Abstract
Voksne rotte og humane rygmarv neurale stamceller / progenitorceller (NSPC-koder) dyrket i vækstfaktor-beriget medium muliggør spredning af multipotente, selvfornyende og udvides neurale stamceller. I serum- betingelser, vil disse multipotente NSPC-koder differentiere, genererer neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Det høstede væv enzymatisk dissocieret i en papain-EDTA-opløsning og derefter dissocieret mekanisk og adskilles gennem en diskontinuerlig densitetsgradient til opnåelse af en enkelt cellesuspension, som er udpladet i neurobasalt medium suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF ) og heparin. Voksen rotte rygmarv NSPC-koder dyrkes som frit svævende neurosfærer og voksne humane rygmarv NSPC-koder dyrkes som vedhængende kulturer. Under disse betingelser, voksne rygmarv NSPC-koder formere, udtrykkelige markører for præcursorceller, og kan løbende udvidet ved passage. Disse celler kan be undersøges in vitro som reaktion på forskellige stimuli, og ydre faktorer kan anvendes til at fremme afstamning begrænsning at undersøge neural stamcelle-differentiering. Multipotent NSPC-koder eller deres afkom kan også transplanteres i forskellige dyremodeller til vurdering regenerativ reparation.
Introduction
NSPC-koder er multipotente celler forpligtet til neurale afstamning, der kan selv forny og let udvide in vitro. Vi henviser til disse celler som en blandet population af neurale stamceller / stamceller, da de viser egenskaber selvfornyende multipotente stamceller og mere begrænsede stamfædre. NSPC-koder findes i både føtale og voksne hjerne og rygmarv 1,2. I den voksne, NSPC-koder normalt hvilende og opholde sig bestemte nicher, herunder subventrikulære zone foring de laterale ventrikler 2-4 og periventricular region omkring centrale kanal af rygmarven 5,6.
Typisk NSPC-koder dyrkes som fritflydende neurosfærer eller som adhærente monolag i serumfrit medium suppleret med EGF og bFGF, mitogener, der udvælger for stamceller / progenitor cellepopulationer. Neurosfæren assay oprindeligt udviklet af Reynolds og Weiss 2, er mest almindeligt anvendt til dyrkning ogudvide neurale stamceller. NSPC-koder viser multipotency når de udplades i vækstfaktor-frit medium indeholdende serum, differentiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Multipotente kan selvfornyende NSPC-koder isoleres og dyrket fra den voksne gnaver rygmarven når dyrkede væv omfatter områder af central kanal 6,7. En potentiel fordel ved anvendelse NSPC-koder genereret fra den voksne rygmarven i modsætning til generering af celler fra andre regioner er, at disse vævsspecifikke celler mest ligner celler i rygmarven, som er tabt eller beskadiges følgende skade eller sygdom.
Tidligere arbejde har vist, at neurosfærer afledt af voksne mennesker rygmarv ikke kunne opformeres langvarig eller passeret til at generere et tilstrækkeligt antal celler 8,9. Men med modifikationer i dyrkningsbetingelser, vi rapporteret udvidelse og transplantation af voksne humane rygmarvs-afledte NSPC-koder, hvilket viser, at selvfornyendeog multipotente NSPC-koder kan isoleres fra voksne mennesker rygmarv fra organtransplanterede donorer 10. Primært, fjernelse af det meste af den hvide substans under dissektion og dyrkning af disse celler på en adhærent substrat i vækstfaktor-beriget medium valgt til prolifererende voksne humane rygmarv NSPC-koder. I denne protokol beskriver vi høst af rygmarven fra voksne rotter og fra humane organtransplanterede donorer, dissektion af periventricular væv og isolering, kultur og udvidelse af NSPC-koder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg godkendes af Animal Care udvalg fra University Health Network, Toronto ON Canada, i overensstemmelse med de politikker, der er etableret i Guide til Pleje og anvendelsen af forsøgsdyr udarbejdet af det canadiske Rådet om Animal Care. Til høst af menneskets rygmarv væv blev godkendelse opnået fra University Health Network Research Ethics Board og fra Trillium-Gift of Life Foundation, som fører tilsyn med organdonation i Ontario, Canada.
1. Udarbejdelse af Dissektion buffere og Kultur Medier
- Til isolering af rotte rygmarv, forberede 100 ml dissektion buffer (1x PBS + 0,6% glucose + 2% penicillin-streptomycin) og opbevares i køleskab. Til human rygmarv forberede 100 ml dissektion buffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicillin-streptomycin) og opbevares i køleskab.
- Forbered 100 ml serum-frit medium (SFM) og varm ved 37 ° C. For at fremstille SFM, tilsættes 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml penicillin-streptomycin, 2% B27, og 10% hormon mix Neurobasal-A medium. At forberede hormon mix, lave en 1: 1 DMEM / F12-medium indeholdende 0,6% glucose, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 pg / ml insulin, 100 pg / ml apo-transferrin, 10 uM putrescin, 30 nM selen, og 20 nM progesteron.
- Forbered EFH vækstfaktor-beriget plating medier (til SFM tilsættes 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, og 2 pg / ml heparin), og varm ved 37 ° C. Sørg for, at den menneskelige EFH indeholder humane rekombinante vækstfaktorer (se tabel Materialer).
2. Høst og Dissektion af Adult Rat Periventricular rygmarvsvæv
- Sterilisere dissektionsinstrumenter i ethanol og skyl i sterilt saltvand eller autoklave instrumenter i forvejen. Giv rotte (6 - 8 uger gamle) en dødelig injektion af natriumpentobarbital (1 cc ved 65 mg / ml) eller overdosis bedøvelse (dvs. 4% isofluoran) ifølge et institution godkendt animalsk protokol. DOuse bagsiden af rotte med 70% ethanol og fjerne huden på den dorsale overflade med store dissektion saks.
- Holder saksen vinkelret på den dorsale overflade, tværs skære rygsøjlen over baglemmer. Anvende mindre saks til længderetningen klippe rygmuskel ligger over rygsøjlen i en rostrale retning for at blotlægge torntappene.
- Begyndende ved den udsatte kaudale ende, indsætte rongeurs eller en lille stump knogle-skæreinstrument extradurally i den laterale aspekt af rygmarvskanalen i rummet mellem rygmarven og rygsøjlen. Lav små snit i hinden (benede buer venstre og højre af torntappene på hver side af hvirvlerne) og forsigtigt væk lamina at blotlægge rygmarven (Figur 1A-D). Sørg vinklen på vingerne er lavvandet og parallelt med snoren, så den underliggende rygmarv ikke er beskadiget.
- Fortsæt laminektomi i rostrale retning til expose bryst og livmoderhalskræft rygmarven.
- Udskære Forsigtigt rygmarven fra rygsøjlen med stumpe væv pincet og bruge microscissors til omhyggeligt adskille rødderne for at frigøre ledningen. Placere det udskårne rygmarv i en petriskål indeholdende 4 ° C steril rotte dissektion puffer (beskrevet ovenfor i 1.1). Skyl vævet i frisk fremstillet 4 ° C dissekere puffer og med en saks klippe rygmarven tværs i 1 cm segmenter (figur 1E).
- For hvert segment af væv, bruge en hånd til at holde vævet med fine pincet. Med den anden hånd, brug microscissors til forsigtigt at fjerne de overliggende meninges, hvid substans, og det meste af den grå stof ved hjælp af en dissekere omfang. Alternativt, benytte fine tænger (Dumont 4 #) at skrælle væk meste af grå og hvid substans, så kun det periventricular region af rygmarven som omfatter ependym og en lille mængde af omgivende grå stof (figur 1F-H).
- Pool det dissekerede periventricular væv i en 10 cm steril petriskål indeholdende kold rotte dissektion buffer.
3. Høst og Dissektion af Adult Menneskelig Periventricular rygmarvsvæv
Bemærk: Humant rygmarven væv høstes fra voksne organtransplanterede donorer (donorer varierede i alderen 2-60 år), efter at andre organer er blevet fjernet for organtransplantation. Den Trillium-Gift of Life Program opnår tilladelse til fjernelse af væv til forskningsformål fra patientens familie og meddeler vores høst hold i tide, således at vi har været i stand til at høste ledninger inden for 2 timer af aorta cross-fastspænding. Mandlige og kvindelige voksne donorer med negativ serologi og ingen infektioner accepteres.
- Harvest væv i en steril måde i operationsstuen gennem en anterior tilgang med samme forreste eksponering allerede dissekeret til fjernelse af organer fra organet transporlant høst team.
- Udsætte den forreste rygsøjlen gennem tilbagetrækning med store rib spredere og store padle retraktorer af de resterende væv og organer, herunder de store blodkar.
- Brug en sternal sav monteret med en lang kniv til at skære igennem de intervertebrale skiver på rostral og caudale ender af den ønskede længde af rygsøjlen skal resekteres. Vinkel saven ca. 45 ° medialt til at skære en trekantet trug fra den laterale del af hvirvellegemerne stopper lige kort af rygmarvskanalen.
- Fjern en bloc de mediale aspekter af hvirvellegemerne af de ønskede segmenter ved hjælp af buede Osteotomer og mallet tager sig for at undgå at skære gennem dura. Derefter forsigtigt løfte dura dækket rygmarven med fortandede pincet og skarpt incise rostral og caudale ender af ledningen. Brug lange saks og pincet til bilateralt transektere de enkelte rødder.
- Placere det udskårne segment af rygmarven i 4 °; C steril puffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicillin-streptomycin) i et stort reagensglas til transport til vævskultur værelse.
- Bemærk: Generelt er en 3. - 6. cm segment af rygmarv fra den øvre thorax og / eller midt-til-lav thorakale niveau fjernes i operationsstuen under sterile betingelser så hurtigt som muligt efter ophør af cirkulation og anbringes i koldt steril puffer . Tidsrummet mellem ophør af omsætning og fjernelse af rygmarven varierer med den tid, der kræves til at høste de målrettede organer til donation og har varierede fra 45 min til 2 timer. Hvis hjertet og lungerne også er blevet fjernet, kan dissektion tages langt rostrally at høste en del af den nedre cervikale ledningen samt.
- Dissekere human rygmarv væv så hurtigt som muligt efter høst, generelt inden for 3 timer. Fjern dura og andre meninges med pincet. Skyl rygmarven væv i frisk gjort 4 ° C dissektion buffer ogskæres over på tværs i 1 cm segmenter.
- Ved hjælp af en dissekering omfang, udskære de overliggende meninges, hvide substans, og det meste af grå materie ved hjælp væv pincet, fine pincet og microscissors for hvert væv segment. Pool det dissekerede periventricular væv, som omfatter ependym og en lille mængde af omgivende grå stof, i en 10 cm steril petriskål indeholdende kold menneskelige dissektion buffer.
4. Isolering og Dyrkning af Adult Rat og Human rygmarv NSPC-koder
- Udfør følgende trin aseptisk i en laminar strømning hætte.
- Hakke det dissekerede rotte eller humant periventricular væv i 1 mm3 stykker med microscissors.
- Enzymatisk adskille det hakkede væv med proteolytiske enzymer ved hjælp af papain dissociation kit som angivet i tabellen i materialer / reagenser. Bemærk: Reagens komponenter omfatter 4 hætteglas; Flaske 1: Earles Balanced Salt Solution (EBSS), Flaske 2: Papain containing L-cystein og EDTA, Flaske 3: Deoxyribonuklease I (DNase), Flaske 4: Ovimucoid proteaseinhibitor med bovint serumalbumin (BSA).
Bemærk: Bemærk: Papain er et sulfhydryl protease, der har bred specificitet for proteinsubstrater. Den papain heri er afledt af latexen fra Carica papaya plante og nedbryder de fleste proteinsubstrater større udstrækning end pankreatiske proteaser. Under dissociationsprocessen der nogle celleskader forårsager DNA, der skal frigives i dissociation medium, som vil forøge viskositeten og gøre pipettering vanskelig. Således er DNase inkluderet i cellen isolation procedure at fordøje DNA'et uden at beskadige de intakte celler. Ovomucoids er glycoprotein proteaseinhibitorer anvendes til at inhibere papain aktivitet efter dissociation trin.
- Ved første brug, rekonstruere albumin ovomucoid inhibitor blanding (hætteglas 4) med 32 ml EBSS (hætteglas 1), og derefter opbevares ved 4 ° C, og brug for efterfølgende isoleringer.Bemærk: Dette giver en opløsning ved en effektiv koncentration på 10 mg ovomucoid inhibitor og 10 mg albumin pr ml.
- Tilsæt 5 ml EBSS (hætteglas 1) til en papain hætteglas (hætteglas 2), hvilket gav en opløsning ved 20 enheder af papain / ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Kontroller at papain løsning synes klart, når fuldstændig opløst, ellers placere hætteglasset i et 37 ° C vandbad i ti minutter, indtil papain er fuldstændigt opløst at sikre fuld aktivitet af enzymet.
- Tilsættes 500 pi EBSS (hætteglas 1) til en DNase hætteglas (hætteglas 3) og blandes skånsomt som DNase er følsom over for forskydning denaturering. Tilsættes 250 pi af DNase opløsningen til hætteglasset indeholdende papain, hvilket resulterer i en slutkoncentration på ca. 20 enheder / ml papain og 0,005% DNase. Gemme den resterende del af DNase hætteglasset til senere brug.
- Placer hakket rotte eller humant væv i papain opløsning som fremstillet i trin 4.4 ovenfor. For det menneskelige væv isolation, opdele det hakkede væv ligeligt mellem topapain hætteglas (ca. 0,2 g / hætteglas).
- Der inkuberes ved 37 ° C med konstant omrøring på en rocker platform til at dissociere vævet i den aktiverede papain opløsning. Inkuber rottevæv i 45 minutter til 1 time, og humant væv i 1 til 2 timer afhængigt af mængden af hakket væv, omkring 0,2-0,4 g hhv.
- Udriv blandingen med en 10 ml pipette at dissociere eventuelle resterende vævsstykker til opnåelse af en uklar cellesuspension. Overfør cellesuspensionen (inkluderer ikke nogen stykker af udissocieret væv) i en steril 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender de pelleterede celler i medium indeholdende ovimucoid, en papain inhibitor.
- Forbered ovimucoid løsning ved at blande 2,7 ml EBSS (hætteglas 1) med 300 pi det rekonstituerede albumin-ovomucoid inhibitoropløsning (hætteglas 4) i en 15 ml konisk rør. Tilføj 150 ul DNase opløsning (hætteglas 3), der er gemt i trin 4.4 ovenfor.
- Kassér supernatanten frade pelleterede celler og straks resuspendere cellepelleten i den fortyndede DNase albumin-inhibitor-blanding.
- Separate intakte celler fra cellemembraner ved centrifugering gennem et enkelt trin diskontinuerlig densitetsgradient.
- Forbered diskontinuerlig densitetsgradient ved tilsætning af 5 ml albumin-inhibitor opløsning (hætteglas 4) til et 15 ml rør, og anvendelse af en 5 ml pipette, forsigtigt og langsomt lag cellesuspensionen (fremstillet som beskrevet ovenfor i trin 4.8) oven på albumin-inhibitor opløsning.
- Centrifuger ved 70 x g i 6 minutter ved stuetemperatur.
- Bemærk: grænsefladen mellem de to lag af gradienten skal være klart synlige, selv minimal opblanding på denne grænse ikke påvirker resultatet. Membranfragmenter forbliver ved grænsefladen og dissocierede celler pelletere ved bunden af røret.
- For rotteceller, supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml rotte EFH medium (forvarmet ved 37 ° C).Tælle levende celledensitet med et hæmocytometer og plade af celler i en T25 dyrkningskolbe ved en densitet på 10 celler / ul i EFH. Det typiske udbytte af celler fra rottevæv er omkring 2 x 10 6 celler med ca. 80% viability.If klonale kulturer der ønskes, frø celler ved en densitet på mindre end 10 celler / ul. Inkubere kolberne ved 37 ° C i 5% CO2 og tillade kulturerne vokse uforstyrret i 1 uge for at undgå aggregering af kugler.
- For humane celler, supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml humant EFH medium (forvarmet ved 37 ° C). Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 um nylon cellefilter fulgt med 30 ml EFH at fjerne myelin og cellemembran fragmenter. Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter og resuspender cellepelleten i 1 ml EFH medium.
- Tælle levende celledensitet med et hæmocytometer og plade de humane celler i 6-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 10 5 celler / brønd i et samlet volumenaf 5 ml EFH / brønd. Det typiske udbytte af celler fra humant væv er omkring 1 x 10 6 celler med ca. 70% levedygtighed. Pre-coat brønde med en vedhængende substrat såsom Matrigel (se note nedenfor). Fortynd i forholdet 40 pi Matrigel: 1 ml SFM.
- Bemærk: Alternativt kan andre vedhæftende substrater, såsom poly-D-lysin / laminin, fibronectin eller collagen anvendes.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 og tillade kulturerne vokse uforstyrret i 1 uge.
5. Passage af Voksen rotte og human rygmarv NSPC-koder
- Rotte NSPC-koder vil danne små neurosfærer ca. 70 um i diameter inden for 1 uge indledende podning; passage rotte NSPC-koder ugentlige ved opsamling af cellesuspensionen, centrifugering ved 300 xg i 5 minutter, og mekanisk triturering cellepelleten at dissociere neurosfærerne.
- Seed de dissocierede celler i T25-kolber indeholdende frisk rotte EFH medium. Alternativtbruge 50% konditioneret rotte medium for passage. Det typiske udbytte af rotte NSPC-koder ved passage er omkring 5 x 10 6 celler, som stiger eksponentielt med passage nummer.
- For de humane kulturer, en uge efter den indledende udpladning, erstatte halvdelen af dyrkningsmediet med frisk EFH to gange ugentligt for at lade cellerne adhærere til substratet. Generelt 1 - 2 uger senere, når cellerne er fastgjort til underlaget, udskifte hele volumen af dyrkningsmedium to gange om ugen med frisk EFH.
- Subkultur celler før nå sammenløb mellem 4-8 uger.
- Subkultur celler ved frigørelse af celler fra substratet enzymatisk (se tabel of Materials) med 2 ml enzym per brønd inkuberet i ca. 10 minutter ved 37 ° C. Indsamle cellesuspension, centrifugeres ved 300 xg i 5 min, og forsigtigt resuspender cellepelleten i 1 ml frisk gjort EFH medium.
- Tæl levende celler med en hæmocytometer og plade cellerne i 6-brønds dyrkningsplader (præ-coated som ovenfor i trin 4.12) ved en densitet på 10 5 celler / brønd i et samlet volumen på 5 ml EFH / brønd. Det typiske udbytte af menneskelige NSPC-koder ved passage er omkring 2 x 10 6 celler og generelt dette vil fordoble med passage. Generelt vedligeholde kulturerne med 50% konditioneret EFH medium 2 - 3 gange om ugen mellem passage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne rotter rygmarv celler dyrket i suspensionskultur i EFH medie vil danne små neurosfærer (kolonier af udifferentierede celler) inden for 1 uge efter indledende udpladning. I primære kulturer, vil de fleste af cellerne udpladet dør og vækstfaktor-responsive stamceller vil proliferere og er udvalgt til i EFH medium. Ved passage 3, vil der være mange fritflydende neurosfærer omkring 100 um i diameter (figur 2A). Neurosfærer er runde og fase-lyse, og under stor forstørrelse, er cilia-lignende microspikes set rager frem fra celler på ydersiden af områder, der er karakteristiske for neurosfærer modsætning klumper af cellerester (figur 2B). Det typiske udbytte af celler fra rottevæv er omkring 2 x 10 6 celler med ca. 80% levedygtighed. Neurosfærerne bør ikke podet ved for høj en densitet til at undgå aggregering af celleklynger. Også, bliver store neurosfærer vanskeligt at adskille og celler vil blivenekrotiske i midten af kuglen. Dette vil også forekomme, hvis kulturer efterlades for længe før passage. I EFH kultur, voksne rotter rygmarv NSPC-koder prolifererer (figur 2C), og udtrykke nestin (figur 2D) en markør for precursorceller, og lave niveauer af modne neurale markører (data ikke vist).
Voksent menneske rygmarv NSPC kulturer vokser ikke så hurtigt som rotte NSPC kulturer. Hvis humane rygmarv celler indledningsvis dyrkes i suspension, vil de danne aggregater og uregelmæssige klynger af små antal celler kombineret med snavs (figur 3A). Efterfølgende passage af disse kulturer ikke fremmer berigelse af NSPC befolkning. Men når de humane celler udplades i EFH på en adhærent monolag, vækstfaktoren-responsive NSPC-koder klæbe til substratet (figur 3B) og efterfølgende medier udskiftning fjerner myelin og cellerester (figur 3C). Det typiske udbytte af calen fra humant væv er omkring 1 x 10 6 celler med ca. 70% levedygtighed. Når de menneskelige NSPC kulturer bliver godt etableret som en klæbende monolag, de NSPC-koder kan så også være belagt i suspensionskulturer at danne frit flydende neurosfærer. I EFH kultur, voksne humane spinal cord NSPC-koder prolifererer (figur 3D), og udtrykke nestin (figur 3E), og Sox2 (figur 3F), til en transskriptionsfaktor vist udtrykkes ved neurale stamceller og meget lave niveauer af modne neurale markører (data ikke vist).
Figur 1. laminektomi af rotte rygmarv og dissektion af periventrikulær region. (A) Ved eksponerede kaudale ende af rygmarven, er rongeurs indsat extradurally i den laterale aspekt af rygmarvskanalen. (B) Små snit er lavet i hinden på hver side af ryghvirvler og den tynde plade er omhyggeligt skrællet væk for at blotlægge rygmarven. (C) Det eksponerede cervikale rygmarv efter laminektomi. (D) Skematisk af thorax vertebral tværsnit, der viser rygmarv og placering af nedskæringer for laminektomi (afbildet med røde stiplede linjer). Lagene og torntappe (skraveret område) fjernes. (E) Rygmarven skæres på tværs i 1 cm segmenter. (F) De overliggende meninges, hvide substans, og det meste af den grå substans fjernes omhyggeligt under anvendelse microscissors. (G ) Hakket periventricular væv. (H) Tværgående afsnit af rotte rygmarv farvet med Luxol hurtigt blå og hemotoxylin og eosin med stiplede omrids viser dissekeret periventricular region. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Voksen rotte rygmarv NSPC-koder. (A) ved passage 3, er talrige neurosfærer ses, når rotte rygmarv NSPC-koder dyrkes i frit flydende suspensionskultur. (B) Neurosfærer er fase-lyse og microspikes stikker ud fra neurosfærerne (pile ) er synlige ved stor forstørrelse. (C) dissocierede neurosfærer (passage 3, dag 4) er udpladet på Matrigel-coatede brønde i EFH medium, faste og immunofarvede og modfarvet med Hoechst for at visualisere cellekerner (blå). I EFH betingelser, voksne rotter rygmarv NSPC-koder formere (som vist med Ki67 immunfarvning), og (D) primært udtrykkelig nestin. Klik her for at se en større version af dette tal.
fo: keep-together.within-side = "altid"> 
Figur 3. voksent menneske rygmarv NSPC-koder. (A) Ved første forgyldt i dyrkningskolber, behøver voksne humane rygmarv NSPC-koder ikke vokse godt. Primære frit flydende kulturer i EFH medium (13 dage efter plating) viser aggregater af celler og snavs. (B) I modsætning, i ubearbejdet vedhængende kulturer i EFH har NSPC-koder knyttet til Matrigel substrat (pile), vist ved 17 dage efter plating, og (C) ved 41 dage in vitro. (D) I EFH medium, voksne humane rygmarv NSPC-koder formere sig, som vist med Ki67-immunfarvning (26 dage in vitro vist) og primært express (E) nestin (26 dage i vitro vist) og (F) Sox2 (66 dage in vitro vist). Kerner modfarvet med Hoechst (blå)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under dissektion af rotte rygmarv væv skal sørges for ikke at beskadige rygmarven, mens de udfører laminektomi. Det er lettere at isolere periventricular væv, når rygmarven segmenter er intakte. De vævssegmenter bør være fuldt nedsænket i dissektion buffer og de overliggende meninges og hvid substans kan skæres væk som langsgående strimler med microscissors. Alternativt kan fine væv pincet anvendes til at skrælle den hvide substans væk.
For proceduren for NSPC-koder isolation, vi brugte en papain-EDTA-dissociation metode kombineret med mekanisk findeling at dissociere rotte og human rygmarv væv. Sammenlignet med andre proteaser, papain er mindre skadelig, men effektiv, som tidligere vist med dissociering af postnatal rotte corticale neuroner 11. Vi fandt, at dissociation med kun mekanisk findeling, ofte sammen med føtalt væv, er ikke så effektiv med væv fra voksne. Efter the enzymatisk dissociation, mekanisk triturering er vigtigt at bryde op de resterende vævsfragmenter. Triturering med gentagne celle dispersion med en pipette skal udføres så der er ingen resterende intakte vævsfragmenter resulterer i en uklar cellesuspension. Imidlertid bør triturering ikke udføres for stærkt at undgå bobledannelse af cellesuspensionen og resulterende celledød.
For passage, er rotte neurosfærer dissocieret til en enkelt cellesuspension via mekanisk triturering, som oprindeligt blev beskrevet 2. Dog kan neurosfærer også adskilles ved anvendelse af enzymatiske metoder, såsom trypsin-EDTA som ikke vil beskadige celleoverfladereceptorer eller forstyrre kugle formation, så længe enzymatisk eksponering er kort 12.
Der er en række fordele ved at bruge neurosfæren assayet til kultur NSPC-koder. Det er relativt simpelt, reproducerbar og giver mulighed for den hurtige ekspansion af neurale stam- cells 2,12. Men neurosfærer er heterogene, som primært omfatter progenitorceller, som er mere begrænset og kun et lille antal af stamceller. Flere faktorer såsom celletæthed og passage teknik kan påvirke fænotypen af kulturerne, og neurosfærer kan også danne fra progenitorceller 13. Neurosfærer er meget motile og kan smelte selv under betingelser med lav celletæthed 14. Således ikke antallet af neurosfærer i kultur ikke repræsenterer antallet af stamceller. At skelne neurale stamceller fra progenitorceller, bør man benytte neurale-kolonidannende celle assay 15,16.
Voksen rotte rygmarv NSPC-koder vokser samt neurosfærer i suspension kultur i EFH suppleret medium og er let udvides. I modsætning hertil har vi fundet, at voksne humane rygmarven NSPC-koder vokser bedre som en adhærent monolag 10. Menneskelige hjerne-afledte neurale stamceller kan opretholdes på længere sigt i monolag kulture i et kemisk defineret medium i nærvær af mitogener, som fremmer deres proliferative kapacitet 17,18. Som beskrevet i denne protokol, kan NSPC-koder isoleres fra voksent menneske rygmarven fra organtransplanterede donorer og passeret og udvidet som en klæbende monolag i nærværelse af EGF, bFGF og heparin 10. Det er lettere at isolere NSPC-koder fra yngre end ældre donorer som cellerne udvider hurtigere, selvom NSPC-koder stadig kunne isoleres fra donorer op til vores maksimum 60 år 10. Vi har undersøgt en række forskellige adhærente substrater, såsom Matrigel, fibronectin, collagen type I og poly-D-lysin / laminin, og fundet disse at være effektive til vedhæftning af voksent menneske rygmarv NSPC-koder 10. I første omgang både neurosfære og vedhængende kulturer indeholder cellulære aggregater, vragrester, og døde celler. Men dette vragrester progressivt fjernes med subkultivering og vækstfaktor-berigede Neurobasal medium udvælger de prolifererende NSPC-koder. Også snavs og myelin forurening kan reduceres med omhyggelig dissektion og fjernelse af hvide substans fra rygmarven væv segmenter. Filtrering af den resulterende cellesuspension gennem en si før udpladning fjerner også myelin.
Vi har dyrkede voksne humane rygmarven NSPC-koder som adhærente monolag i mindst ni måneder omfattende ca. 10 passager, men i ældre kulturer der er øget risiko for karyotypic abnormiteter. Vi udførte karyotype analyse på menneskelige NSPC-koder dyrket i 4 måneder og fandt en normal diploid karyotype uden kromosomafvigelser (data ikke vist). Vi fandt også, celleproliferation og kapaciteten til at differentiere til oligodendrocytter faldt med øget tid i kultur. For eksempel er den relative procentdel af O4 positive celler faldt fra 1,3% til 1 måned i kultur til 0,01% efter 4 måneder i kultur 10. Både rotte og menneskelige NSPC-koder er modtagelig for kryopræservering hjælp standard frysning mødterække tværgå- ende og viser ingen signifikante forskelle i fænotypisk profil.
Isolering og udvidelse af multipotente NSPC-koder i kultur giver mulighed for flere in vitro applikationer, herunder en undersøgelse af forskellige faktorer på voksen neural stamcelle differentiering. Stigende antal NSPC-koder kan genereres in vitro og transplanteret ind i dyremodeller, såsom rygmarvsskade, slagtilfælde og neurodegenerativ sygdom at undersøge den reparative respons af disse neurale stamceller in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
