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Developmental Biology

Periventricular वयस्क चूहे के क्षेत्र और मानव रीढ़ की हड्डी से तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अलगाव

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52732
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

Abstract

वयस्क चूहे और वृद्धि कारक समृद्ध माध्यम में सुसंस्कृत मानव रीढ़ की हड्डी तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NSPCs), स्वयं renewing, और विस्तार तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं multipotent के प्रसार के लिए अनुमति देता है। सीरम स्थितियों में, इन multipotent NSPCs न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes पैदा करने, अलग होगा। काटा ऊतक bFGF (enzymatically एक papain-EDTA समाधान में अलग और फिर यंत्रवत् epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ पूरक Neurobasal मध्यम, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक के रूप में चढ़ाया जाता है, जो एक एकल कक्ष निलंबन की उपज के लिए अलग और एक असंतत घनत्व ढाल के माध्यम से अलग किया जाता है ), और हेपरिन। वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs पक्षपाती संस्कृतियों के रूप में बड़े हो रहे हैं मुक्त अस्थायी neurospheres और वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs के रूप में संवर्धित कर रहे हैं। इन शर्तों के तहत, वयस्क रीढ़ की हड्डी NSPCs अग्रदूत साबित कोशिकाओं के व्यक्त मार्करों, पैदा करना, और लगातार बीतने पर विस्तार किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को ख कर सकते हैंई विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में इन विट्रो में अध्ययन किया है, और exogenous कारकों तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव की जांच करने के वंश प्रतिबंध को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Multipotent NSPCs या उनके वंशज भी पुनर्योजी मरम्मत का आकलन करने के लिए विभिन्न पशु मॉडल में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

Introduction

NSPCs स्वयं को नवीनीकृत और आसानी से इन विट्रो में विस्तार कर सकते हैं कि तंत्रिका वंश के लिए प्रतिबद्ध multipotent कोशिकाओं रहे हैं। वे स्वयं renewing multipotent स्टेम कोशिकाओं और अधिक प्रतिबंधित progenitors के गुणों को प्रदर्शित बाद से हम न्यूरल स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी के रूप में इन कोशिकाओं को देखें। NSPCs भ्रूण और वयस्क मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 1,2 दोनों में पाए जाते हैं। वयस्क में, NSPCs सामान्य रूप से मौन हैं और पार्श्व निलय 2-4 अस्तर subventricular क्षेत्र, और रीढ़ की हड्डी 5,6 के मध्य नहर के आसपास के periventricular क्षेत्र सहित विशिष्ट niches के भीतर रहते हैं।

आमतौर पर, NSPCs EGF और bFGF के साथ पूरक सीरम मुक्त माध्यम में मुक्त अस्थायी neurospheres के रूप में या पक्षपाती monolayers, स्टेम / पूर्वज सेल आबादी के लिए चयन करें जो mitogens के रूप में संवर्धित कर रहे हैं। मूल रूप से रेनॉल्ड्स और वेइस 2 द्वारा विकसित neurosphere परख, सबसे अधिक संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है औरतंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार। वे विकास का पहलू मुक्त माध्यम से युक्त सीरम में चढ़ाया जाता है जब NSPCs न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes में फर्क, multipotency दिखा। सुसंस्कृत ऊतक केंद्रीय नहर 6,7 के क्षेत्रों में शामिल हैं जब multipotent, स्वयं renewing NSPCs वयस्क कृंतक से रीढ़ की हड्डी को अलग किया और संवर्धित किया जा सकता है। अन्य क्षेत्रों से कोशिकाओं को पैदा करने के लिए विरोध के रूप में वयस्क रीढ़ की हड्डी से उत्पन्न NSPCs का उपयोग करने में एक संभावित लाभ इन ऊतक विशेष कोशिकाओं को सबसे अधिक बारीकी से चोट या बीमारी निम्नलिखित खो दिया है या क्षतिग्रस्त हो रहे हैं कि रीढ़ की हड्डी में कोशिकाओं जैसा दिख रहा है।

पिछला काम वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी से व्युत्पन्न neurospheres के लिए लंबे समय तक प्रचारित या कोशिकाओं 8,9 के लिए पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए passaged नहीं किया जा सका है कि दिखाया। हालांकि, संवर्धन की स्थिति में संशोधनों के साथ, हम प्रदर्शन, वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी व्युत्पन्न NSPCs के विस्तार और प्रत्यारोपण की रिपोर्ट है कि स्वयं renewingऔर multipotent NSPCs अंग प्रत्यारोपण दाताओं 10 के वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी से अलग किया जा सकता है। जाहिर है, विकास का पहलू समृद्ध माध्यम में एक पक्षपाती सब्सट्रेट पर विच्छेदन और इन कोशिकाओं संवर्धन के दौरान सफेद पदार्थ के सबसे को हटाने के वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs proliferating के लिए चुना। इस प्रोटोकॉल में हम वयस्क चूहे से और मानव अंग प्रत्यारोपण दाताओं, periventricular ऊतक के विच्छेदन, और NSPCs के अलगाव, संस्कृति और विस्तार से रीढ़ की हड्डी की कटाई का वर्णन है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद द्वारा तैयार की प्रायोगिक पशुओं की देखभाल और उपयोग करने के लिए गाइड में स्थापित नीतियों के अनुसार, कनाडा पर पशु की देखभाल विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क की समिति, टोरंटो द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं। मानव रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की कटाई के लिए, अनुमोदन विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क रिसर्च एथिक्स बोर्ड से और कनाडा के ओंटारियो में अंग दान की देखरेख करते हैं जो जीवन फाउंडेशन के Trillium-उपहार से प्राप्त हुई थी।

विच्छेदन बफ़र और संस्कृति मीडिया के 1. तैयारी

  1. चूहे रीढ़ की हड्डी के अलगाव के लिए, 100 मिलीलीटर विच्छेदन बफर (1x पीबीएस + 0.6% ग्लूकोज + 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) और सर्द तैयार करते हैं। मानव रीढ़ की हड्डी के लिए 100 मिलीलीटर विच्छेदन बफर (1x HBSS + 0.6% ग्लूकोज + 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) और सर्द तैयार करते हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 100 मिलीलीटर सीरम मुक्त मध्यम (SFM) और गर्म तैयार करें। SFM तैयार करने के लिए, 2 मिमी एल glutamine जोड़ने के लिए, 100 माइक्रोग्राम / मीNeurobasal-एक माध्यम एल स्ट्रेप्टोमाइसिन पेनिसिलिन, 2% B27, और 10% हार्मोन मिश्रण। हार्मोन मिश्रण तैयार करने के लिए, एक 1 बनाना: 0.6% ग्लूकोज युक्त 1 DMEM / F12 मध्यम, 3 मिमी NaHCO 3, 5 मिमी HEPES, 25 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल एपीओ-transferrin, 10 माइक्रोन प्यूटर्साइन, 30 एनएम सेलेनियम, और 20 एनएम प्रोजेस्टेरोन।
  3. EFH वृद्धि कारक समृद्ध चढ़ाना मीडिया तैयार 37 डिग्री सेल्सियस और गर्म (SFM 20 एनजी / एमएल EGF, 20 एनजी / एमएल bFGF, और 2 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन जोड़ने के लिए)। मानव EFH पुनः संयोजक मानव विकास कारकों (सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं सुनिश्चित करें।

2. फसल काटने वाले और वयस्क चूहे Periventricular रीढ़ की हड्डी ऊतक के विच्छेदन

  1. इथेनॉल में विदारक उपकरणों जीवाणुरहित और अग्रिम में बाँझ खारा, या आटोक्लेव उपकरणों में कुल्ला। चूहे दो - एक संस्था के अनुसार (6 से 8 सप्ताह पुराना) सोडियम pentobarbital (65 मिलीग्राम / एमएल में 1 सीसी) या संवेदनाहारी (यानी, 4% isofluorane) की अधिक मात्रा के एक घातक इंजेक्शन पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी। डी70% इथेनॉल के साथ चूहे के पीछे Ouse और बड़े विच्छेदन कैंची के साथ पृष्ठीय सतह पर त्वचा को हटा दें।
  2. पृष्ठीय सतह पर सीधा कैंची होल्डिंग, transversely hindlimbs से ऊपर कशेरुका स्तंभ काटा। अनुलंबीय spinous प्रक्रियाओं को बेनकाब करने के लिए एक व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में कशेरुका स्तंभ overlying पृष्ठीय मांसपेशियों में कटौती करने के लिए छोटे कैंची का प्रयोग करें।
  3. उजागर दुम अंत में शुरू, रीढ़ की हड्डी और कशेरुका स्तंभ के बीच अंतरिक्ष में रीढ़ की हड्डी में नहर के पार्श्व पहलू में extradurally Rongeurs या एक छोटे से कुंद हड्डी काटने के साधन डालें। पटल में छोटे कटौती (बाएं बोनी मेहराब और कशेरुकाओं के प्रत्येक पक्ष पर spinous प्रक्रियाओं का अधिकार) और ध्यान से रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1 ए डी) को बेनकाब करने के पटल दूर छील। ब्लेड के कोण उथला है सुनिश्चित करें और अंतर्निहित रीढ़ की हड्डी क्षतिग्रस्त नहीं है इसलिए की हड्डी के समानांतर।
  4. Expos के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में laminectomy जारी रखेंवक्ष और गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी ई।
  5. धीरे ध्यान से कॉर्ड जारी करने के लिए जड़ों तोड़ कुंद ऊतक संदंश और उपयोग microscissors के साथ कशेरुका स्तंभ से रीढ़ की हड्डी आबकारी। (1.1 में ऊपर वर्णित है) 4 डिग्री सेल्सियस बाँझ चूहा विच्छेदन बफर युक्त एक पेट्री डिश में excised रीढ़ की हड्डी रखें। हौसले से तैयार 4 डिग्री सेल्सियस विदारक बफर में ऊतक कुल्ला और का उपयोग कर कैंची 1 सेमी खंडों (चित्रा 1E) में transversely रीढ़ की हड्डी में कटौती।
  6. ऊतक के प्रत्येक खंड के लिए, ठीक संदंश के साथ ऊतक धारण करने के लिए एक हाथ का उपयोग करें। दूसरे हाथ से, ध्यान से एक विदारक गुंजाइश की सहायता से overlying तानिका, सफेद पदार्थ, और ग्रे मामले से अधिकांश को दूर करने के लिए microscissors के उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, ependyma और ग्रे मैटर (चित्रा 1F-एच) के आस-पास की एक छोटी राशि शामिल है, जो रीढ़ की हड्डी के केवल periventricular क्षेत्र छोड़ रहा है, ग्रे और सफेद पदार्थ का सबसे दूर छील करने के लिए ठीक संदंश (4 ड्यूमॉन्ट #) का उपयोग करें।
  7. ठंड चूहे विच्छेदन बफर युक्त एक 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में विच्छेदित periventricular ऊतक पूल।

3. फसल काटने वाले और वयस्क मानव Periventricular रीढ़ की हड्डी ऊतक के विच्छेदन

नोट: अन्य अंगों अंग प्रत्यारोपण के लिए हटा दिया गया है के बाद मानव रीढ़ की हड्डी के ऊतकों वयस्क अंग प्रत्यारोपण दाताओं से काटा जाता है (दाताओं उम्र के 2 से 60 वर्ष से उम्र में लेकर)। लाइफ कार्यक्रम के Trillium-गिफ्ट रोगी के परिवार से अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ऊतक को हटाने के लिए सहमति प्राप्त है और हम महाधमनी पार क्लेम्पिंग के 2 घंटे के भीतर डोरियों फसल के लिए सक्षम किया गया है कि इस तरह के एक समय पर फैशन में हमारे कटाई टीम को सूचित करता है। पुरुष और महिला वयस्क नकारात्मक सीरम विज्ञान के साथ दाताओं और कोई संक्रमण स्वीकार कर रहे हैं।

  1. एक ही पूर्वकाल लोगों तक पहुंचाने का उपयोग कर एक पूर्वकाल दृष्टिकोण के माध्यम से ऑपरेटिंग कमरे में एक बाँझ फैशन में हार्वेस्ट ऊतक पहले से ही अंग transp द्वारा अंग को हटाने के लिए विच्छेदितlant कटाई टीम।
  2. बड़े पसली spreaders और बड़े रक्त वाहिकाओं सहित शेष ऊतकों और अंगों के बड़े चप्पू retractors साथ त्याग के माध्यम से पूर्वकाल स्पाइनल कॉलम बेनकाब।
  3. Resected होने के लिए कशेरुका स्तंभ के वांछित लंबाई के व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम सिरों पर intervertebral डिस्क के माध्यम से कटौती करने के लिए एक लंबे ब्लेड के साथ मुहिम शुरू की एक sternal देखा प्रयोग करें। कोण देखा बारे में 45 डिग्री मध्यवर्ती स्पाइनल कैनाल की बस कमी को रोकने कशेरुका निकायों के पार्श्व भाग से एक त्रिकोणीय गर्त में कटौती करने के लिए।
  4. सामूहिक ड्यूरा के माध्यम से काटने से बचने के ख्याल रख रही घुमावदार osteotomes और लकड़ी का हथौड़ा की सहायता से वांछित क्षेत्रों की कशेरुका निकायों के औसत दर्जे का पहलुओं निकालें। फिर धीरे दांतेदार संदंश के साथ ड्यूरा कवर रीढ़ की हड्डी उठा और तेजी से हड्डी के व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम समाप्त होता काटकर अलग कर देना। द्विपक्षीय स्तर पर अलग-अलग जड़ों आड़ा काट करने के लिए लंबे समय से कैंची और संदंश का प्रयोग करें।
  5. 4 डिग्री में रीढ़ की हड्डी के excised खंड रखें; सी बाँझ बफर (1x HBSS + 0.6% ग्लूकोज + 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) टिशू कल्चर कमरे में परिवहन के लिए एक बड़ी टेस्ट ट्यूब में।

  6. नोट: आम तौर पर, एक 3 - ऊपरी वक्ष से रीढ़ की हड्डी के 6 सेमी खंड और / या मध्य-से-कम वक्ष स्तर के रूप में जल्द से जल्द संचलन की समाप्ति के बाद बाँझ शर्तों के तहत ऑपरेटिंग कमरे में हटा दिया है और ठंड बाँझ बफर में रखा गया है । संचलन की समाप्ति और रीढ़ की हड्डी को हटाने के बीच गुजरे समय दान के लिए लक्षित अंगों फसल के लिए आवश्यक समय के साथ बदलता रहता है और 45 मिनट से 2 बजे तक बताया गया है। हृदय और फेफड़ों को भी हटा दिया गया है, तो विच्छेदन के रूप में अच्छी तरह से कम ग्रीवा की हड्डी के एक हिस्से को फसल के लिए अब तक rostrally लिया जा सकता है।
  7. 3 घंटे के भीतर आम तौर पर, फसल कटाई के बाद जितनी जल्दी हो सके मानव रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को काटना। संदंश के साथ ड्यूरा और अन्य तानिका निकालें। ताजा बना 4 डिग्री सेल्सियस विच्छेदन बफर में रीढ़ की हड्डी के ऊतकों कुल्ला और1 सेमी खंडों में transversely काटा।
  8. एक विदारक गुंजाइश की सहायता के साथ, प्रत्येक ऊतक खंड के लिए ऊतक संदंश, ठीक संदंश और microscissors का उपयोग कर ग्रे मामले की सबसे overlying तानिका, सफेद पदार्थ उत्पाद शुल्क, और। ठंड मानव विच्छेदन बफर युक्त एक 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में ependyma और आसपास के ग्रे मैटर की एक छोटी राशि, जो भी शामिल है विच्छेदित periventricular ऊतक, पूल।

4. अलगाव और संवर्धन वयस्क चूहे और मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs की

  1. एक लामिना का प्रवाह हुड में aseptically निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    1. Microscissors के साथ 1 मिमी 3 टुकड़ों में विच्छेदित चूहे या मानव periventricular ऊतक कीमा।
    2. Enzymatically सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका में संकेत के रूप papain हदबंदी किट का उपयोग कर एंजाइमों के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक अलग कर देना। नोट: अभिकर्मक घटकों 4 शीशियों में शामिल हैं; शीशी 1: अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS), शीशी 2: Papain containinजी एल सिस्टीन और EDTA, शीशी 3: Deoxyribonuclease मैं (DNase), शीशी 4: गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ Ovomucoid protease अवरोध करनेवाला।
      नोट: नोट: Papain प्रोटीन substrates के लिए विस्तृत विशिष्टता है कि एक sulfhydryl प्रोटीज है। papain इस के साथ साथ Carica पपीता के पौधे से लेटेक्स से ली गई है और सबसे अधिक प्रोटीन substrates के अधिक बड़े पैमाने पर की तुलना में अग्नाशय प्रोटिएजों degrades है। हदबंदी प्रक्रिया के दौरान चिपचिपापन बढ़ाने के लिए और मुश्किल pipetting जो कर देगा हदबंदी माध्यम में रिलीज होने के लिए कुछ सेल क्षति के कारण डीएनए है। इस प्रकार, DNase बरकरार कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना डीएनए को पचाने के लिए सेल अलगाव की प्रक्रिया में शामिल है। Ovomucoids हदबंदी कदम के बाद papain गतिविधि को बाधित करने के लिए इस्तेमाल प्रोटीज इनहिबिटर्स ग्लाइकोप्रोटीन कर रहे हैं।
  2. पहली बार उपयोग में, EBSS (शीशी 1) के 32 मिलीलीटर के साथ एल्बुमिन ovomucoid अवरोध करनेवाला मिश्रण (शीशी 4) पुनर्गठन, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और बाद isolations के लिए इस्तेमाल करते हैं।नोट: यह ovomucoid अवरोध करनेवाला के 10 मिलीग्राम और मिलीलीटर प्रति एल्बुमिन की 10 मिलीग्राम की एक प्रभावी एकाग्रता में एक समाधान पैदावार।
  3. 0.5 मिमी EDTA के साथ 1 मिमी एल सिस्टीन में papain / एमएल की 20 इकाइयों पर एक समाधान उपज, एक papain शीशी (शीशी 2) को EBSS (शीशी 1) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। Papain पूरी तरह से एंजाइम की पूरी गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए भंग कर रहा है जब तक अन्यथा दस मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी जगह है, पूरी तरह से भंग कर दिया जब papain समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है कि जाँच करें।
  4. (3 शीशी) एक DNase शीशी EBSS (शीशी 1) के 500 μl जोड़ें और DNase विकृतीकरण कतरनी के प्रति संवेदनशील है के रूप में धीरे मिश्रण। लगभग 20 इकाइयों / एमएल papain और 0.005% DNase के अंतिम एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप, papain युक्त शीशी DNase समाधान के 250 μl जोड़ें। बाद में उपयोग करने के लिए DNase शीशी के संतुलन को बचाओ।
  5. ऊपर चरण 4.4 में तैयार के रूप में papain समाधान में कीमा बनाया हुआ चूहे या मानव ऊतक रखें। मानव ऊतक अलगाव के लिए, दोनों के बीच समान रूप से कीमा बनाया हुआ ऊतक विभाजितpapain शीशियों (लगभग 0.2 ग्राम / शीशी)।
  6. सक्रिय papain समाधान में ऊतक अलग कर देना करने के लिए एक घुमाव मंच पर लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 0.4 जी क्रमशः - के बारे में 0.2 कीमा बनाया हुआ ऊतक, की राशि के आधार पर 1 से 2 बजे के लिए 45 1 घंटा मिनट, और मानव ऊतक के लिए चूहा ऊतक सेते हैं।
  7. एक बादल सेल निलंबन की उपज के लिए किसी भी शेष ऊतक के टुकड़े को अलग कर देना करने के लिए एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ मिश्रण Triturate। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन (undissociated ऊतक के किसी टुकड़े को शामिल नहीं है) स्थानांतरण।
  8. , मध्यम युक्त ovomucoid में एक papain अवरोध करनेवाला pelleted कोशिकाओं Resuspend।
    1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पुनर्गठित एल्बुमिन-ovomucoid अवरोध करनेवाला समाधान (शीशी 4) के 300 μl के साथ 2.7 मिलीलीटर EBSS (शीशी 1) के मिश्रण से ovomucoid समाधान तैयार है। ऊपर चरण 4.4 पर बचाया (3 शीशी) DNase समाधान के 150 μl जोड़ें।
    2. से सतह पर तैरनेवाला त्यागेंpelleted कोशिकाओं और तुरंत पतला DNase एल्बुमिन-अवरोध करनेवाला मिश्रण में सेल गोली resuspend।
  9. एक भी कदम असंतत घनत्व ढाल के माध्यम से centrifugation द्वारा कोशिका झिल्ली से अलग बरकरार कोशिकाओं।
    1. के शीर्ष पर धीरे, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब (4 शीशी) एल्बुमिन-अवरोध करनेवाला समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ने, और एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके असंतत घनत्व ढाल तैयार है और धीरे-धीरे सेल निलंबन लेयर (कदम 4.8 में ऊपर वर्णित के रूप में तैयार) एल्बुमिन-अवरोध करनेवाला समाधान।
    2. आरटी पर 6 मिनट के लिए 70 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. नोट: इस सीमा पर कम से कम मिश्रण परिणाम को प्रभावित नहीं करता है, हालांकि ढाल की दो परतों के बीच इंटरफेस है, स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए। झिल्ली टुकड़े इंटरफेस में रहते हैं और अलग कोशिकाओं ट्यूब के नीचे गोली।
  10. चूहे की कोशिकाओं के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और चूहे EFH माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म)।एक रुधिरकोशिकामापी के साथ लाइव सेल घनत्व की गणना और EFH में / μl 10 कोशिकाओं के घनत्व पर एक T25 संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं थाली। चूहे के ऊतकों से कोशिकाओं की खासियत उपज / μl कम से कम 10 कोशिकाओं के घनत्व में वांछित हैं के बारे में 80% viability.If प्रतिरूप संस्कृतियों, बीज कोशिकाओं के साथ के बारे में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं है। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर बोतल सेते हैं और 1 सप्ताह क्षेत्रों के एकत्रीकरण से बचने के लिए संस्कृतियों अबाधित विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  11. मानव कोशिकाओं के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मानव EFH माध्यम के 10 एमएल में सेल गोली resuspend (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म)। एक 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर माइलिन और कोशिका झिल्ली टुकड़े को दूर करने के लिए EFH के 30 मिलीलीटर के साथ पीछा किया। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और EFH माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  12. एक रुधिरकोशिकामापी के साथ लाइव सेल घनत्व की गणना और कुल मात्रा में अच्छी तरह / 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में मानव कोशिकाओं थाली5 मिलीलीटर की EFH / अच्छी तरह से। मानव ऊतकों से कोशिकाओं की खासियत उपज के बारे में 70% व्यवहार्यता के साथ लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं है। ऐसे Matrigel के रूप में एक पक्षपाती सब्सट्रेट के साथ प्री-कोट कुओं (नीचे नोट देखें)। 1 मिलीलीटर SFM: 40 μl Matrigel के अनुपात में पतला।
  13. नोट: वैकल्पिक रूप से, इस तरह के पाली-डी lysine / laminin, फ़ाइब्रोनेक्टिन, या कोलेजन के रूप में अन्य पक्षपाती substrates के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  14. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं और संस्कृतियों 1 सप्ताह के लिए अबाधित विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।

वयस्क चूहे और मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs 5. Passaging

  1. चूहा NSPCs छोटे neurospheres के प्रारंभिक बोने के 1 हफ्ते के भीतर व्यास में लगभग 70 माइक्रोन के रूप में होगा; , सेल निलंबन का संग्रह 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging, और यंत्रवत् neurospheres अलग कर देना करने के लिए सेल गोली triturating द्वारा साप्ताहिक बीतने चूहे NSPCs।
  2. ताजा चूहे EFH मध्यम युक्त T25 बोतल में अलग कोशिकाओं बीज। वैकल्पिक रूप से,passaging के लिए 50% वातानुकूलित चूहे माध्यम का उपयोग। passaging पर चूहा NSPCs के विशिष्ट उपज बीतने संख्या के साथ तेजी से बढ़ जाती है, जिसके बारे में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं है।
  3. मानव संस्कृतियों के लिए, एक सप्ताह के प्रारंभिक चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं सब्सट्रेट का पालन करने की अनुमति देने के लिए साप्ताहिक दो बार ताजा EFH के साथ संस्कृति के माध्यम से आधे की जगह। आम तौर पर, 1 - 2 हफ्ते बाद कोशिकाओं सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न है, एक बार नए सिरे से EFH के साथ एक सप्ताह में दो बार संस्कृति के माध्यम से पूरी मात्रा की जगह।
  4. 8 सप्ताह - 4 के बीच संगम तक पहुँचने से पहले उपसंकृति कोशिकाओं।
    1. अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 10 मिनट के लिए incubated प्रति enzymatically सब्सट्रेट से कोशिकाओं को निकाल कर उपसंकृति कोशिकाओं एंजाइम के 2 मिलीलीटर के साथ (सामग्री की तालिका देखें)। 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन, अपकेंद्रित्र ले लीजिए, और धीरे ताजा बना EFH माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
    2. एक रुधिरकोशिकामापी के साथ लाइव कोशिकाओं की गणना और 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं प्लेट (पूर्व सहऊपर के रूप में कदम 4.12 में) 10 5 कोशिकाओं के घनत्व / कुएं में अच्छी तरह / 5 एमएल EFH की कुल मात्रा में पैदा। passaging पर मानव NSPCs के विशिष्ट उपज के बारे में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं है और आम तौर पर इस मार्ग के साथ दोगुनी हो जाएगी। Passaging के बीच प्रति सप्ताह 3 बार - आम तौर पर, 50% वातानुकूलित EFH मध्यम के साथ 2 संस्कृतियों को बनाए रखने।

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Representative Results

EFH माध्यम में निलंबन संस्कृति में विकसित वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं को प्रारंभिक चढ़ाना के 1 हफ्ते के भीतर छोटे neurospheres (undifferentiated कोशिकाओं की कालोनियों) के रूप में होगा। प्राथमिक संस्कृतियों में, चढ़ाया कोशिकाओं के सबसे मर जाएगा और विकास के कारक जिम्मेदार स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना होगा और EFH माध्यम में के लिए चुने गए हैं। पारित होने के 3 तक, कई मुक्त अस्थायी neurospheres के बारे में 100 माइक्रोन व्यास (2A चित्रा) में किया जाएगा। Neurospheres दौर और चरण-उज्ज्वल रहे हैं, और उच्च वृद्धि के तहत, सिलिया की तरह microspikes सेल मलबे (चित्रा 2 बी) के clumps के विपरीत neurospheres के लक्षण हैं जो क्षेत्रों के बाहर की कोशिकाओं से फैला हुआ देखा जाता है। चूहे के ऊतकों से कोशिकाओं की खासियत उपज के बारे में 80% व्यवहार्यता के साथ के बारे में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं है। neurospheres सेल समूहों के एकत्रीकरण से बचने के लिए भी एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बड़े neurospheres अलग कर देना करने के लिए मुश्किल हो गया है और कोशिकाओं बन जाएगाक्षेत्र के केंद्र में परिगलित। संस्कृतियों passaging के पहले भी लंबे समय के लिए छोड़ दिया जाता है, तो यह भी हो जाएगा। EFH संस्कृति में, वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs (चित्रा -2) पैदा करना और अग्रदूत साबित कोशिकाओं के लिए nestin (चित्रा 2 डी) एक मार्कर व्यक्त, और परिपक्व तंत्रिका मार्कर के निम्न स्तर (डेटा) नहीं दिखाया।

वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPC संस्कृतियों चूहे NSPC संस्कृतियों के रूप में के रूप में तेजी से विकसित नहीं है। मानव रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं शुरू निलंबन में संवर्धित कर रहे हैं, वे समुच्चय और मलबे (चित्रा 3) के साथ संयुक्त कोशिकाओं की कम संख्या के अनियमित समूहों बनेगी। इन संस्कृतियों के बाद passaging के NSPC आबादी के संवर्धन को बढ़ावा नहीं करता है। मानव कोशिकाओं को एक पक्षपाती monolayer पर EFH में चढ़ाया जाता है हालांकि, जब वृद्धि कारक जिम्मेदार NSPCs सब्सट्रेट (3B चित्रा) और बाद में मीडिया प्रतिस्थापन का पालन करना माइलिन और सेल मलबे (चित्रा -3 सी) को हटा। सी के विशिष्ट उपजमानव ऊतकों से एल के बारे में 70% व्यवहार्यता के साथ लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं है। मानव NSPC संस्कृतियों में अच्छी तरह से एक पक्षपाती monolayer के रूप में स्थापित हो जाते हैं, NSPCs फिर भी मुक्त अस्थायी neurospheres के लिए फार्म का निलंबन संस्कृतियों में चढ़ाया जा सकता है। EFH संस्कृति में, वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs (चित्रा 3 डी) पैदा करना और nestin (3E चित्रा) और Sox2 (चित्रा 3F) एक्सप्रेस, दिखाया एक प्रतिलेखन कारक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, और परिपक्व तंत्रिका मार्कर का स्तर बहुत कम (डेटा द्वारा व्यक्त की जा करने के लिए नहीं दिखाया)।

चित्र 1
चूहे रीढ़ की हड्डी और periventricular क्षेत्र के विच्छेदन 1. Laminectomy चित्रा। (ए) रीढ़ की हड्डी के उजागर दुम अंत में, Rongeurs स्पाइनल कैनाल के पार्श्व पहलू में extradurally डाला जाता है। (बी) के छोटे कटौती प्रत्येक एसआई पर पटल में बना रहे हैंकशेरुकाओं और पटल के डी ध्यान से रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए दूर खुली है। (सी) laminectomy के बाद उजागर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी। वक्ष वर्टिब्रल पार अनुभाग (डी) योजनाबद्ध रीढ़ की हड्डी और laminectomy के लिए बने कटौती के स्थान दिखा रहा है (दर्शाया ) लाल बिंदीदार लाइनों के साथ। laminae और spinous प्रक्रिया (छायांकित क्षेत्र) हटा रहे हैं। (ई) रीढ़ की हड्डी 1 सेमी खंडों में transversely कट जाता है। (एफ) overlying तानिका, सफेद पदार्थ, और ग्रे बात की सबसे अधिक ध्यान microscissors का उपयोग कर निकाल दिया जाता है। (जी ) कीमा periventricular ऊतक। (विच्छेदित periventricular क्षेत्र दिखा बिंदीदार रूपरेखा के साथ luxol तेजी से नीले और hemotoxylin और eosin के साथ दाग चूहे रीढ़ की हड्डी के एच) अनुप्रस्थ अनुभाग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs मुक्त अस्थायी निलंबन संस्कृति में बड़े हो रहे हैं जब चित्रा 2. वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs। (ए) के पारित होने के 3 तक, कई neurospheres देखा जाता है। (बी) Neurospheres चरण उज्ज्वल है और neurospheres से फैलने वाला microspikes (तीर ) उच्च वृद्धि पर स्पष्ट कर रहे हैं। (सी) अलग neurospheres (बीतने के 3, 4 दिन), EFH माध्यम में Matrigel लेपित कुओं पर चढ़ाया तय है, और immunostained और नाभिक (नीला) कल्पना करने के लिए Hoechst के साथ counterstained कर रहे हैं। (Ki67 immunostaining के साथ दिखाया गया है), और (डी) मुख्य रूप से व्यक्त nestin। EFH परिस्थितियों में, वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs पैदा करना इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

के लिए: रख-together.within-पेज = "हमेशा"> चित्र तीन
चित्रा 3. वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs। (ए) के शुरू में संस्कृति बोतल में चढ़ाया करते हैं, वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs अच्छी तरह से जाना नहीं है। कोशिकाओं और मलबे के शो समुच्चय (13 दिन चढ़ाना के बाद) EFH माध्यम में प्राथमिक मुक्त अस्थायी संस्कृतियों। (बी) के विपरीत, EFH में प्राथमिक पक्षपाती संस्कृतियों में, NSPCs के बाद 17 दिनों में दिखाया गया है, Matrigel सब्सट्रेट (तीर) से जुड़ा हुआ है 26 दिनों में ((इन विट्रो में 26 दिनों दिखाया गया है) Ki67 immunostaining के साथ दिखाया गया के रूप में इन विट्रो में 41 दिनों में चढ़ाना, और (सी)। (डी) EFH माध्यम में, वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs, पैदा करना, और मुख्य रूप से एक्सप्रेस (ई) nestin इन विट्रो) इन विट्रो में 66 दिनों से पता चला (दिखाया गया है) और (च) Sox2। नाभिक Hoechst (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं।/ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चूहे रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की देखभाल के विच्छेदन के दौरान laminectomy प्रदर्शन करते हुए रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। यह रीढ़ की हड्डी खंडों बरकरार हैं जब periventricular ऊतक को अलग करने के लिए आसान है। ऊतक वर्गों का पूरी तरह से विच्छेदन बफर में डूब जाना चाहिए और overlying तानिका और सफेद पदार्थ microscissors के साथ अनुदैर्ध्य स्ट्रिप्स के रूप में दूर काटा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ठीक ऊतक संदंश दूर सफेद बात छील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

NSPCs के लिए अलगाव की प्रक्रिया के लिए, हम चूहे और मानव रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को अलग कर देना यांत्रिक विचूर्णन के साथ संयुक्त papain-EDTA के पृथक्करण विधि का इस्तेमाल किया। पहले से प्रसव के बाद चूहे cortical न्यूरॉन्स 11 की हदबंदी के साथ दिखाया गया के रूप में अन्य प्रोटिएजों की तुलना में, papain, कम हानिकारक लेकिन प्रभावी है। हम अक्सर भ्रूण ऊतक के साथ इस्तेमाल केवल यांत्रिक विचूर्णन साथ कि हदबंदी, वयस्क से ऊतक के साथ के रूप में प्रभावी नहीं है पाया। वीं के बादई enzymatic पृथक्करण, यांत्रिक विचूर्णन शेष ऊतक टुकड़े को तोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है। एक बादल सेल निलंबन में जिसके परिणामस्वरूप कोई शेष बरकरार ऊतक टुकड़े कर रहे हैं तो एक विंदुक के साथ दोहराए सेल फैलाव के साथ Trituration प्रदर्शन किया जाना चाहिए। हालांकि, विचूर्णन सेल निलंबन और उसके एवज में कोशिका मृत्यु का बुदबुदाती से बचने के लिए भी जोरदार प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए।

मूल रूप से 2 वर्णित किया गया था के रूप में passaging के लिए, चूहे neurospheres, यांत्रिक विचूर्णन के माध्यम से एक एकल कक्ष निलंबन में अलग कर रहे हैं। हालांकि, neurospheres भी ऐसी कोशिका की सतह रिसेप्टर्स को क्षति या लंबे समय के रूप एंजाइमी जोखिम 12 संक्षिप्त रूप में क्षेत्र के गठन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा जो ट्रिप्सिन-EDTA के रूप में एंजाइमी तरीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है।

संस्कृति NSPCs को neurosphere परख का उपयोग करने में लाभ के एक नंबर रहे हैं। यह अपेक्षाकृत सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और तंत्रिका स्टेम सेल का तेजी से विस्तार के लिए अनुमति देता हैरास 2,12। हालांकि, neurospheres के लिए मुख्य रूप से अधिक प्रतिबंधित है और स्टेम सेल का केवल एक छोटी संख्या है कि पूर्वज कोशिकाओं के शामिल heterogenous हैं। इस तरह के सेल घनत्व और passaging की तकनीक के रूप में कई कारकों संस्कृतियों के phenotype को प्रभावित कर सकता है, और neurospheres भी पूर्वज कोशिकाओं 13 से बना सकते हैं। Neurospheres अत्यधिक गतिशील होते हैं और यहां तक कि कम सेल घनत्व 14 की शर्तों के तहत फ्यूज हो सकता है। इस प्रकार, संस्कृति में neurospheres की संख्या स्टेम कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। मूल कोशिकाओं से तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव करने के लिए, एक सेल परख 15,16 के गठन तंत्रिका-कॉलोनी का उपयोग करना चाहिए।

वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी NSPCs EFH में निलंबन संस्कृति में neurospheres के मध्यम पूरक के रूप में अच्छी तरह से विकसित और आसानी से विस्तार योग्य हैं। इसके विपरीत, हम वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs एक पक्षपाती monolayer के रूप में 10 बेहतर हो जाना पाया है। मानव मस्तिष्क व्युत्पन्न तंत्रिका स्टेम सेल monolayer के पंथ में लंबे समय तक बनाए रखा जा सकताउनके proliferative क्षमता 17,18 को बढ़ावा देने के जो mitogens की उपस्थिति में एक रासायनिक परिभाषित माध्यम में ure। इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, NSPCs अंग प्रत्यारोपण दाताओं से वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी से अलग और passaged और एक पक्षपाती EGF, bFGF की उपस्थिति में monolayer, और हेपरिन 10 के रूप में विस्तारित किया जा सकता है। कोशिकाओं में तेजी से विस्तार के रूप में NSPCs अभी भी 60 साल के 10 की हमारी अधिकतम उम्र तक दाताओं से अलग किया जा सकता है, हालांकि यह पुराने दाताओं की तुलना में छोटी से NSPCs अलग करने के लिए आसान है। हम इस तरह के Matrigel, फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन प्रकार मैं, और पाली-डी lysine / laminin के रूप में पक्षपाती substrates के एक किस्म की जांच की, और वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी के पालन NSPCs 10 के लिए प्रभावी होने के लिए इन मिल गया है। प्रारंभ में neurosphere और पक्षपाती संस्कृतियों दोनों सेलुलर समुच्चय, मलबे, और मृत कोशिकाओं होते हैं। हालांकि इस मलबे उत्तरोत्तर subculturing और proliferating NSPCs के लिए कारक समृद्ध Neurobasal मध्यम चयन करता वृद्धि के साथ हटा दिया जाता है। इसके अलावा मलबे और माइलिन संदूषण सावधान विच्छेदन और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों क्षेत्रों से सफेद पदार्थ को हटाने के साथ कम किया जा सकता है। यह भी माइलिन को हटा पूर्व चढ़ाना के लिए एक झरनी के माध्यम से परिणामी सेल निलंबन छनन।

पुराने संस्कृतियों में वहाँ karyotypic असामान्यताओं के लिए जोखिम बढ़ जाती है, हालांकि हम लगभग 10 अंश से जुड़े कम से कम 9 महीनों के लिए पक्षपाती monolayers के रूप में सुसंस्कृत वयस्क मानव रीढ़ की हड्डी NSPCs है। हम 4 महीने के लिए सुसंस्कृत मानव NSPCs पर कुपोषण विश्लेषण किया है और कोई गुणसूत्र असामान्यताओं के साथ एक सामान्य द्विगुणित कुपोषण पाया (डेटा) नहीं दिखाया। हम यह भी सेल प्रसार और oligodendrocytes में अंतर करने की क्षमता संस्कृति में वृद्धि की समय के साथ कम किया है कि पाया। उदाहरण के लिए, O4 सकारात्मक कोशिकाओं के रिश्तेदार प्रतिशत संस्कृति 10 में 4 महीने में 0.01% की संस्कृति में 1 महीने में 1.3% से कम किया है। चूहा और मानव NSPCs दोनों मानक ठंड से मुलाकात का उपयोग कर cryopreservation के लिए उत्तरदायी हैंhods और प्ररूपी प्रोफ़ाइल में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखा।

संस्कृति में multipotent NSPCs के अलगाव और विस्तार वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव पर विभिन्न कारकों की परीक्षा सहित कई इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है। NSPCs की बढ़ी संख्या के लिए इन विट्रो में उत्पन्न होता है और इस तरह की रीढ़ की हड्डी में चोट, स्ट्रोक, और vivo में इन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विरोहक प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए neurodegenerative रोग के रूप में पशु मॉडल में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1x HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200 mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10,000 U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10 mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 99 तंत्रिका विज्ञान कोशिका जीव विज्ञान तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी सेल संस्कृति चूहे मानव
Periventricular वयस्क चूहे के क्षेत्र और मानव रीढ़ की हड्डी से तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अलगाव
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Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of … More

Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

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