Summary
Mikroglia aktivering og microgliosis er viktige svar på kronisk neurodegenerering. Her presenterer vi metoder for in vivo, langsiktig visualisering av netthinnens CX3CR1-GFP + mikrogliaceller cellene ved confocal ophthalmoscopy, og for terskel og morfometrisk analyser for å identifisere og kvantifisere deres aktivering. Vi overvåker mikrogliaceller endringer under tidlige stadier av aldersrelatert glaukom.
Abstract
Mikroglia, som er CNS-resident neuroimmune cellene, omforme deres morfologi og størrelse som svar på CNS skader, bytter til en aktivert tilstand med forskjellige funksjoner og genekspresjonsprofiler. Rollene til microglial aktivering i helse, skade og sykdom forblir ufullstendig forstått på grunn av deres dynamiske og komplekse regulering i respons til endringer i mikromiljøet. Dermed er det viktig å ikke invasiv overvåke og analysere endringer i microglial aktivering over tid i den intakte organisme. In vivo studier av microglial aktivering har blitt forsinket av tekniske begrensninger for å spore microglial atferd uten å endre CNS miljøet. Dette har vært spesielt utfordrende ved kronisk neurodegenerering, der langsiktige endringer må spores. Netthinnen, en CNS organ mottagelig for non-invasiv levende avbildning, tilbyr et kraftig system for å visualisere og karakterisere dynamikken i mikroglia aktivering under kroniske lidelser.
in vivo avbildning av retinal microglia, ved hjelp av konfokal ophthalmoscopy (cSLO) og CX3CR1 GFP / + reporter mus, for å visualisere mikroglia med mobilnettet oppløsning. Dessuten beskriver vi metoder for å kvantifisere månedlige endringer i celleaktivering og tetthet i store celleundergrupper (200 til 300 celler pr netthinnen). Vi bekrefter bruk av Somal området som et nyttig beregning for live sporing av microglial aktivering i netthinnen ved å bruke automatiserte terskel-basert morfometrisk analyse av in vivo bilder. Vi bruker disse levende bilde anskaffelse og analyser strategier for å overvåke de dynamiske endringer i microglial aktivering og microgliosis under tidlige stadier av retinal nevrodegenerasjon i en musemodell av kronisk grønn stær. Denne tilnærmingen bør være nyttig å undersøke bidrag fra mikroglia til neuronal og aksonal nedgang i kroniske forstyrrelser i sentralnervesystemet som påvirker netthinnen og synsnerven.
Introduction
Mikroglia er neuroimmune celler som utelukkende oppholder seg i sentralnervesystemet (CNS) siden tidlig embryoutvikling og gjennom hele voksenlivet. Utstyrt med en kompleks repertoar av reseptorer, er microglial aktivitet og regional heterogenitet regulert av deres toveis samspill med nabo nevroner, gliaceller, blod-hjernebarrieren og infiltrere neuroinflammatoriske celler 1,2. Basale mikrogliaceller funksjoner bidra til fysiologiske vedlikehold og reparasjoner, som de smake deres territorium for forstyrrelser i homeostase 3,4. Under CNS skade eller sykdom, mikroglia er de første responders til nevronale signaler som deretter utløser deres overgang til en reaktiv fenotype, kalt "aktivert microglia 2,5-7. Mikroglia aktivering innebærer en intrikat syklus av genet og protein uttrykk, som er koblet til celle soma og prosess skalering og ombygging 6-9. Mikroglia aktivering, samt celle omfordeling ogclustering, kan være ledsaget den lokale generell økning i antall celler (betegnet microgliosis). Dette kan resultere fra celleproliferasjon og selvfornyelse, med eller uten rekruttering av blodavledede monocytter 3,4,7,10-14. I et bredt spekter av aldersavhengig, kroniske CNS sykdommer, vedvarende microgliosis og mikroglia aktivering parallell sykdomsprogresjon 15-19. Hvordan mikroglia innvirkning neurodegenerering fortsatt uklart, hovedsakelig fordi de spiller både nervecellene og skadelige roller som kan ha ulike bidrag til sykdomsutbruddet og progresjon. Live-imaging studier som tar sikte på å forstå kronisk CNS sykdom har overvåket microglial atferd i den skadede CNS dyremodeller og mennesker, og viste at mikrogliaceller forandringer kan påvises begynnelsen på tidlige sykdomsstadier 15-17,19,20. Det er således viktig å utvikle fremgangsmåter for å påvise og overvåke microglial aktivering in vivo.
Non-invasiv DeteDette skjer av regionale endringer i hjernens mikroglia aktivering ble etablert som en viktig in vivo indikator på nevrodegenerativ sykdom progresjon, ved hjelp av molekylær avbildning eller Bioluminescens og positronemisjonstomografi eller magnetisk resonanstomografi 18,21,22. Disse svært kvantitative og ikke-invasive molekylære og kjernefysisk avbildningsmetoder oppdage gliose med regional oppløsning. Alternativt har to-foton confocal bildebehandling i CX3CR1 GFP / + mus tillot observasjon av hjerne mikroglia med mobilnettet oppløsning 3,4,9,20,23-28. Men begrenser denne tilnærmingen langsiktig og gjentatt observasjon av kroniske mikrogliaceller endringer, gitt den potensielle risikoen for å forstyrre deres atferd ved selv minimal invasiv hjerneavbildnings prosedyrer 29. Alternativt netthinnen gir optimale forhold for direkte, in vivo visualisering og gjentatt overvåking av mikroglia i sin intakt CNS nisje gjennom aldring, etter akutt skade, ogpotensielt under kroniske nevrodegenerative sykdommer. Dermed har nyere studier vist seg muligheten for høyoppløselig avbildning av netthinnens mikroglia uttrykker GFP ved å tilpasse confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) til bildet levende CX3CR1 GFP / + mus. Dette har vært brukt til å spore endringer i ukentlige GFP + celleantall i individuelle mus i opp til 10 uker etter akutt indusert skade eller okulær hypertensjon 30-36.
Vi har utvidet denne tilnærmingen til å utføre langsiktig bildebehandling over flere måneder, og kvantitativt spore endringer i mikroglia aktivering basert på soma størrelse ved hjelp morfometrisk analyse. Somal størrelse ble definert som en nyttig beregning av mikroglia aktivering i levende bildediagnostikk ved hjelp av to-foton konfokalmikroskopi i kortikale skiver til å utføre in vivo avbildning av CX3CR1-GFP + mikroglia 9. Disse og andre studier viste også sammenhengen mellom Somal størrelse og nivåer av Iba1 protein uttrykk, which øker også med aktivisering 9,37. Således kan aktivert mikroglia identifiseres i levende mus, og deres antall og fordeling overvåkes over tid i løpet av CNS helse og sykdom.
Denne protokollen beskriver metoder for cSLO levende bilde oppkjøpet og analyse for å overvåke mikrogliaceller celle tall, distribusjon og morfologiske aktivering under retinal ganglion celle (RGC) degenerasjon (figur 1). Dermed bruker denne studien: 1) en musemodell for arvelig glaukom (DBA / 2J) som gjennomgår aldersavhengig synsnerven og retinal neurodegenerering og viser bemerkelsesverdig variasjon i sykdomsprogresjon mellom 5 og 10 måneders alder 38,39, 2) månedlig cSLO in vivo avbildning for langsiktig visualisering av GFP + celler i netthinnen og unmyelinated synsnerven av heterozygote Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J mus i alderen 3-5 måneder, 3) levende bildeanalyse ved segmentering og thresholding å isolere celle somata og mål denir området. Disse strategiene er brukt for å vurdere kinetikken av netthinnens mikrogliaceller aktiveringstilstander i tidlige stadier av kronisk glaukom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo avbildning utføres i patogenfrie anlegg ved hjelp protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Utah.
MERK: Denne avbildningsprotokollen blir brukt for rapportør mus der retinale mikroglia og infiltrerende monocytter / makrofager uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av den fractalkine reseptoren locus (CX3CR1).
1. in vivo avbildning av Netthinne GFP + Microglia av Confocal Scanning Laser ophthalmoscopy (cSLO)
- Skru på vannet styrte varmesystem, satt til å stabilisere muse temperatur mellom 35-37 ºC i løpet av prosedyren, og koble to varmeputer.
- Start konfokale scanning laser oftalmoskop (cSLO) system (Figur 2A). Åpne cSLO programmet, skriv inn informasjon som vil identifisere den enkelte mus og sette en hornhinnen kurvatur på 2 mm (Pasientdata-menyen).
- Forbered imaging. Sikkert passe en ren 55º bredt felt objektiv på sokkelen. Klargjør oftalmoskop bildebehandling plattformen ved å sikre en varmepute dekket med rent papir. Bruk klipp å flate puten og papir og holde dem fra å blokkere bevegelse av objektiv.
- Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av 1,3% 2,2,2-tribromoethanol og 0,8% tert-amylalkohol (250 mg / kg kroppsvekt; 0,5 ml / 25 g kroppsvekt) ved bruk av en 30½ G nål montert på en 1 ml engangs sprøyte. Returnere musen til buret sitt, holdt over en varmepute.
MERK: levering av bedøvelse ved injeksjon versus innånding tillater enklere plassering av musen for bildebehandling og uhindret tilgang til øynene, uten nese kjegler og tubing. - Når dyret stopper å bevege seg og ikke svarer til hale knipe, indusere elev dilatasjon med Tropicamide og fenylefrin (0,5% hver), ved å plassere dyret utsatt og dekker begge øynene med dråper til 7 min.
- Etter 5 min, psnøre musen utsatt på midten av oftalmoskop plattform, og passer kontaktlinser over begge øynene, bruke minimalt trykk.
MERK: Kontaktlinser er små og skjøre, men kan behandles forsiktig med fingrene, selv om tang kan brukes i stedet 40. Bruk av kontaktlinser er valgfritt, men anbefales som det minimerer øye tørrhet og bevarer hornhinnen åpenhet under bildebehandling. - Etter 7 min, orientere musen med høyre øye vendt mot objektiv og bane parallelt med objektiv, holde dyret uhemmet nær kanten av plattformen (figur 2B). Å samle bilder av sammenlign metning og orientering, stadig opprettholde avstanden fra øye til objektiv, samt justering av øyet til lysbanen hele bilde økter. Clip lange værhår forstyrrer observasjon av øyet.
MERK: For neste 8-10 min, vil musen ikke flytte eller blinke, og vil puste med milde trekkmenter, som er registrert av cSLO Eye Tracking ART (automatisk sanntid) modus, som justerer skannehodeposisjon basert på landemerker fundus med høy kontrast. Forbi den tiden, begynner mus pesende og blinker, noe som gjør bildebehandling upraktisk. - Ved avbildning utføres uten bruk av kontaktlinser, gjelder PBS synker til begge øynene hver 2-3 min for å hindre dem fra å tørking.
- Samle et fundus bilde av retinal blodkar og optisk plate, fokusert på den indre hinnen.
- Velg infrarød modus (IR), og juster innstillingene til 820 nm eksitasjon, 100% laser makt, 40-60% sensitivitet (figur 2C).
- Jobbe i høyhastighetsmodus (12,6 ramme / sek), finn øye med joysticken til å drive oftalmoskop. Ved lav forstørrelse, inspisere hornhinnen og linsen for skade eller opasitet, og inkluderer fra studien øynene med defekter eller skader som vil påvirke bildebehandling netthinnen (figur 3A).
- Finn papillen området (overflatensynsnervepapillen, ONH) ved å bringe målet nærmere øyet, deretter midtstille bildet på den og låse denne posisjonen ved å skru på styrespaken. Denne justering av øyet til oftalmoskop er nøkkelen til å oppnå enda fokusere, og utslippet over bildet.
- Visualisere de indre plan i netthinnen, samt ONH, ved hjelp av de store blodkar som ligger på vitreal overflaten av netthinnen som en referanse fokalplan (59 og 60 D), eller dypere (55 D) i øynene som viser utgravd optisk plater. Den optimale fokus bør løse sirkulerende blodceller innen store blodårer, med sine lumen og vegger klart atskilte.
- Optimalisere bilde metning ved å justere rattet på berøringsskjermen på kontrollpanelet, inntil en hvit glorie av jevn belysning spenner i de fleste av 55º fundus feltet rundt papillen (med svak overeksponering). Deretter senke metning å optimalisere kontrast til blodlegemer som beveger seg langs de store fartøyene kan tydelig løst. Hvis fokus mørkområder vedvarer, ikke på grunn av retinal skade, justere øyet til kameraet før et jevnt lyst bilde er oppnådd. Denne justeringen er grunnleggende for å fange reproduserbare sett av bilder i stilling og kvalitet.
- Samle et høyoppløselig bilde av IR sentrale netthinnen (1,4 til 1,7 mm i diameter, avhengig av alder), i snitt 30 bilder i sanntid (4,7 bilder / sek, normalisert), for å forbedre signal-til-støy-forhold (figur 2D ).
- Umiddelbart, få en fluorescens bilde av GFP + mikroglia og / eller infiltrere monocytter lokalisert til de indre plan av netthinnen og ONH.
MERK: Optimalisering av IR fundus bilde på netthinnen bestemmer oppløsningen til fluorescensen bildet av GFP + celler, så vel som omfanget av indre retina spredte. Unnlatelse av å fokusere de indre plan av netthinnen, noe som kan påvises ved dårlig oppløsning av vaskulaturen, vil resultere i dempet GFP + celle visninger (Figur 3b). Unnlatelse av å justere IR saturasjon fullstendig og jevnt påvirker fluorescens bilde (FA), innføring av kunstig variasjoner i GFP + celle intensitet og størrelse (figur 3C).- Swich til fluorescens avbildningsmodus (FA) i berøringsskjermen panel, bruker blå, 488 nm laser eksitasjon (460-490 nm barriere filter sett), og oppkjøps innstillinger (100% laser makt og 100-125% sensitivitet), som opprettholdes konstant for alle mus (figur 2e).
- Samle en enkelt xy-punkt, todimensjonale fluorescens bilde av netthinnen, og umiddelbart ta et fundus image på samme posisjon (100x scan gjennomsnittet; 55º skanning vinkel for både bilder, figur 2F).
- Ta et multibilde ved å velge "sammensatt" i kontrollpanelet (figur 2G) og flytte oftalmoskop høyre og venstre, panorering netthinnen gjennom nese-temporal akse (figur 2 H).
MERK: Etter å skanne et enkelt xy-punkt image (100x skan gjennomsnittlig), programvaren automatisk gjennomsnitt nye skanninger av de samme og nye områder (avgrensede med en grønn sirkel under optimale scan, eller rødt når skanningen er unfeasible) og masker alle xy-posisjoner i sanntid. Det resulterende sammensatte bildet strekker 1,5 til 1,7 mm på den horisontale akse x 3-4 mm i den vertikale akse (x 55º 120-124º skannevinkel).
- Komplett avbildning av hver mus innen 15 min etter å indusere anestesi, før blinke og bevegelses starter på nytt.
- Fjern kontaktlinser, hydrat øynene med PBS og returnere dyret til sin varme buret, sjekker atferd før full gjenoppretting av bevegeligheten.
- For longitudinelle studier med intermitterende cSLO-bilde økter i samme individ mus, gjenta bilde ikke mindre enn tre dager fra hverandre for å unngå den kumulative toksisitet av anestesi, samt hornhinnen irritasjon.
2. Levende Bildebehandling og analyse
- Sekvensiell bildejusteringen:
- Justerfundus bilder for en tidsserie av samme øyet med blodkar og papillen som landemerker. Åpne alle bildene i en kommersiell slide-show presentasjonsprogram, ved å dra hvert bilde over den foregående inntil deres optiske plater justere på XY planet (toppbildet vises semi-transparent samtidig som dras), og roter den øverste bildet til sin store blodkar lapper med blodkar på bildet nedenfor (fokus på fartøy lengst fra papillen). Spill rotasjonsvinkelen for hvert bilde og lagre dette tidsserier for fremtidig referanse, holde styr på mus og øye identitet.
- Juster den tilsvarende serie av enkelt xy-punkts fluorescens bilder ved å bruke de registrerte vinkel for å korrigere xy rotasjon på hvert tidspunkt, ved hjelp av et rastergrafikkprogram. I tillegg justere oppløsningen til 300 dpi (uten oppskalering) og bakgrunn (i RGB-modus, velger Levels og smake lumen av en blodåre som svart). Lagre disse bildenesom TIF-filer, legge til "justert" til deres navn.
- Microglial celle segmentering:
- Å identifisere GFP + celler i det sentrale netthinnen, åpent i FluoRender den "justert" TIF-fil som tilsvarer det tidligste tidspunktet / alder. Zoome inn bildet slik at det passer på skjermen, deretter definere Render view (kompositt, ortogonale, interpolert) og dens egenskaper (0,58 gamma, 255 metningspunkt, 255 luminans, 195 alfa og 1,00 skyggelegging), velge både RG-kanaler som er synlig (hjem B-kanal ved å dobbeltklikke på den i arbeidsområdet ramme; Figur 4A).
- Å velge enkeltceller, terskel den røde kanalen (må være markert på arbeidsområdet ramme), ved å øke den lave terskelen til de fleste av cellene er maskert (hvit) med minimum overlapping og celleprosesser (cyan), samtidig som den høye terskelen konstant (255). Den lave terskelverdi varierer mellom 100 og 170, avhengig av fluorescensintensitet (figur 4B </ Strong>).
- Lagre dette synet med den røde kanalen bare synlig (Capture kommando) som en ny TIF-fil, og legger til "cellsegm" til sitt opprinnelige navn (Figur 4C). Ved hjelp av en generisk raster grafisk editor programvare, invertere sin gråtoner og justere oppløsningen til 300 dpi som ovenfor, og lagre igjen som RGB (Figur 4D).
MERK: Slett mappene (prosjekter) automatisk opprettet av FluoRender, og lagre den påførte terskelen for fremtidig referanse.
- Microglial soma segmentering og morfometri:
- For å identifisere GFP + celle somata for området kvantifisering, bruker programvare for bildeanalyse med automatiserte intensitetsmålinger og terskel evner, samt terskel-baserte objekt telling og måling. Åpne "cellsegm" TIF-fil, og velg rescaling metode (kile) og den røde kanalen (klikk rød fane i RGB). Forbedre visualisering ved å fjerne merkingen "view kanal i fargen" (høyreklikk på den røde RGTab B), og velge "utfylle farger" (Bilde / Bildejustering-) for å snu gråtoner og se cellene i grått / svart i løpet hvit bakgrunn (figur 4E).
- Kalibrere bildet til 1,4-1,7 mm avhengig av alder, ved å tegne en horisontal linje over hele bildet (kalibrering, Quick Calibration).
- Segment enkelt celle somata ved å påføre intensitet thresholding (figur 4B). For dette arbeidet på den røde RGB kanal og åpne Threshold Intensity funksjon (Object Count, velge "count update" kommando) for å spore todimensjonale parametere for hver terskel region av interesse (ROI) som representerer individuelle somata.
- Definer intensiteten terskel i intensiteten histogrammet, ved å velge den laveste 50-60% av 255 nivåer, og den endelige raffinering terskelverdien ved visuelt å bedømme overlappingen mellom terskelen fargen mask (blå) og cellen soma perimeter (grå) i enkeltceller (Figur 4E).
- Anslå nøyaktigheten av celle soma masker for å representere Somal dimensjoner ved å måle området før og etter segmentering i 10 celler og jeg aksepterer den valgte terskelområdet hvis målingene avviker mindre enn 10% (bruk Binary Toolbar og kommentert målinger).
- Manuelt identifisere Somal Rois som inkluderer flere celler og skille disse elementene (eliminere eller separate ROIs hjelp av Binary Toolbar kontroller, eller objektet Catalog) mens Slå av / på den binære å direkte visualisere celler (Figur 4F).
- Klassifisere mikrogliaceller celler som ROIs med Somal områder større og mindre enn 50-60 mikrometer to å diskriminere celle somata tilsvarer aktivert mikroglia og deaktiveres mikroglia henholdsvis ved hjelp av området Restriction.
MERK: Hver celle Somal undergruppe er identifisert med en annen pseudocolored binær lag, og kan videre karakteriseres for andre morfologiske parametere (perimeter, sirkularitet, etc.), samt kvantifisert innenfor diskrete retinal sektorer (Figur 4G). Lagre analysert bildet som et ND2 fil. - Bekreft prosessen og forgrening kompleksiteten i enkelt aktiverte mikrogliaceller celler, ved overliggende Somal maske og singelen xy -poeng bilde (kontrast økt med 50%, figur 4H). Manuelt telle prosessene som strekker seg direkte fra cellen soma eller måle diameteren av polygonet som omfatter akselen (bruk Binary Verktøyet og kommentert målinger).
MERK: Aktivert celler mangler prosesser eller bære noen (<4) og korte (<2x Somal diameter) som, i motsetning til celleprosesser ikke-aktivert, som omfatter en ramified og omfattende arbor (> 3-10x Somal diameter) rundt sin relativt liten soma. - Manuelt identifisere celler med somata mindre enn <20 um 2 og / eller GFP uttrykk under påvisningsgrensen, som derfor uoppdaget av itensity thresholding. Bruk Taxonomy kommandoen i Stempler å telle manuelt identifiserte elementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre siste in vivo studier brukt disse live image oppkjøpet og analysemetoder for å visualisere og spore kinetikk og mønstre av ONH og retinal mikrogliaceller endringer i tidlige stadier av kronisk glaukom og deres forhold til sent neurodegenerering 59. Her viser vi en cSLO bilde oppkjøpet protokollen for å visualisere mikrogliaceller celler over et stort område av det sentrale netthinnen i enkelte unge heterozygote Cx3CR1-GFP DBA / 2J netthinne (figur 5). Basert på den høye celle oppløsning, bruker vi levende bilde thresholding og morfometrisk analyser som tillater automatisk segmentering av individuelle GFP + celler og somata (figur 6).
Å overvåke utviklingen av lokal microgliosis og / eller mikroglia aktivering i alderen foregå påvises neurodegenerering i denne modellen av kronisk glaukom, målte vi månedlige variasjoner av total mikroglia celletettheten i enkelte unge heterozygot Cx3CR1-GFP DBA / 2J netthinne (n = 10) mellom 3-5 måneders alder (figur 7A). I samsvar med den variable progresjon av neurodegenerasjon i enkelt øyne 41-44, viser analysen variable nivåer av retinal mikroglia aktivering og microgliosis over øynene ved hvert alder (figur 7B), og registrerer dynamiske endringer i tettheten av total og aktiverte mikroglia i de enkelte netthinner (figur 7C). Merkbart, er antall aktiverte mikroglia frikoblet fra samtidige endringer i total GFP + celletetthet. Disse in vivo funnene bekrefter tidligere ex vivo analyse av mikrogliaceller endringer i DBA / 2J mus 45. Dermed cSLO levende påvisning og måling av retinal microglial aktivering kan tjene som indikatorer for tidlig sykdomsutvikling innen individuelle øyne, og kan potensielt være knyttet til oppstart av hendelsene i glaukom patogenesen.
Figur 1:. Live-image oppkjøpet, bearbeiding og analyse arbeidsflyt cSLO ble brukt til bilde hundrevis av GFP + mikrogliaceller / perifere monocytter celler lokalisert til den sentrale ~ 1,7 mm 2 muse indre netthinne. Fluorescens bilder (FA) ble kjøpt månedlig for de samme mus, og justert ved hjelp av infrarøde (IR) fundus bilder av retinal blodkar og vitreal overflate som referanse. Segmentering av GFP + celler og somata resulterte fra å anvende to separate trinn av intensitet-thresholding til FA retinal bilder. Morfometrisk analyse av binære representerer cellen somata tillot måling av enkelt Somal områder. GFP + celler med Somal området over 50 mikrometer 2 ble klassifisert som aktivert. Tetthet av totale og aktiverte GFP + celler ble målt for individuelle retinal FA bilder og undersøkelse av arbor forlengelse og forgrening kompleksitet ble utført ved direkte observasjon av FA-bilder.
Figur 2: Live-image oppkjøpet kontroller i cSLO Spectralis (A) Manuell berøringsskjerm panel på start.. (B) cSLO avbildningsprogramvare vinduet med hodet av en levende mus. (C) Innstillinger som er valgt for infrarød imaging (opplyst i blått). (D) Fundus bilde av netthinnen i sanntid oppkjøp (venstre panel) og gjennomsnittlig (høyre panel). Normalisering kommandoen angitt med svart sirkel. Arterier og vener som stråler fra synsnervepapillen er synlige (i parentes), som er de optiske aksonale bunter (piler) i mellom blodkar. (E) Innstillinger valgt for fluorescens bildebehandling innenfor en enkelt xy punkt. (F) Single-point fluorescens (FA, 488 nm) avbildning ved kjøp (i snitt). Than mindre bilde (venstre) viser et individ scan, jo større bilde (høyre) viser fremdriften av intensitet i snitt. (G) Innstillinger valgt for kjøp av en multi (kompositt), fluorescens bilde. (H) Multipoint fluorescens bildebehandling oppkjøpet, viser skanningen pågår, der programvaren identifiserer seg med en grønn sirkel (eller rødt når oppkjøpet er ikke mulig). Skala barer representerer ~ 5 mm (B) eller 250 mikrometer (DH) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. .
Figur 3: Nøkkel okulær feil og bildefeil som kan hindre riktig cSLO avbildning av mikrogliaceller celler (A - C) Ocular skader eller defekter, samt bilde oppkjøpet feil.s kan hindre pålitelig avbildning av GFP + celler lokalisert til de innerste flyene av netthinnen. (A) Noen brutto øye defekter er lett synlig i fundus bilder, inkludert hornhinnen eller linsen opasitet, eller skade og utdyping av papillen området, som alle forhindre klar avbildning av GFP + celler. (B) Fokusering enten ovenfor (veggene i karene blir umulig å skille fra lumen) eller under den indre overflaten av netthinnen (fartøyene er knapt synlig) reduserer detekterbarheten av GFP fluorescensemisjon fra celler som ligger på nervefiber og ganglion celle lag. (C) metningsnivåer feil eller ujevnt settet kan resultere i lyse, men overmettede bilder (med celler som mangler oppløsning) eller bilder med uklar områder. Scale bar representerer 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Binære terskelbasert kvantifisering av mikrogliaceller celletall og Somal område (A - D) Trinn i celle segmentering i FluoRender (A) Navigasjon vindu med gjengitt riss av et typisk ett-punkts fluorescens bilde av mikroglia i sentralnetthinnen.. (øverst panel); tilsvarende gjengivelse egenskaper (nedre panel). (B) Det samme bildet under en celle segmentering rutine, sett på som RGB, med tilsvarende terskelinnstillinger (nedre paneler). Terskel-celler er representert med hvite piksler og kledde på sine prosesser i cyan. (C) Bilde av celle masker oppnådd etter celle segmentering. (D) Forrige maske med inverterte gråtone verdier for videre bildebehandling. (E - H) Trinn Somal terskel og kvantifisering. (E) Bruk av intensitet terskel for å segmentere mikroglia somata basert på deres tidligere celle segmentering. RGB intensitet histogram (til venstre) kan thresholding ved direkte valg av nedre 50-60% spekter av intensiteter (0 til 127-153). En slik oppdeling gir en kvantifiserbar maske som isolerer individuelle microglial somata (blå). Bilder blir rescaled bruker splinefunksjon (oval til høyre). (F) Automatiske terskelbaserte målinger av enkelte ROI / somata (øverst panel) og ROI silhuetter (objektkatalog, nederst panel) som brukes til å korrigere overlapp ROIs hjelp Binary Tools (høyre panel) for manuell separasjon eller erosjon. (G) Klassifisering av individuelle Somal områder etter område Restriction (øverst til venstre panel). Segmentert somata klassifiseres som ROIs mindre og større enn 50-60 um 2, og de binære lag for hver klasse av somata er tildelt forskjellige farge piksler (grønn ennd magenta, henholdsvis). (H) Overlegg av den segment somata (grønn) på originalbildet (med økt kontrast) brukes for direkte observasjon av prosessen kompleksiteten i enkelt aktiverte celler (venstre panel). Forstørret bilde av celle lysthus. Skala barer representerer 250 mikrometer (AH) eller 50 mikrometer (H, innfelt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Høy oppløsning visualisering av CX3CR1- GFP + mikroglia / monocytter lokalisert til indre musen netthinnen av levende confocal scanning laser imaging (A) Enkelt XY punkt cSLO bilde som viser GFP + celler i det sentrale. retina i en 2 måneder gammel DBA / 2J mus (til venstre). Forstørret visning (til høyre) viser ONH området (sirkel), blodårer (linjer) foret med perivaskulære mikroglia / makrofager, og parenchymal mikroglia flislegging sentralnetthinnen. (B) Multipoint image, samlet umiddelbart etter enkelt punkt å visualisere mikroglia over et bredere retinal område (⅓ av netthinnen). (C, D) identiske bilder, som er vist med omvendt gråtoner for optimal observasjon av cellemorfologi og kompleksitet (minimal justert for kontrast og oppløsning). Somal størrelse og form kan løses i de fleste celler (til venstre). Arbor forlengelse og celle forgrening kan løses i cellene med stor somata (til høyre, og tre individuelle celler). (E) Infrarød fundus bilde av blodkar og papillen brukes for xy -planet justering av sekvensielle bilder. Skala søylene representerer 250 um (A, B og E) og 25 um (C, helt til høyre).es / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Segmentering av microglial celle og somata (A) GFP + celler gjengitt av segmentering i 2D ved hjelp FluoRender. (B) tilsvarende celle somata, oppdaget av terskel hjelp konfokalt bildeanalyse programvare. (C) Binary maske av celle somata mottagelig for kvantitativ analyse. (D) Klassifisering av segmentert celle somata etter område å diskriminere aktivert mikrogliaceller celler (> 50-60 mikrometer 2, magenta), og ikke-aktiverte celler (<50 mikrometer 2, grønn). Dim og små celler (<10-20 mikrometer to, gul stjerne) identifiseres manuelt i originalbildet med invertert gråtoner (
Figur 7:. Longitudinal sporing av microglial celletetthet og aktivering hos unge DBA / 2J netthinne (A) Live cSLO fundus og FA-bilder av det samme øyet, kjøpte 3-5 måneders alder. Sekvensielle FA bilder ble brukt for å kvantifisere endringer over tid i totalt antall CX3CR1-GFP + celler lokalisert innenfor den sentrale ~ 1,7 mm 2 av netthinnen. Teller inkludert parenchymal og perivaskulære mikroglia, men celler ekskludert gruppert på ONH (posisjon indikeres med hvit sirkel). (B) tidsforløpet analyse av retinal mikroglia celletetthet og aktivisering i alderen foregåneurodegenerasjon i DBA / 2J kronisk glaukom (n = 10 netthinne per år). Totale antallet GFP + celler og av aktiverte mikrogliaceller celler (Somal område> 50 mikrometer 2) pr mm 2 av sentrale netthinnen. Hvert datapunkt representerer en enkelt netthinnen, og en anordning for hver alders representeres med en horisontal linje. (C) Månedlig sporing av totale antallet GFP + celler og av aktiverte mikrogliaceller celler i en enkelt netthinnen. Det er parallelle, men kvantitativt forskjellige endringer i total og aktivert celletetthet, med mer dynamisk variasjon i tettheten av morfologisk aktiverte celler. Scale bar representerer 250 mikrometer (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende overvåking av microglial celleantall og morfologisk aktivering i løpet av en nevrodegenerativ sykdom krever bruk av ikke-invasive avbildningsmetoder som tillater detaljerte visualisering av cellefunksjoner. Etter avbildning, må mikrogliale celler isoleres (segmentert) for morfometrisk analyse ved bruk av flere terskeltrinn til å vurdere Somal størrelse og / eller prosesskompleksitet som avlesninger for mikroglia aktivering. I denne protokollen beskriver vi metoder for live bildeoverføring ved hjelp cSLO, og kvantitativ analyse av microglial aktivering basert på sekvensiell celle og soma segmentering. Vi bruker disse strategiene for å vurdere kinetikken retinal mikroglia aktivering og microgliosis over 2 måneder i sammenheng med en kronisk nevrodegenerativ sykdom i netthinnen.
Reporter mus og microglia / perifere monocytter celletyper
Bruken av mus som uttrykker GFP under kontroll av den fractalkine reseptor (CX3CR1)locus 46 gir pålitelig identifisering av bosatt mikroglia og robust GFP uttrykk tillater bemerkelsesverdig in vivo visualisering 30-32,34,36. Her bruker vi en substrain av DBA / 2J mus, avledet av tilbakekryssing C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J mus 46 inn i DBA / 2J genetisk bakgrunn 59. Perifere monocytter og makrofager, noe som kan invadere CNS under sykdom eller skade, også uttrykke GFP tag 15,46,47.
Live-imaging studier av mikroglia i nevrodegenerativ retina
Våre in vivo sporing av CX3CR1-GFP / + netthinnens celler ved hjelp cSLO bygger på tidligere studier som overvåkes endringer i retinal GFP + celletall etter akutt skade i inntil 10 uker 30-32,34,48. Her visualiserer vi CX3CR1-GFP / + mikroglia / perifere monocytter med mobilnettet oppløsning, ved månedlig cSLO avbildning av netthinnen i den tidlige utviklingen av kronisk glaukom. Additionally bruker vi levende bilde automatisert terskel basert analyse for å oppdage og kvantifisere celle resizing og ombygging med nok romlig og tidsmessig oppløsning til å overvåke endringer i totale aktiverte og microglia tellinger innenfor enkelte øynene og på tvers av enkeltpersoner.
Tekniske begrensninger cSLO avbildning av GFP + mikroglia i netthinnen
Vi fant bildekvalitet til å være konsekvent og reproduserbar, som illustrert ved en sammenligning av enkelt versus fler- xy punkt bildene innhentet i en enkelt økt (figur 5). Men konsekvent og reproduserbar GFP + cell imaging oppkjøp, i en enkelt økt og over tid, er kritisk avhengig av valg av stabile parametere for fundus og fluorescens cSLO bildebehandling. Justering av øyet og papillen til cSLO målet bestemmer ensartethet av metningsnivåer og fokus på konfokal planet av interesse 49. Unøyaktig og / eller ikke-uniform specificatipå metningsnivåer kan generere kunstig variasjoner i GFP deteksjon, autofluorescence bakgrunn, og celle og lysthus oppløsning. For å fokusere på riktig måte på mikroglia lokalisert til nervefiber og ganglion cellelag, er det avgjørende å justere og fokusere på de retinale blodkar og ved aksonal bunter ved vitreal overflaten ved IR fundus avbildning. Dette gir et referanseplan for å lokalisere GFP + celler ved FA. Den nødvendige omstilling er nødvendig for å bytte fra IR til FA kan bli veiledet av oppkjøpet av flere FA bilder med litt forskjellige dybder (55-60 D) i hver eksperimentell økt. Dette kan også bidra til å kompensere for anatomiske forskjeller på grunn av alder, elev dilatasjon og patologi (optisk plate utgraving). Etter oppløsning og celle detalj avhenger den optimale spesifikasjon av metningsnivåer i løpet av fundus, og forsiktig justering av øyet i forhold til kameraet 49, bildesekvenser ervervet over tid for det samme øyet må vise fundus IR-bilder med consistent og sammenlignbar fokus, belysning, oppløsning og retinal feltet span. Manuelle tellinger av totalt GFP + celletall i bildene som ble kjøpt i en enkelt sesjon (1,5-1,7 mm 2 av retina, n = 13 netthinne, i alderen 3-5 måneder) bekreftet konsekvent og reproduserbar kvantifisering av cellularity (3-4% variasjon; data ikke vist). Dette er nødvendig for bilder for å være mottagelig for GFP + cellesegmenterings via terskel analyse basert på en tilsvarende intensitetsområde, og sammenlikning av endringer over tid.
Terskel og morfometrisk analyser av retinal mikroglia i levende cSLO bilder
Bare nylig har in vivo synliggjøring av hjernen mikroglia med høy cellulær oppløsning av to-foton konfokal mikroskopi aktivert kvantitativ analyse av mikrogliaceller Soma og prosessparametre, og diskriminering av morfologisk aktiverte mikroglia 9,50. Som vist av disse forfatterne, er Somal størrelse den mest iøynefallende morfologiskeparameter påvisbar over tid av levende to-foton konfokal avbildning av hjernen mikroglia, ved hjelp av iterative intensitetsbaserte terskelverdier for å redusere signal-til-støyvariasjoner 9. Videre Somal størrelse endringer korrelerer med oppregulering av Iba1 uttrykk i aktiverte celler 9. Her bruker vi cSLO levende bilder og anvende sammenlign sekvensiell segmentering av mikrogliaceller celler og somata, etterfulgt av morfometrisk analyse for å kvantifisere antallet total og aktivert CX3CR1-GFP + celler lokalisert til netthinnen.
Vi bruker spesialisert konfokal rendering programvare (FluoRender) for å segmentere GFP + celler i det sentrale netthinnen. Disse bildene er ytterligere terskel med en kommersielt tilgjengelig konfokalt bildeanalyse pakke, til slutt tillate automatisk segmentering og terskel-basert kvantifisering av Somal området. Vår live image-analyser bekreftet bruk av soma størrelse som en morfologisk beregning av microglial aktivering i levende bildeanalyse 9. Somalterskel-baserte tellinger tillot karakterisering av mønstre og økninger i retinal microgliosis, som tidligere demonstrert ved ex vivo bildeanalyse 50. Vi finner at cSLO oppdager GFP + mikroglia med beste oppløsning og detaljer i musa sentrale netthinnen (<2 mm 2), der cellene kan avbildes på samme konfokale flyet. Mot hinnen periferien, viser fluorescens signal variabilitet og skjevheter som hindrer identiske bildebehandlings og terskel analyse som for GFP + celler som oppdages i flatere sentrale netthinnen. Endelig viser vår protokoll som cSLO in vivo bildeanalyse av retinal mikroglia gir en relativt høy gjennomstrømning. Antallet parenchymal microglial som kan være visuelt isolert og kvantifisert innenfor det sentrale netthinnen varierte mellom ~ 200-300 totale celler, og ~ 10-180 aktiverte celler. Dermed musen retinal mikroglia tilbyr en optimal befolkning for å studere in vivo sin transformasjon og roller dUrering patogenesen av neurodegenerering.
Søknad til andre CNS kroniske sykdommer
In vivo bildeanalyse metoder beskrevet her bør være aktuelt å vurdere akutte eller kroniske mikrogliaceller endringer i andre muse netthinnens sykdommer og skader modeller. Videre kan denne protokollen tjene til å vurdere retinal mikroglia / perifere monocytter endringer som følge av kroniske CNS sykdommer, som Alzheimers, Parkinsons og multippel sklerose, gitt at netthinnen og synsnerven er målrettet for neurodegenerering i disse sykdommene 51-56. I tråd med dette, bruk av levende påvisning av netthinnen og ONH patologi for tidlig Alzheimers sykdom ledelse er under intens studie 54,57,58.
I konklusjonen, våre funn tyder på at levende, lengde sporing og kvantifisering av endringer i netthinnens microglia tall og morfologiske aktivering, kan tjene som pålitelig neuroimaging biomarkører for å påvise sykdomsutbruddet og tidlig progresjon. Disse in vivo avbilding og analysemetodikk gjelder for aldersrelatert glaukom, og potensielt til andre nevrodegenerative sykdommer som påvirker netthinnen og synsnerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
References
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
- Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
- Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
- Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
- Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
- Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
- Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
- Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
- Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
- Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
- Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
- Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
- Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
- Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
- Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
- Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
- Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
- Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
- Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
- Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
- Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
- Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
- Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
- Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
- Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
- Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
- Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
- Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
- Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
- Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
- Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).
