Summary
Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.
Abstract
Microglia, che sono le cellule del sistema nervoso centrale neuroimmune residenti, trasformano la loro morfologia e le dimensioni in risposta al danno del sistema nervoso centrale, il passaggio ad uno stato attivato con funzioni distinte e profili di espressione genica. I ruoli di attivazione della microglia in salute, infortuni e malattie rimangono completamente sconosciuto a causa della loro regolazione dinamica e complessa, in risposta ai cambiamenti nel loro microambiente. Pertanto, è fondamentale per monitorare in modo non invasivo e analizzare i cambiamenti nella attivazione della microglia nel tempo nell'organismo intatto. Studi in vivo di attivazione della microglia sono stati ritardati da limitazioni tecniche per rilevare il comportamento del microglia senza alterare l'ambiente del sistema nervoso centrale. Questo è stato particolarmente impegnativo durante la neurodegenerazione cronica, in cui i cambiamenti a lungo termine devono essere monitorati. La retina, un organo CNS suscettibili di non invasivo immagini dal vivo, offre un potente sistema di visualizzare e caratterizzare le dinamiche di attivazione della microglia durante disturbi cronici.
in vivo della microglia retina, con l'oftalmoscopia confocale (cSLO) e CX3CR1 GFP topi / + giornalista, di visualizzare microglia con risoluzione di cellulare. Inoltre, si descrivono i metodi per quantificare variazioni mensili attivazione delle cellule e la densità in grandi sottopopolazioni di cellule (200-300 cellule per retina). Confermiamo l'uso della superficie Somal come metrica utile per il monitoraggio in tempo reale di attivazione della microglia nella retina applicando automatizzato basato soglia analisi morfometrica delle immagini in vivo. Usiamo questi acquisizione delle immagini in tempo reale e analisi strategie per monitorare i cambiamenti dinamici nella attivazione della microglia e microgliosis durante le prime fasi di neurodegenerazione retinica in un modello murino di glaucoma cronico. Questo approccio dovrebbe essere utile per indagare i contributi di microglia al declino neuronale e assonale nei disturbi cronici del sistema nervoso centrale che colpiscono la retina e del nervo ottico.
Introduction
Microglia sono cellule neuroimmune che risiedono esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) dall'inizio dello sviluppo embrionale e per tutta l'età adulta. Dotato di un repertorio complesso di recettori, l'attività della microglia e l'eterogeneità regionale sono regolate dalla loro interazione bidirezionale con i neuroni vicini, glia, barriera emato-encefalica e infiltranti cellule neuroinfiammatori 1,2. Funzioni microgliali basali contribuiscono alla manutenzione e riparazione fisiologica, in quanto campione del loro territorio per perturbazioni nella omeostasi 3,4. Durante lesioni del SNC o malattia, microglia sono i primi soccorritori a segnali neuronali che poi scatenano la loro transizione verso un fenotipo reattiva, denominate "microglia 2,5-7 attivato. Attivazione Microglia comporta un ciclo complicato di espressione genica e di proteine, che sono accoppiati a soma cellulare e processo di ridimensionamento e ristrutturazione 6-9. Attivazione microglia, nonché ridistribuzione cellulare eclustering, può essere accompagnato l'aumento complessivo locale nel numero di cellule (microgliosis definito). Ciò può derivare da proliferazione cellulare e di auto-rinnovamento, con o senza assunzione di emoderivati monociti 3,4,7,10-14. In una vasta gamma di età-dipendente, malattie croniche del sistema nervoso centrale, sostenuta microgliosis e malattie parallela attivazione della microglia progressione 15-19. Come microglia neurodegenerazione impatto rimane poco chiaro, soprattutto perché giocano entrambi i ruoli neuroprotettive e deleteri che possono avere diversi contributi per l'insorgenza della malattia e la progressione. Studi di imaging dal vivo volti a comprendere la malattia cronica del sistema nervoso centrale hanno monitorato il comportamento microglia nel sistema nervoso centrale danneggiata di modelli animali e umani, e ha dimostrato che le alterazioni microgliali sono all'inizio rilevabili nelle fasi precoci della malattia 15-17,19,20. Pertanto, è fondamentale per sviluppare approcci per rilevare e monitorare l'attivazione della microglia in vivo.
Dete non invasivaction delle variazioni regionali in attivazione della microglia cerebrale è stato stabilito come un importante indicatore di vivo di progressione della malattia neurodegenerativa, utilizzando l'imaging molecolare o bioluminescenza e la tomografia ad emissione di positroni o la risonanza magnetica 18,21,22. Questi metodi di imaging molecolare e nucleare altamente quantitativi e non invasivi rilevano gliosi con delibera regionale. In alternativa, a due fotoni di imaging confocale in CX3CR1 GFP / + topo ha permesso l'osservazione della microglia cerebrali con una risoluzione cellulare 3,4,9,20,23-28. Tuttavia, questo approccio limita a lungo termine e l'osservazione ripetuta di alterazioni microgliali croniche, dato il potenziale rischio di disturbare il loro comportamento anche minimamente invasive procedure di imaging cerebrale 29. In alternativa, la retina offre condizioni ottimali per diretto, nella visualizzazione vivo e il monitoraggio ripetuto di microglia nella loro nicchia CNS intatto durante l'invecchiamento, a seguito di lesione acuta, epotenzialmente durante malattie neurodegenerative croniche. Così, studi recenti hanno dimostrato la fattibilità di imaging ad alta risoluzione della microglia retiniche esprimono GFP adattando il ophthalmoscopy confocale a scansione laser (cSLO) per immagini live CX3CR1 GFP / + topi. Questo è stato utilizzato per tenere traccia delle modifiche settimanali in numeri GFP + cellule nei topi individuale fino a 10 settimane dopo un trauma acuto indotto o ipertensione oculare 30-36.
Abbiamo esteso questo approccio per eseguire l'imaging a lungo termine per diversi mesi, e quantitativamente tenere traccia delle modifiche in attivazione della microglia in base alle dimensioni soma mediante analisi morfometrica. Dimensioni Somal è stata definita come una metrica utile di attivazione della microglia in studi di imaging dal vivo utilizzando due fotoni microscopia confocale a fette corticali di eseguire imaging in vivo di CX3CR1-GFP + microglia 9. Questi ed altri studi hanno anche dimostrato la correlazione tra le dimensioni Somal ei livelli di espressione della proteina Iba1, which aumenta anche con l'attivazione 9,37. Così, microglia attivato può essere identificato in topi vivi, e il loro numero e la distribuzione controllata nel tempo durante CNS salute e di malattia.
Questo protocollo descrive i metodi per l'acquisizione di immagini cSLO vivo e analisi per monitorare il numero di cellule microgliali, la distribuzione e l'attivazione morfologica durante cellule gangliari della retina (RGC) degenerazione (Figura 1). Così, questo studio utilizza: 1) un modello di topo di glaucoma ereditaria (DBA / 2J) che subisce età-dipendente del nervo ottico e neurodegenerazione della retina e mostra una notevole variabilità nella progressione della malattia tra i 5 ei 10 mesi di età 38,39, 2) mensile cSLO imaging in vivo per la visualizzazione a lungo termine delle cellule GFP + nella retina e del nervo ottico amieliniche di eterozigoti CX3CR1 GFP + / DBA / 2J topi di età compresa tra 3-5 mesi, 3) analisi delle immagini dal vivo di segmentazione e soglia per isolare somata cellulare e misura ilzona ir. Queste strategie sono applicati per valutare la cinetica di retina stati di attivazione della microglia durante le prime fasi del glaucoma cronico.
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Protocol
In vivo l'imaging viene eseguito in strutture esenti da organismi patogeni utilizzando protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università dello Utah.
NOTA: Questo protocollo di imaging viene utilizzato per topi reporter in cui microglia retina e infiltranti monociti / macrofagi esprimono verde fluorescente proteina (GFP) sotto il controllo del locus recettore fractalkine (CX3CR1).
1. In Vivo Imaging di retina GFP + Microglia da confocale a scansione laser oftalmoscopia (cSLO)
- Accendere il sistema di riscaldamento controllato di acqua, set per stabilizzare la temperatura del mouse tra 35-37 ° C durante la procedura, e collegare due rilievi di riscaldamento.
- Avviare il sistema oftalmoscopio confocale a scansione laser (cSLO) (Figura 2A). Aprire il programma cSLO, inserire le informazioni che identificherà l'individuo del mouse e impostare una curvatura corneale di 2 mm (menu Dati paziente).
- Prepararsi per imaGing. Trovare e montare un pulito 55º grande campo obiettivo sul suo socket. Preparare la piattaforma di imaging oftalmoscopio assicurando una piastra elettrica coperta di carta pulito. Utilizzare clip per appiattire il pad e carta e tenerli da bloccare il movimento della lente obiettivo.
- Anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di 1,3% 2,2,2-tribromoethanol e 0,8% di alcol tert-amil (250 mg / kg di peso corporeo; 0,5 ml / 25 g di peso corporeo) usando un ago 30½ G montato un monouso 1 ml siringa. Ritorna il mouse alla sua gabbia, mantenuto su una piastra elettrica.
NOTA: La consegna del anestetico per iniezione contro l'inalazione permette un più facile posizionamento del mouse per l'imaging e l'accesso senza ostacoli agli occhi, senza coni d'ogiva e tubi. - Una volta che l'animale si ferma e non risponde alla coda pizzico, indurre la dilatazione della pupilla con Tropicamide e fenilefrina (0,5% ciascuno), posizionando l'animale prona e copre entrambi gli occhi con le gocce per 7 min.
- Dopo 5 min, pmerletti il mouse prono sul centro della piattaforma oftalmoscopio, e le lenti a contatto in forma su entrambi gli occhi, applicando una pressione minima.
NOTA: Le lenti a contatto sono piccole e fragili, ma possono essere maneggiati con cura con le dita, anche se pinze possono essere utilizzati al posto di 40. L'uso di lenti a contatto è facoltativo, ma raccomandato in quanto minimizza secchezza oculare e conserva trasparenza corneale durante l'imaging. - Dopo 7 min, orientare il mouse con l'occhio destro verso la lente obiettivo e l'orbita parallela alla lente obiettivo, mantenendo l'animale non frenato vicino al bordo della piattaforma (Figura 2B). Per raccogliere le immagini di saturazione e orientamento comparabili, mantenere costante la distanza dall'occhio alla lente obiettivo, nonché l'allineamento dell'occhio al percorso di luce durante sessioni di imaging. Clip lunghi baffi che interferiscono con l'osservazione dell'occhio.
NOTA: Per il prossimo 8-10 minuti, il mouse non si muove o lampeggia, e sarà il respiro con movimento dolcementi, che sono monitorati dal cSLO eye-tracking ART modalità (automatica in tempo reale), che regola la posizione della testa di scansione basato su punti di riferimento del fondo oculare ad alto contrasto. Passato quel tempo, i topi cominciano ansimando e lampeggiante, rendendo l'imaging impraticabile. - Se l'imaging viene eseguito senza l'utilizzo di lenti a contatto, applicare PBS gocce in entrambi gli occhi ogni 2-3 min per impedire loro di essiccazione.
- Raccogliere una immagine fundus del sistema vascolare della retina e del nervo ottico, si è concentrata sulla retina interna.
- Selezionare la modalità a infrarossi (IR) e regolare le impostazioni di 820 nm di eccitazione, potenza laser 100%, 40-60% di sensibilità (Figura 2C).
- Lavorare in modalità ad alta velocità (12,6 frame / sec), individuare l'occhio utilizzando il joystick per guidare l'oftalmoscopio. A basso ingrandimento, controllare la cornea e la lente di lesioni o l'opacità, ed escludere dagli occhi di studio con difetti o lesioni che interesseranno l'imaging della retina (Figura 3A).
- Individuare la zona disco ottico (la superficie ditesta del nervo ottico, ONH) portando l'obiettivo più vicino all'occhio, poi centrare l'immagine su di esso e bloccare tale posizione avvitando il joystick. Questo allineamento degli occhi al oftalmoscopio è la chiave per ottenere una buona messa a fuoco e le emissioni attraverso l'immagine.
- Visualizzare i piani interni della retina, così come l'ONH, utilizzando i principali vasi sanguigni situati sulla superficie vitreale della retina come un piano di riferimento focale (59 e 60 D), o più in profondità (55 D) in occhi mostrando ottica scavata dischi. La messa a fuoco ottimale dovrebbe risolvere circolanti globuli entro vasi sanguigni principali, con il loro lume e le pareti nettamente distinte.
- Ottimizzare la saturazione dell'immagine regolando la manopola sul pannello di controllo touch screen, fino a quando un alone bianco di illuminazione uniforme si estende in gran parte del campo 55º fondo attorno al disco ottico (con una leggera sovraesposizione). Successivamente, abbassare la saturazione per ottimizzare il contrasto fino a quando le cellule del sangue che si spostano lungo le principali vasi possono essere chiaramente risolti. Se scuro focalearee persistono, non a causa di danni alla retina, riallineare l'occhio alla telecamera fino a quando l'immagine uniformemente luminoso si ottiene. Questa regolazione è fondamentale per catturare insiemi riproducibili di immagini in posizione e qualità.
- Raccogliere un'immagine IR ad alta risoluzione della retina centrale (1.4-1.7 mm di diametro, a seconda dell'età), con una media di 30 fotogrammi in tempo reale (4,7 fotogrammi / sec; normalizzato), per migliorare il rapporto segnale-rumore (Figura 2D ).
- Immediatamente, acquisire una immagine di fluorescenza di GFP + microglia e / o monociti infiltranti localizzate ai piani interni della retina e il TNO.
NOTA: Ottimizzazione dell'immagine fundus IR della retina determina la risoluzione dell'immagine di fluorescenza di cellule GFP +, nonché l'estensione della retina interna attraversato. La mancata messa a fuoco piani interiori della retina, che può essere rilevato da una cattiva risoluzione del sistema vascolare, si tradurrà in vista GFP + cellule soffuse (Figura 3B). Mancato adeguamento IR saturazione corretta e uniforme colpisce l'immagine di fluorescenza (FA), introducendo variazioni artefatti in GFP + intensità delle cellule e la dimensione (Figura 3C).- Swich a fluorescenza modalità di imaging (FA) sul pannello touch screen, usando blu, di eccitazione 488 nm laser (460-490 nm set di filtri di barriera), e le impostazioni di acquisizione (sensibilità potenza del laser e 100-125% al 100%), che sono mantenute costante per tutti i topi (figura 2E).
- Raccogliere un singolo xy-punto, l'immagine di fluorescenza bidimensionale della retina, e cattura immediatamente l'immagine del fondo oculare in posizione identica (100x media scansione; 55º angolo di scansione per entrambe le immagini; Figura 2F).
- Acquisire un'immagine multipunto selezionando "composito" nel pannello di controllo (Figura 2G) e lo spostamento a destra ea sinistra oftalmoscopio, panning la retina attraverso l'asse nasale-temporale (Figura 2H).
NOTA: Dopo la scansione di una singola immagine xy-point (100x spuò media), il software automaticamente medie nuove scansioni degli stessi e delle nuove aree (circoscritte con un cerchio verde durante la scansione ottimale, o rosso quando la scansione è irrealizzabile), e punti tutti xy posizioni in tempo reale. L'immagine composita risultante estende 1,5-1,7 mm sull'asse orizzontale x 3-4 mm sull'asse verticale (55 ° x 120-124º angolo di scansione).
- L'imaging completa di ogni mouse entro 15 minuti dopo l'induzione dell'anestesia, prima di lampeggiare e la ripresa del moto.
- Rimuovere le lenti a contatto, occhi idrato con PBS e rispedire l'animale verso la sua gabbia riscaldato, controllando il comportamento fino al completo recupero della motilità.
- Per gli studi longitudinali utilizzando sessioni cSLO imaging intermittenti nel mouse stesso individuo, ripetere l'imaging non meno di 3 giorni di distanza per evitare la tossicità cumulativa di anestesia, così come irritazione corneale.
2. live Image Processing and Analysis
- Allineamento dell'immagine sequenziale:
- Allinearele immagini fundus per una serie temporale dello stesso occhio con il sistema vascolare e disco ottico come punti di riferimento. Aprire tutte le immagini in un programma di presentazione slide-show commerciale, trascinando ogni immagine il precedente finché i loro dischi ottici allineano sul piano xy (l'immagine in alto appare semi-trasparente mentre viene trascinato), quindi ruotare l'immagine in alto fino alla sua grandi vasi sanguigni si sovrappongono con il sistema vascolare sull'immagine qui sotto (messa a fuoco su navi più lontano dal disco ottico). Registrare l'angolo di rotazione per ogni immagine e salvare questa serie tempo per riferimenti futuri, tenere traccia di mouse e occhi identità.
- Allineare la corrispondente serie di immagini di fluorescenza xy-point singoli applicando l'angolo registrato per correggere la rotazione xy ad ogni tempo, utilizzando un programma di raster editor grafico. Inoltre, regolare la risoluzione a 300 dpi (senza ridimensionamento) e lo sfondo (in modalità RGB, selezionare Livelli e assaggiare il lume di un vaso sanguigno come il nero). Salvare queste immaginicome file TIF, aggiungendo "allineato" ai loro nomi.
- Segmentazione cellule microgliali:
- Per identificare GFP + cellule della retina centrale, aperta nel FluoRender il "allineato" di file TIF corrispondente al primo punto di tempo / età. Ingrandisci l'immagine per adattarla allo schermo, quindi definire la vista Render (composita, ortogonali, interpolati) e le sue proprietà (0.58 gamma, 255 punto di saturazione, luminosità 255, 195 alfa e 1,00 ombreggiatura), selezionando entrambi i canali RG come visibile (nascondi canale B con un doppio clic su di esso nel frame di lavoro; la figura 4A).
- Per selezionare singole celle, soglia canale rosso (deve essere evidenziato sul telaio di lavoro), aumentando la soglia bassa fino la maggioranza delle cellule sono mascherati (bianco) con processi sovrapposizione minima e cellulari (ciano), mantenendo la soglia alta costante (255). Il valore di soglia bassa varia tra 100 e 170, a seconda dell'intensità di fluorescenza (Figura 4B </ Strong>).
- Salva questo punto di vista con il canale rosso visibile solo (comando Cattura) come un nuovo file TIF, aggiungendo "cellsegm" al suo nome originale (Figura 4C). Utilizzando un raster generico software editor grafico, invertire la sua scala di grigi e regolare la risoluzione a 300 dpi di cui sopra, e salvare di nuovo come RGB (Figura 4D).
NOTA: Eliminare le cartelle (progetti) creati automaticamente da FluoRender, e salvare il limite applicato per riferimento futuro.
- Segmentazione soma microglia e morfometria:
- Per identificare GFP + somata cella per l'area di quantificazione, di utilizzare l'immagine software di analisi con le misurazioni automatiche di intensità e capacità di soglia, così come basato su soglie conteggio oggetti e misurazione. Aprire il file TIF "cellsegm", e selezionare il metodo di modifica della scala (spline) e il canale rosso (fare clic sulla scheda rossa in RGB). Migliorare la visualizzazione deselezionando "canale vista a colori" (fare clic con il rosso RGScheda B), e selezionando "complemento colori" (Immagine / Regola immagine) di invertire la scala di grigi e vedere le celle in grigio / nero su sfondo bianco (figura 4E).
- Calibrare l'immagine di 1,4-1,7 mm a seconda dell'età, tracciando una linea orizzontale attraverso l'intera immagine (Calibrazione, Calibrazione rapida).
- Segmento somata singola cella applicando thresholding intensità (Figura 4B). Per questo, il lavoro sul canale RGB rosso e aprire la funzione di soglia Intensità (Conte Object, selezionando il comando "update count"), al fine di monitorare i parametri bidimensionali per ogni regione thresholded di interesse (ROI) in rappresentanza somata individuale.
- Definire la soglia di intensità nell'istogramma intensità, selezionando il più basso 50-60% dei livelli 255, e raffinare il valore di soglia finale valutando visivamente la sovrapposizione fra la maschera colore soglia (blu) e il perimetro soma cellulare (grigio) in singole cellule (FIGURA 4E).
- Stimare l'esattezza delle maschere soma cella per rappresentare le dimensioni Somal misurando l'area prima e dopo la segmentazione in 10 celle e accettare la gamma soglia selezionata se le misure differiscono meno del 10% (utilizzare la barra degli strumenti Binary e misure annotati).
- Individuare manualmente ROI Somal che includono più celle e separano questi elementi (eliminare o ROI separati utilizzando i controlli binario della barra degli strumenti, o il catalogo di oggetti), mentre commutazione on / off del binario di visualizzare direttamente le cellule (Figura 4F).
- Classificare cellule microgliali come ROI con aree Somal più grande e più piccolo di 50-60 micron 2 a discriminare somata cella corrispondente al microglia attivata e disattivata microglia, rispettivamente, utilizzando area soggetta a restrizioni.
NOTA: Ogni sottoinsieme Somal cella è identificata con un diverso livello binario pseudocolored, e può essere ulteriormente caratterizzata per altri parametri morfologici (perimeter, circolarità, ecc), così come quantificato in settori retinici discreti (Figura 4G). Salvare l'immagine analizzata come file ND2. - Verificare che il processo e la complessità ramificazione in singole cellule microgliali attivate, sovrapponendo la maschera Somal e l'immagine -point singolo xy (contrasto aumentato del 50%; la figura 4H). Contare manualmente i processi che si estendono direttamente dal soma cellulare o misurare il diametro del poligono che comprende il pergolato (utilizzare la barra degli strumenti Binary e misure annotati).
NOTA: Attivato cellule mancano di processi o portano pochi (<4) e corto (<2x diametro Somal) quelli, in contrasto con i processi non attivati cellulari, che comprendono un pergolato ramificata ed estesa (> 3-10x diametro Somal) relativamente circonda il loro piccolo soma. - Individuare manualmente le cellule con l'espressione somata inferiori a <20 micron 2 e / o GFP sotto del limite di rilevazione, che sono quindi inosservato da intensity soglia. Utilizzare il comando Tassonomia di annotazioni per contare gli elementi identificati manualmente.
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Representative Results
I nostri recenti studi in vivo utilizzati questi metodi di acquisizione di immagini e di analisi in tempo reale di visualizzare e monitorare la cinetica e modelli di ONH e cambiamenti microgliali retina durante le prime fasi di glaucoma cronico e il loro rapporto alla fine di neurodegenerazione 59. Qui illustriamo un protocollo di acquisizione delle immagini cSLO per visualizzare cellule microgliali in una vasta area della retina centrale di singoli giovani eterozigoti CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figura 5). Basandosi sulla risoluzione elevata cellulare, applichiamo immagine dal vivo thresholding e analisi morfometrica che permettono la segmentazione automatica dei singoli GFP + cellule e somata (Figura 6).
Per monitorare lo sviluppo di microgliosis locale e / o l'attivazione della microglia in epoche precedenti neurodegenerazione rilevabile in questo modello di glaucoma cronico, abbiamo misurato le variazioni mensili della densità totale delle cellule microgliali nei singoli giovane eterozigote Cx3CR1-GFP DBA / 2J retine (n = 10) tra 3-5 mesi di età (Figura 7A). Coerentemente con la progressione variabile della neurodegenerazione in singoli occhi 41-44, la nostra analisi rivela livelli variabili di attivazione della microglia retina e microgliosis attraverso gli occhi ad ogni età (Figura 7B), e rileva i cambiamenti dinamici nella densità del totale e microglia attivati all'interno delle singole retine (Figura 7C). Notevolmente, il numero di microglia attivata sono disaccoppiati da modifiche simultanee in totale GFP + densità cellulare. Questi risultati in vivo confermano precedente ex vivo analisi dei cambiamenti microgliali in DBA / 2J topi 45. Così cSLO rilevazione e misura di retina attivazione della microglia dal vivo possono servire come indicatori di progressione della malattia precoce nei singoli occhi, e possono potenzialmente essere legata a eventi scatenanti di glaucoma patogenesi.
Figura 1:. Acquisizione diretta di immagini, l'elaborazione e l'analisi del flusso di lavoro cSLO è stata utilizzata per immagini in centinaia di cellule GFP + monociti periferici microglia / localizzate al centro ~ 1,7 millimetri 2 della retina interna del mouse. Immagini di fluorescenza (FA) sono stati acquisiti al mese per gli stessi topi, e allineati con infrarossi immagini (IR) del fondo oculare della vascolarizzazione della retina e la superficie vitreo come riferimento. Segmentazione di GFP + cellule e somata risultato di applicazione di due fasi distinte di intensità-soglia di FA immagini retiniche. Analisi morfometrica del binario che rappresenta somata cella permesso misurazione delle superfici Somal individuali. Cellule GFP + con area Somal superiore a 50 micron 2 sono stati classificati come attivi. Densità di GFP + cellule totali e attivate è stata misurata per le singole immagini FA retina, e l'esame di estensione pergolato e della complessità ramificazione è stata eseguita mediante osservazione diretta delle immagini FA.
Figura 2: controlli in diretta di acquisizione di immagini in cSLO Spectralis (A) display del pannello touch screen manuale a iniziazione.. (B) finestra di imaging software cSLO, che mostra la testa di un topo vivo. (C) Le impostazioni selezionate per l'imaging a raggi infrarossi (illuminato in blu). (D) immagine Fundus della retina durante l'acquisizione in tempo reale (pannello di sinistra) e media (pannello di destra). Comando normalizzazione indicato con cerchio nero. Arterie e le vene che si irradiano dalla testa del nervo ottico sono visibili (tra parentesi), così come le ottiche fasci assonale (frecce) tra i vasi sanguigni. (E) Impostazioni selezionate per l'imaging di fluorescenza all'interno di un unico punto di xy. (F) a un punto di fluorescenza (FA, 488 nm) per immagini durante l'acquisizione (media). Tegli immagine più piccola (a sinistra) mostra una scansione individuale, l'immagine più grande (a destra) mostra lo stato di avanzamento di media intensità. (G) Impostazioni selezionate per l'acquisizione di un multipunto (composito), l'immagine di fluorescenza. (H) Multipoint acquisizione imaging di fluorescenza, che mostra la scansione in corso, che il software identifica con un cerchio verde (o rosso se l'acquisizione non è possibile). Bar Scala rappresentano ~ 5 mm (B) o 250 micron (DH) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. .
Figura 3: difetti oculari chiave ed errori di imaging che possono impedire l'imaging corretta cSLO di cellule microgliali (A - C) danni o difetti Ocular, nonché errore acquisizione dell'immagine.s può impedire l'imaging affidabile di cellule GFP + localizzati ai piani più intimi della retina. (A) alcuni difetti grossolani occhi sono facilmente rilevabile nelle immagini del fondo oculare, tra corneale o opacità del cristallino, o lesioni e di approfondimento della zona disco ottico, ognuno dei quali prevenire chiaro imaging GFP + cellule. (B) di messa a fuoco o sopra (le pareti dei vasi diventano indistinguibili dal lume) o sotto la superficie interna della retina (vasi sono appena visibili) riduce la rilevabilità di emissione di fluorescenza GFP da cellule situate in corrispondenza della cella fibra nervosa e ganglion strati. Livelli (C) Saturazione in modo errato o in modo non uniforme impostati possono provocare immagini brillanti, ma troppo saturi (con le cellule prive di risoluzione) o immagini con aree oscurate. Bar Scala rappresenta 250 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Binary quantificazione basata soglia-di conta delle cellule microgliali e zona Somal (A - D) Procedura di segmentazione cellulare in FluoRender (A) Finestra di navigazione con vista renderizzata di una fluorescenza un'immagine rappresentativa unico punto della microglia all'interno della retina centrale.. (pannello superiore); corrispondente proprietà di rendering (in basso). (B) La stessa immagine durante una routine di segmentazione delle cellule, visto come RGB, con le corrispondenti impostazioni di soglia (pannelli inferiori). Cellule thresholded sono rappresentati da pixel bianchi e sovrapposti per i loro processi in ciano. (C) L'immagine di maschere di cellule ottenute dopo la segmentazione delle cellule. (D) maschera precedente con i valori in scala di grigi invertite per l'ulteriore elaborazione delle immagini. (E - H) Fasi di Somal soglia e quantificazione. (E) L'uso di soglia intensità per somata segmento microglia in base alla loro segmentazione cella precedente. L'istogramma intensità RGB (sinistra) permette soglia mediante selezione diretta della bassa gamma 50-60% di intensità (da 0 a 127-153). Questa segmentazione crea una maschera quantificabile che isola somata microglia individuale (blu). Le immagini vengono riscalati utilizzando la funzione spline (ovale a destra). (F) Misure automatiche basate soglia-dei singoli ROI / somata (pannello superiore) e sagome ROI (Catalogo oggetto, pannello inferiore) utilizzati per correggere ROI sovrapposizioni con strumenti di binari (pannello di destra) per la separazione manuale o erosione. (G) Classificazione delle aree Somal singole da area soggetta a restrizioni (pannello in alto a sinistra). Somata segmentato sono classificati come ROI più piccoli e più grandi di 50-60 micron 2, e gli strati binari per ciascuna classe di somata vengono assegnati diversi pixel a colori (verde unnd magenta, rispettivamente). (H) Sovrapposizione del somata segmentato (verde) sull'immagine originale (con un aumento di contrasto) utilizzato per l'osservazione diretta della complessità dei processi nelle cellule attivate singole (pannello di sinistra). Vista pergole cellulari ingrandita. Bar Scala rappresentano 250 micron (AH) o 50 micron (H, nel riquadro). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: ad alta risoluzione visualizzazione di CX3CR1- GFP + microglia / monociti localizzato al mouse retina interna da confocale in diretta delle immagini a scansione laser (A) Singolo punto xy immagine cSLO mostrando GFP + cellule all'interno del centro. retina in due mesi topo vecchio DBA / 2J (a sinistra). Visualizzazione ingrandita (a destra) che mostra l'area ONH (cerchio), vasi sanguigni (linee) allineato con microglia perivascolare / macrofagi e microglia parenchimale piastrelle della retina centrale. Immagine (B) Multipoint, raccolto subito dopo il punto singolo di visualizzare microglia in una zona più ampia della retina (⅓ della retina). (C, D) immagini identiche, mostrate con scala di grigi invertita per l'osservazione ottimale della morfologia cellulare e la complessità (minimamente adeguati per il contrasto e la risoluzione). Dimensioni Somal e la forma possono essere risolti nella maggior parte delle cellule (a sinistra). Estensione Arbor e ramificazione di cellule possono essere risolti nelle cellule con grande somata (a destra, e 3 singole cellule). (E) immagine fondo infrarosso del disco vascolare e ottico utilizzato per xy allineamento -plane di immagini in sequenza. Bar Scala rappresentano 250 micron (A, B ed E), e 25 micron (C, a destra).es / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Segmentazione di cellule microgliali e somata (A) GFP + cellule rese da segmentazione in 2D utilizzando FluoRender. (B) somata cella corrispondente, rilevato da thresholding utilizzando immagine confocale software di analisi. (C) maschera binaria di cellula somata suscettibili di analisi quantitativa. (D) La classificazione di somata cella segmentato per area di discriminare attivare cellule della microglia (> 50-60 micron 2, magenta), e le cellule non attivate (<50 micron 2, verde). Cellule Dim e piccole (<10-20 micron 2, asterisco giallo) sono identificati manualmente l'immagine originale con scala di grigi invertita (
Figura 7:. Il monitoraggio longitudinale della densità di cellule microgliali e l'attivazione di giovani DBA / 2J retine (A) Vivere cSLO fundus e immagini FA dello stesso occhio, acquisito da 3-5 mesi di età. Immagini FA sequenziali sono stati usati per quantificare i cambiamenti nel corso del tempo in numero totale di CX3CR1-GFP + cellule localizzate all'interno della centrale ~ 1,7 millimetri 2 di retina. Conti inclusi parenchimale e microglia perivascolare, ma le cellule esclusi raggruppate nella TNO (posizione indicata con cerchio bianco). (B) Analisi timecourse di retina densità cellulare microglia e l'attivazione a epoche precedentineurodegenerazione in DBA / 2J glaucoma cronico (n = 10 retine per età). Numero di cellule GFP + totale e delle cellule microgliali attivate (area Somal> 50 micron) per 2 mm 2 di retina centrale. Ciascun punto di dati rappresenta una singola retina, e mezzi per ogni età sono rappresentate con una linea orizzontale. (C) il monitoraggio mensile dei numeri di cellule GFP + totale e delle cellule microgliali attivate in un singolo retina. Ci sono cambiamenti paralleli ma quantitativamente differenti in densità totale e cellule attivate, con variazione dinamica della densità delle cellule morfologicamente attivate. Bar Scala rappresenta 250 micron (A). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Monitoraggio in tempo reale del numero di cellule microgliali e l'attivazione morfologica durante una malattia neurodegenerativa richiede l'uso di metodi di imaging non invasive che consentono la visualizzazione dettagliata delle funzioni cellulari. Dopo l'imaging, le cellule microgliali devono essere isolati (segmentato) per l'analisi morfometrica utilizzando più passaggi di soglia per valutare le dimensioni Somal e / o la complessità di processo come letture per l'attivazione della microglia. In questo protocollo, si descrivono i metodi per l'acquisizione di immagini dal vivo con cSLO, e l'analisi quantitativa di attivazione della microglia basata su cellule sequenziale e la segmentazione soma. Applichiamo queste strategie per valutare la cinetica di attivazione microglia retina e microgliosis più di 2 mesi nel contesto di una malattia neurodegenerativa cronica della retina.
Topi Reporter e microglia / monociti periferici tipi di cellule
L'uso di topi che esprimono GFP sotto il controllo del recettore fractalkine (CX3CR1)locus 46 consente l'identificazione certa della microglia residente, e l'espressione della GFP robusto consente notevole nella visualizzazione vivo 30-32,34,36. Qui, usiamo un sottoceppo di DBA / 2J topi, derivato da backcrossing C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J topi 46 nel DBA / 2J background genetico 59. Monociti e macrofagi periferici, che possono infettare il sistema nervoso centrale durante la malattia o infortunio, esprimono anche il tag GFP 15,46,47.
Studi di imaging dal vivo della microglia nella retina neurodegenerativa
Il nostro monitoraggio in vivo di CX3CR1-GFP / + cellule retiniche con cSLO si basa su studi precedenti che ha monitorato i cambiamenti nella retina GFP + il numero di cellule seguenti trauma acuto per un massimo di 10 settimane 30-32,34,48. Qui, visualizziamo CX3CR1-GFP + / microglia / monociti periferici, con risoluzione di cellulari, da cSLO immagini mensile della retina durante la prima progressione del glaucoma cronico. Ladditionally, usiamo un'immagine live automatizzato di analisi basato su soglie di rilevare e quantificare il ridimensionamento delle cellule e rimodellamento con sufficiente risoluzione spaziale e temporale per monitorare i cambiamenti nella conta microglia attivate e totale all'interno dei singoli occhi e tra gli individui.
Limitazioni tecniche di cSLO imaging GFP + microglia nella retina
Abbiamo trovato qualità dell'immagine per essere coerente e riproducibile, come illustrato da un confronto delle immagini unica o punto XY multi ottenuti in una singola sessione (Figura 5). Tuttavia, l'acquisizione e riproducibile GFP + cellule di imaging, in una singola sessione e nel tempo, è criticamente dipendono dalla scelta dei parametri stabili per l'imaging fundus e fluorescenza cSLO. Allineamento dell'occhio e ottico disco per l'obiettivo cSLO determina l'uniformità dei livelli di saturazione e la messa a fuoco sul piano confocale di interessi 49. Imprecise e / o CARATTERISTICHETECNIC non uniformesu di livelli di saturazione in grado di generare variazioni artefatti di rilevamento GFP, autofluorescenza sfondo, e la cella e la risoluzione pergolato. Per mettere a fuoco correttamente microglia localizzate per la fibra nervosa e strati di cellule gangliari, è fondamentale per allineare e concentrarsi sui vasi sanguigni della retina e fasci assonale in superficie vitreale da immagini fundus IR. Questo fornisce un piano di riferimento per individuare la GFP + cellule FA. La rifocalizzazione richiesta necessaria per il passaggio da IR FA può essere guidato con l'acquisizione di immagini multiple FA a leggermente diverse profondità (55-60 D) in ogni sessione sperimentale. Questo può anche aiutare a compensare le differenze anatomiche a causa dell'età, dilatazione della pupilla e la patologia (ottico scavo disco). Poiché risoluzione dell'immagine e dettaglio cellule dipende dalla specifica ottimale dei livelli di saturazione in tutto il fondo, e allineamento preciso dell'occhio rispetto alla telecamera 49, sequenze di immagini acquisite nel tempo per lo stesso occhio deve mostrare immagini fundus IR con consistent e comparabili messa a fuoco, l'illuminazione, la risoluzione e la durata campo retinico. Conteggi manuali di numeri totali GFP + cellule nelle immagini acquisite in una sola seduta (1,5-1,7 mm 2 di retina, n = 13 retine, di età compresa tra 3-5 mesi) ha confermato la quantificazione e riproducibile dei cellularità (3-4% di variazione; dati non mostrato). Ciò è necessario per le immagini siano suscettibili di GFP + segmentazione cellulare tramite analisi di soglia sulla base di una gamma di intensità simile, e il confronto delle variazioni nel tempo.
Soglia e morfometriche analisi della microglia retinica in immagini in diretta cSLO
Solo recentemente, la visualizzazione in vivo della microglia cerebrali con alta risoluzione cellulare da due fotoni microscopia confocale ha permesso l'analisi quantitativa dei parametri di processo e soma microgliali, e la discriminazione delle microglia morfologicamente attivato 9,50. Come dimostrato da questi autori, le dimensioni Somal è il morfologica più cospicuaparametro rilevabile nel tempo da vivere a due fotoni di imaging confocale di microglia del cervello, usando iterativa soglia basata intensità per ridurre le variazioni del segnale-rumore 9. Inoltre, i cambiamenti di dimensione Somal correlazione con upregulation dell'espressione Iba1 in cellule attivate 9. Qui, usiamo cSLO immagini dal vivo e applichiamo paragonabile segmentazione sequenziale delle cellule microgliali e somata, seguiti da analisi morfometrica per quantificare il numero di totale e attivato le cellule CX3CR1-GFP + localizzate alla retina.
Usiamo software di rendering confocale specializzata (FluoRender) per GFP + cellule segmento nella retina centrale. Queste immagini, sono ulteriormente thresholded utilizzando un pacchetto di analisi di immagine confocale disponibile in commercio, per consentire infine la segmentazione automatica e basata soglia quantificazione dell'area Somal. La nostra immagine dal vivo analisi ha confermato l'uso del formato soma come metrica morfologica di attivazione della microglia in analisi di immagini dal vivo 9. Somalconteggi basati soglia-permesso la caratterizzazione di modelli e aumenti microgliosis retina, come già dimostrato da ex-vivo immagine analisi 50. Troviamo che cSLO rileva GFP + microglia con la migliore risoluzione e dettaglio entro il topo retina centrale (<2 mm 2), in cui le cellule possono essere esposte allo stesso piano confocale. Verso la periferia della retina, il segnale di fluorescenza mostra variabilità e distorsioni che impediscono l'elaborazione di immagini identiche e analisi soglia per cellule GFP + identificati nella retina centrale piatta. Infine, il nostro protocollo mostra che cSLO in vivo analisi delle immagini della microglia retinica offre un rendimento relativamente elevato. Il numero di parenchimale microglia che potrebbe essere visivamente isolato e quantificato all'interno della retina centrale varia tra ~ 200-300 cellule totali, e ~ 10-180 cellule attivate. Così, il mouse microglia retina offre una popolazione ottimale per studiare in vivo la loro trasformazione e ruoli durante la patogenesi della neurodegenerazione.
Applicazione di altre malattie croniche del sistema nervoso centrale
I metodi in vivo di analisi delle immagini qui descritte dovrebbero essere applicabili per valutare i cambiamenti microgliali acute o croniche in altre malattie della retina di topo e modelli pregiudizio. Inoltre, questo protocollo può servire per valutare le variazioni microglia / monociti periferici retina derivanti da patologie del sistema nervoso centrale croniche, come l'Alzheimer, il Parkinson e la sclerosi multipla, dato che la retina e del nervo ottico sono mirati per neurodegenerazione in queste malattie 51-56. In linea con questo, l'uso della rilevazione diretta della retina e ONH patologia per la gestione della malattia di Alzheimer precoce è in fase di intenso studio 54,57,58.
In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che in tempo reale, il monitoraggio longitudinale e quantificazione dei cambiamenti nei numeri microglia retina e l'attivazione morfologica, possono servire ne affidabiliuroimaging biomarcatori per rilevare l'insorgenza della malattia e l'inizio di progressione. Questi in vivo metodologia di imaging e di analisi si applica a glaucoma legate all'età, e potenzialmente di altre malattie neurodegenerative che influenzano la retina e del nervo ottico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
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