हमारे जीने छवि लाइव छवि विश्लेषण 9 में microglial सक्रियण के एक रूपात्मक मीट्रिक के रूप में सोमा आकार के उपयोग की पुष्टि की विश्लेषण करती है। Somalपहले से पूर्व vivo छवि विश्लेषण 50 द्वारा प्रदर्शन के रूप दहलीज आधारित मायने रखता है, पैटर्न और रेटिना microgliosis में वृद्धि के लक्षण वर्णन की अनुमति दी। हम cSLO कोशिकाओं को एक ही कोंफोकल विमान पर imaged किया जा सकता है, जहां माउस केंद्रीय रेटिना (<2 मिमी 2), भीतर सबसे अच्छा संकल्प और विस्तार के साथ + GFP microglia का पता लगाता है कि लगता है। रेटिना परिधि की ओर, प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तनशीलता और चापलूसी केंद्रीय रेटिना में पता चला GFP + कोशिकाओं के लिए के रूप में समान इमेजिंग प्रसंस्करण और दहलीज विश्लेषण रोकने कि विकृतियों को दर्शाता है। अंत में, हमारे प्रोटोकॉल रेटिना microglia की cSLO इन विवो छवि विश्लेषण एक अपेक्षाकृत उच्च throughput प्रदान करता है कि पता चलता है। नेत्रहीन पृथक और केंद्रीय रेटिना के भीतर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि parenchymal microglial की संख्या 200-300 ~ के बीच कुल कोशिकाओं, और ~ 10-180 सक्रिय कोशिकाओं विविध। इस प्रकार, माउस रेटिना microglia डी vivo में अपने परिवर्तन और भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम जनसंख्या प्रदान करता हैneurodegeneration के रोगजनन uring।

अन्य सीएनएस पुराने रोगों के लिए आवेदन

यहाँ वर्णित इन विवो छवि विश्लेषण के तरीकों अन्य माउस रेटिना रोगों और चोट मॉडल में तीव्र या पुराना microglial परिवर्तन का आकलन करने के लिए लागू किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका इन रोगों 51-56 में neurodegeneration के लिए लक्षित कर रहे हैं यह देखते हुए कि इस तरह के अल्जाइमर, पार्किंसन और मल्टिपल स्क्लेरोसिस के रूप में पुराने सीएनएस विकृतियों, जिसके परिणामस्वरूप से रेटिना microglia / परिधीय monocyte परिवर्तन, मूल्यांकन करने के लिए सेवा कर सकता है। इस के साथ लाइन में, जल्दी अल्जाइमर रोग प्रबंधन के लिए रेटिना और ONH विकृति का जीना पता लगाने के उपयोग के गहन अध्ययन के 54,57,58 के अधीन है।

अंत में, हमारे निष्कर्ष रहते हैं, अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग और रेटिना microglia संख्या और रूपात्मक सक्रियण में परिवर्तन की मात्रा का ठहराव, के रूप में विश्वसनीय पूर्वोत्तर में सेवा कर सकता का सुझाव है किबायोमार्कर uroimaging रोग शुरू होने और जल्दी प्रगति का पता लगाने के लिए। ये vivo इमेजिंग और विश्लेषण पद्धति रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका को प्रभावित करने वाले अन्य neurodegenerative रोगों के लिए संभावित उम्र से संबंधित मोतियाबिंद के लिए लागू है, और।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

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चिकित्सा अंक 99 तंत्रिका विज्ञान microglia neurodegeneration मोतियाबिंद रेटिना ऑप्टिक तंत्रिका सिर confocal स्कैनिंग लेजर ophthalmoscopy लाइव छवि विश्लेषण thresholding द्वारा विभाजन सेल morphometry CX3CR1 डी बी ए / 2J
माउस ग्लूकोमा में Confocal Ophthalmoscopic इमेजिंग और सेल morphometry: neurodegeneration के दौरान रेटिना microglial सक्रियण <em>के</em> vivo गतिशीलता <em>में</em>
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. … More

Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

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