Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52732
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

Abstract

Взрослой крысы и человека спинного мозга нервные клетки стволовые / предшественники (NSPCs), культивируемые в фактор роста обогащенного среды позволяет распространением мультипотентных, самообновлению, и расширяемые нервные стволовые клетки. В сыворотке крови условий, эти мультипотентные NSPCs будет отличать, генерировать нейроны, астроциты, олигодендроциты и. Собирают ткань ферментативно диссоциируют в растворе папаина-ЭДТА, а затем механически диссоциируют и отделены через градиент плотности прерывистой с образованием суспензии отдельных клеток, которые высевают в Neurobasal среде с добавлением фактора роста эпидермиса (EGF), основной фактор роста фибробластов (оФРФ ), и гепарин. Взрослых крыс спинного мозга NSPCs культивируют в свободном обращении нейросфер и взрослых спинного мозга человека NSPCs выращивают прикрепленных культур. В этих условиях, взрослые спинного мозга NSPCs пролиферируют, экспресс-маркеры клеток-предшественников, и может быть постоянно расширяется при прохождении. Эти клетки можно бе учился в пробирке в ответ на различные стимулы, и экзогенные факторы могут быть использованы для содействия ограничение клонов изучить нейронную дифференциацию стволовых клеток. МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ NSPCs или их потомство также могут быть пересажены в различных животных моделях для оценки восстановительный ремонт.

Introduction

NSPCs мультипотентны клетки, совершенные в нервной линии, что может самостоятельно возобновить и расширить легко в пробирке. Мы называем эти клетки в виде смешанного населения нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, поскольку они отображают свойства самообновляющихся мультипотентными стволовых клеток и клеток-предшественников более ограниченных. NSPCs найдены как в плода и взрослого головного и спинного мозга 1,2. У взрослого, как правило, NSPCs покоя и находиться в пределах конкретных ниш в том числе субвентрикулярной зоны накладки боковых желудочков 2-4 и перивентрикулярном области, окружающей центральный канал спинного мозга 5,6.

Как правило, NSPCs культивируют в свободно плавающих нейросферах или в адгезивных монослоев в бессывороточной среде с добавлением EGF и оФРФ, митогены, которые отбирают для клеточных популяций стволовых / клеток-предшественников. Нейросфера анализ первоначально разработан Рейнольдса и Вайса 2, наиболее часто используется для культуры ирасширить нервные стволовые клетки. NSPCs показать мультипотентность, когда они высевают в фактор-Free роста среде, содержащей сыворотку, дифференцируя в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Мультипотентных, самообновлению NSPCs могут быть выделены и культивированы с взрослого грызуна спинного мозга при культивировании тканей включает области центрального канала 6,7. Потенциальное преимущество в использовании NSPCs, полученные от взрослого спинного мозга, в отличие от генерации клеток из других областей, что эти ткане-специфические клетки наиболее близко клеток в спинном мозге, которые утрачены или повреждены после травмы или болезни.

Предыдущая работа показала, что нейросферы полученные от взрослого человека спинного мозга не может распространяться долгосрочные или пассировать генерировать достаточное количество клеток 8,9. Тем не менее, с изменениями в условиях культивирования, мы сообщили о расширении и трансплантации взрослых спинного мозга NSPCs полученных человека, демонстрируя, что самообновлениюи мультипотентные NSPCs может быть изолирован от взрослого человека спинного мозга трансплантации органов доноров 10. В первую очередь, удаление большей части белого вещества при вскрытии и культивирование этих клеток на клейкого субстрата фактора роста в обогащенной среде выбраны для пролиферирующих взрослых спинного мозга NSPCs человека. В этом протоколе мы опишем сбор спинного мозга от взрослых крыс и человека от трансплантации органов доноров, рассечения перивентрикулярном ткани и выделения, культуры и расширение NSPCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных утверждаются Care комитета животных Сети здравоохранения университета, Торонто Канады, в соответствии с политикой, установленной в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленных Канадского совета по уходу за животными. Для уборки ткани спинного мозга человека, утверждение было получено от Совета Сетевого университета медицинских исследований по этике и от Trillium-подарок Фонда жизни, который курирует донорства в Онтарио, Канада.

1. Подготовка вскрытия буферов и медиакультуры

  1. Для выделения из спинного мозга крысы, подготовить 100 мл рассечение буфера (1X PBS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) и в холодильник. Для спинного мозга человека подготовить 100 мл рассечение буфера (1x HBSS + 0,6% глюкоза + 2% пенициллина стрептомицин) и поставить в холодильник.
  2. Приготовьте 100 мл бессывороточной среды (SFM) и в тепле при 37 ° С. Для подготовки SFM, добавить 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл пенициллина-стрептомицина, 2% B27, и 10% смесь гормон Neurobasal-средой. Чтобы приготовить смесь гормона, сделать 1: / F12 среду DMEM, содержащую 1% глюкозы 0,6, 3 мМ NaHCO 3, 5 мМ HEPES, 25 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл апо-трансферрина, 10 мкМ путресцина, 30 нМ селена, и 20 нМ прогестерона.
  3. Подготовьте роста ОМР фактор обогащенного осажденный носитель (с УЛП добавить 20 нг / мл EGF, 20 нг / мл оФРФ и 2 мкг / мл гепарина) и теплую при 37 ° С. Убедитесь, что человек ОМР содержит человеческий рекомбинантный фактор роста (см Таблицу материалов).

2. Сбор и Препарирование взрослых крыс Перивентрикулярные ткани спинного мозга

  1. Стерилизовать рассекает инструменты в этаноле и промыть в стерильном физиологическом растворе или в автоклаве инструментов заранее. Дайте крысу (6 - 8 недель) смертельная инъекция из фенобарбитала натрия (1 см на 65 мг / мл) или передозировки анестетика (например, 4% изофлуораном) в соответствии со своей института одобрил протокол животных. DУз спину крысы с 70% этанола и снимите кожу на поверхности спинного с большими ножницами рассечение.
  2. Проведение ножницы перпендикулярно к поверхности спинного поперек разрезать позвоночник выше задних конечностей. Используйте ножницы, чтобы меньше в продольном направлении сократить спинной мышцы вышележащих позвоночный столб в ростральной направлении, чтобы разоблачить остистые отростки.
  3. Начиная с открытой хвостового конца, вставьте кусачек или небольшой тупой кости режущего инструмента экстрадурально в латеральной части позвоночного канала в пространстве между спинного мозга и позвоночника. Сделайте небольшие порезы в пластинки (костные арки слева и справа от остистых отростков по бокам позвонков) и тщательно удаляйте пластинку, чтобы разоблачить спинного мозга (1А-D). Обеспечить угол лопастей мелкое и параллельно шнура так, основной спинной мозг не был поврежден.
  4. Продолжить ламинэктомию в ростральной направлении выставкахе грудной и шейного отдела спинного мозга.
  5. Аккуратно вырезать спинной мозг от позвоночного столба с тупыми щипцами ткани и использования microscissors тщательно разорвать корни, чтобы освободить кабель. Поместите вырезали спинного мозга в чашку Петри, содержащую 4 ° С стерильной крыс буфер рассечение (описанный выше в 1.1). Промойте ткань в свежеприготовленный 4 ° С рассекает буфера и с помощью ножниц вырезать спинной мозг в поперечном направлении в 1 см сегментов (рис 1E).
  6. Для каждого сегмента ткани, одной рукой держать ткань с тонким пинцетом. С другой стороны, использовать microscissors тщательно удалить вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества с помощью рассекает области. Кроме того, использование тонких щипцов Дюмон (4 #), чтобы очистить от самых серого и белого вещества, оставляя только перивентрикулярные область спинного мозга, который включает эпендимы и небольшое количество окружающих серое вещество (рис 1F-H).
  7. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный крысиный буфер рассечение.

3. Заготовка и Препарирование взрослых человека Перивентрикулярные ткани спинного мозга

Примечание: Human ткани спинного мозга собирают из взрослых трансплантации органов доноров (доноры были в возрасте от 2 до 60 лет), после другие органы были удалены для трансплантации органов. Триллиум-Дар программе Life получает согласие на изъятие тканей для исследовательских целей от семьи пациента и уведомляет нашу команду уборки своевременно, так что мы смогли собрать шнуры в течение 2 часов в пережатия аорты. Мужские и женские взрослые доноры с отрицательным серологических и никаких инфекций не принимаются.

  1. Урожай ткани в стерильной моды в операционной комнате через передний подхода, используя тот же передний экспозицию уже вскрывали для извлечения органов по органной транспLant команда сбор.
  2. Expose передней позвоночник через втягивание с большими ребрами удобрений и крупных гребных преднатяжителями остальных тканей и органов, включая крупных кровеносных сосудов.
  3. Используйте пилу грудины, установленный с длинным лезвием, чтобы прорваться через межпозвоночных дисков в ростральных и каудального концов нужной длины позвоночного столба, чтобы быть резекция. Угол пила около 45 ° медиально сократить корыто треугольную из боковой части тел позвонков остановки чуть меньше позвоночного канала.
  4. Удалить целиком медиальной стороны тел позвонков желаемых сегментов с помощью изогнутых остеотомов и молотком стараясь избежать сокращения через твердую мозговую оболочку. Затем осторожно поднимите твердой мозговой спинной мозг покрыты с зубчатыми щипцами и резко надрезать ростральные и хвостовой концы шнура. Используйте длинные ножницы и пинцет, чтобы на двусторонней основе секут отдельные корни.
  5. Поместите вырезали сегмент спинного мозга в 4 °С стерильной буфера (1x HBSS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) в большой пробирке для транспортировки к комнатной культуре ткани.

  6. Примечание: Как правило, 3 - 6 см сегмент спинного мозга из верхнего грудного и / или средне-низком уровне грудной удаляется в операционной в стерильных условиях, как можно скорее после прекращения циркуляции и помещают в холодный стерильный буфер , Время, прошедшее между прекращением циркуляции и удаления спинного мозга зависит от времени, необходимого для сбора целевых органы для донорства и колебалась от 45 мин до 2 часов. Если сердце и легкие были также удалены, рассечение могут быть приняты далеко рострально собрать часть нижней шейки мозга, а также.
  7. Проанализируйте спинного мозга ткани человеческого как можно скорее после сбора урожая, как правило, в течение 3 часов. Удалить твердую мозговую оболочку и другие мозговые оболочки щипцами. Промойте ткань спинного мозга в свежеприготовленный 4 ° С рассечение буфера исократить в поперечном направлении в 1 см сегментов.
  8. С помощью рассекает сферу, вырезать вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества, используя ткани щипцы, тонкий пинцет и microscissors для каждого участка ткани. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани, которая включает в себя эпендимы и небольшое количество серого вещества, окружающего, в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный человека буфер рассечение.

4. Выделение и Культивирование взрослых крыс и человека позвоночника NSPCs шнура

  1. Выполните следующие шаги в асептических условиях в ламинарном боксе.
    1. Фарш расчлененный крысу или человека перивентрикулярная ткани в 1 мм 3 штук с microscissors.
    2. Ферментативно отделить измельченной ткани с использованием протеолитических ферментов папаин комплект диссоциации, как указано в таблице материалов / реагентов. Примечание: Реагент компоненты включают в себя 4 флаконов; Флакон 1: Эрла сбалансированный солевой раствор (EBSS), флакон 2: папаин containinг L-цистеина и ЭДТА, колба 3: Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы), флакон 4: Овомукоид ингибитор протеазы с бычьим сывороточным альбумином (БСА).
      Примечание: Примечание: Папаин сульфгидрильная протеазы, который имеет широкий специфичность для белковых субстратов. Папаин в данном документе является производным от латекса из папайи Carica завода и ухудшает большинство белковых субстратов более широко, чем панкреатические протеазы. В процессе диссоциации есть повреждения клеток в результате чего ДНК, будет выпущен в среде диссоциации что приведет к увеличению вязкости и сделать пипетки трудно. Таким образом, ДНКазы входит в процедуре выделения клеток усваивать ДНК без повреждения интактных клеток. Ovomucoids которые гликопротеина ингибиторы протеазы, используемые для ингибирования активности папаина после стадии диссоциации.
  2. При первом использовании, воссоздать ингибитор альбумина овомукоид смесь (пробирка 4) с 32 мл EBSS (пробирка 1), а затем хранят при температуре 4 ° С и используют в последующих выделений.Примечание: Это дает решение в эффективной концентрации 10 мг овомукоид ингибитора и 10 мг альбумина на миллилитр.
  3. Добавляют 5 мл EBSS (пробирка 1) к папаина флакона (флакона 2), с получением раствора на 20 единиц папаина / мл в 1 мМ L-цистеина с 0,5 мМ ЭДТА. Убедитесь, что папаин решение появляется ясно, когда полностью не растворится, иначе поместите флакон в водяную баню при 37 ° в течение десяти минут, пока, папаин полностью не растворится, чтобы обеспечить полную активность фермента.
  4. Добавить 500 мкл EBSS (пробирка 1) к ДНКазы флакон (флакон 3) и осторожно перемешать в ДНКазы чувствителен к сдвигу денатурации. Добавить 250 мкл раствора ДНКазы в пробирку, содержащую папаин, полученный в конечной концентрации приблизительно 20 единиц / мл папаин и 0,005% ДНКазы. Сохранить баланс ДНКазы флакон, чтобы использовать позже.
  5. Поместите фарш крысу или тканей человека в папаин решения, подготовленный в шаге 4.4 выше. Для выделения тканей человека, разделить фарш ткани поровну между двумяпапаин флаконы (примерно 0,2 г / флакон).
  6. Инкубируют при 37 ° С при постоянном перемешивании на качалке платформы для диссоциации ткани в раствор активированного папаина. Инкубируйте ткани крыс в течение 45 мин до 1 ч, и человеческой ткани в течение 1 2 часов в зависимости от количества измельченной ткани, около 0,2 - 0,4 г соответственно.
  7. Растирают в смеси с 10 мл пипетки, чтобы отделить все оставшиеся кусочки ткани с образованием мутной суспензии клеток. Передача клеточной суспензии (не включают каких-либо кусков ткани недиссоциированной) в стерильный 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Ресуспендируют гранулированных клеток в среде, содержащей Овомукоид, ингибитор папаин.
    1. Подготовка овомукоид решение путем смешивания 2,7 мл EBSS (флакон 1) 300 мкл восстановленного альбумин-овомукоид раствора ингибитора (пробирка 4) в 15 мл коническую пробирку. Добавить 150 мкл раствора (флакон 3) ДНКазы, сохраненные на шаге 4.4 выше.
    2. Удалите супернатант изосажденные клетки и сразу ресуспендируют осадок клеток в разбавленных ДНКазы альбумина ингибитор смеси.
  9. Отдельные неповрежденные клетки клеточных мембран центрифугированием через один шаг прерывистого градиента плотности.
    1. Подготовка градиент разрывной плотностью добавлением 5 мл альбумина раствора ингибитора (флакон 4) в 15 мл пробирку, и с помощью 5 мл пипетки, осторожно и медленно слой клеточной суспензии (полученного, как описано выше в шаге 4.8) на вершине альбумин раствора ингибитора.
    2. Центрифуга при 70 мкг в течение 6 мин при комнатной температуре.
    3. Примечание: Интерфейс между двумя слоями градиента должны быть четко видны, хотя минимальное перемешивание на этой границе не влияет на результат. Мембранные фрагменты остаются на границе раздела и диссоциированные клетки осаждения на дно пробирки.
  10. Для крыс клетки, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды крыс EFH (предварительно нагретого до 37 ° С).Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральной колбы Т25 при плотности 10 клеток / мкл в EFH. Типичный выход клеток из ткани крысы составляет около 2 × 10 6 клеток с 80% viability.If клональных культур желательно, семенных клеток при плотности менее 10 клеток / мкл. Инкубируйте колбы при 37 ° С в 5% СО 2 и позволить расти культуры в покое на 1 неделю, чтобы избежать агрегации сфер.
  11. Для клеток человека, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды человеческого EFH (предварительно нагретого до 37 ° С). Фильтр клеточной суспензии через сито нейлона клеток 40 мкм с последующим 30 мл EFH удалить миелина и клеточные мембранные фрагменты. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл EFH среды.
  12. Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клетки человека в культуральных планшетах 6-луночные при плотности 10 5 клеток / лунку в общем объеме5 мл ОМР / хорошо. Типичный выход клеток из тканей человека составляет около 1 × 10 6 клеток с 70% жизнеспособностью. Предварительно пальто скважины со приверженцем подложки, такие как Matrigel (см примечание ниже). Развести в соотношении 40 мкл Matrigel: 1 мл SFM.
  13. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать другие адгезивные субстраты, такие как поли-D-лизином / ламинин, фибронектин, или коллагена.
  14. Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% СО 2 и позволить расти культуры в покое на 1 неделю.

5. пассажи из взрослых крыс и спинного мозга человека NSPCs

  1. Крыса NSPCs образуют небольшие нейросферы примерно 70 мкм в диаметре в течение 1 недели первоначального посева; Переход крыс NSPCs еженедельно путем сбора клеточной суспензии, центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, и механически растиранием осадок клеток для диссоциации нейросферы.
  2. Семенной диссоциированных клеток в Т25 колбы, содержащие свежие крыс EFh среду. В качестве альтернативы,использовать 50% кондиционного крыс среду для пересева. Типичный выход из крысиных NSPCs на пассажей около 5 х 10 6 клеток, которые экспоненциально возрастает с числом пассажей.
  3. Для человеческих культур, через неделю после первоначального посева, заменить половину культуральной среде со свежей EFH два раза в неделю, чтобы позволить клеткам прилипать к подложке. Как правило, 1 - 2 недели после того, как клетки прикреплены к субстрату, замените весь объем культуральной среды два раза в неделю со свежей EFH.
  4. Субкультура клетки до достижения слияния между 4 - 8 недель.
    1. Субкультура клеток путем отсоединения клеток от субстрата ферментативной (табл материалов) с 2 мл фермента на лунку инкубировали в течение приблизительно 10 мин при 37 ° С. Собирают суспензию клеток, центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин, и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежеприготовленного EFH среды.
    2. Количество живых клеток с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральных планшетах 6-луночные (предварительно совместноованные, как указано выше в пункте 4.12) при плотности 10 5 клеток / лунку в общем объеме 5 мл EFH / а. Типичный выход человека в NSPCs пассажей около 2 х 10 6 клеток и, как правило это удвоит с прохода. Как правило, поддерживать культуру с 50% условного EFH среды 2 - 3 раза в неделю между пассажами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Взрослый клетки крысы спинного мозга, выращенные в суспензионной культуре в среде EFH образуют небольшие нейросферы (колонии недифференцированных клеток) в течение 1 недели первоначального посева. В первичных культурах, большинство клеток высевали умрет и фактор роста реагирующих стволовые клетки пролиферируют и выбираются для в среде EFH. По прохождении 3, будет множество свободно плавающего нейросферы около 100 мкм в диаметре (фиг.2А). Нейросферах круглые и фазы ярким, и при большом увеличении, реснички, как микрошипов видны выступающие из клеток на внешней сферы, которые характерны нейросферах комков в отличие от клеточного дебриса (фиг.2В). Типичный выход клеток из ткани крысы составляет около 2 х 10 6 клеток с 80% жизнеспособностью. В нейросферы не следует высевают при слишком высокой плотности, чтобы избежать агрегации кластеров клеток. Кроме того, крупные нейросферы стало трудно отделить и клетки станутнекротической в ​​центре сферы. Это также происходит, если культуры оставили слишком долго, прежде чем пассажей. В EFH культуры, взрослой крысы NSPCs спинного мозга пролиферируют (фиг.2С) и выражают Nestin (рис 2D) маркер для клеток-предшественников, а также низкий уровень зрелых нейрональных маркеров (данные не показаны).

Взрослый спинного мозга человек NSPC культуры не растут так быстро, как крысы NSPC культур. Если клеток спинного мозга человека изначально культивировали в суспензии, они образуют агрегаты и нерегулярные кластеры малых чисел ячеек в сочетании с мусором (рис 3а). После пассажи из этих культур не способствует обогащению населения NSPC. Однако, когда клетки человека высевали в EFH на адгезивного монослоя, коэффициент ответный NSPCs роста придерживаться подложки (фиг.3В) и последующей заменой медиа удаляет миелина и клеточного дебриса (фиг.3С). Типичный выход Слоктей с человеческой ткани составляет около 1 × 10 6 клеток с 70% жизнеспособностью. Когда человеческие культуры NSPC становятся хорошо известна в качестве клейкого монослоя NSPCs может также быть покрыты в суспензионных культурах, чтобы сформировать свободно плавающие нейросферы. В EFH культуры, взрослые NSPCs спинного мозга человека размножаться (рис 3D) и выразить нестин (рис 3E) и Sox2 (рис 3F), фактор транскрипции показано, выражается нейронных стволовых клеток, и очень низким уровнем зрелых нервных маркеров (данные не показано).

Фигура 1
Рисунок 1. Ламинэктомия из спинного мозга крысы и рассечения перивентрикулярного области. () В открытой хвостового конца спинного мозга, кусачек вставляются экстрадурально в латеральной части позвоночного канала. (B) Малые разрезы делаются в пластинки на каждой сиде позвонков и пластинки тщательно очищенных от подвергать спинной мозг. (С) воздействию шейного отдела спинного мозга после ламинэктомии. (D) Схема шейных позвонков поперечном сечении, показывающий спинной мозг и расположение разрезов, сделанных для ламинэктомией (изображен с красными пунктирными линиями). Пластинки и остистый отросток (заштрихованная область) удаляются. (Е) спинного мозга разрезают в поперечном направлении в 1 см сегментов. (F) Вышележащие оболочек, белое вещество, и большинство из серого вещества осторожно удаляют с помощью microscissors. (G ) Фарш перивентрикулярная ткани. (Н) Поперечный срез спинного мозга крысы, окрашенных Luxol быстрого синего и hemotoxylin и эозином с пунктирным контуром, показывающий расчлененный перивентрикулярная регион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Фигура 2. взрослых крыс NSPCs спинного мозга. (А) канал 3, многочисленные нейросферы видно, когда крыс спинного мозга NSPCs выращивают в свободно плавающего суспензионной культуре. (Б) нейросферы фазы яркие и микрошипов выступающих из нейросферах (стрелки ) являются очевидными при большом увеличении. (С) диссоциированных нейросферы (прохождение 3, 4 день) высевают на покрытые матригелем скважин в EFH среды, основные и иммунологически и контрастно Hoechst визуализировать ядра (синие). В условиях EFh взрослых крыс NSPCs спинного мозга размножаться (как показано Ki67 иммунным) и (D), в первую очередь экспресс нестин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> Рисунок 3
Рисунок 3. Взрослые спинного мозга человека NSPCs. (A) При первом покрытием в колбах культуры, взрослые спинного мозга NSPCs человека не растут хорошо. Первичные свободно плавающего культур в среде EFH (через 13 дней после посева) показывают агрегатов клеток и мусора. (Б) в отличие от этого, в первичных культурах адгезивных в EFH, NSPCs быть прикреплен к подложке Матригель (стрелки), как показано в 17 дней после обшивки, и (С) на 41 дней в пробирке. (D) В EFH среды, взрослые спинного мозга человека NSPCs пролиферируют, как показано с использованием иммунной Ki67 (26 дней в пробирке показано), и в первую очередь экспресс (Е) нестин (26 дней в Vitro показан) и (F) Sox2 (66 дней в пробирке показано). Ядра контрастно Hoechst (синий)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Во время вскрытия крыс спинного мозга помощи ткани должны быть приняты, чтобы не повредить спинной мозг при выполнении ламинэктомию. Это легче изолировать перивентрикулярные ткани, когда сегментов спинного мозга не повреждены. Сегменты ткани должны быть полностью погружены в рассечение буфера и вышележащие мозговые оболочки и белое вещество может быть срезана, как продольных полос с microscissors. В качестве альтернативы, тонким пинцетом ткани могут быть использованы, чтобы очистить от белого вещества.

Для процедуры изоляции для NSPCs, мы использовали папаин-ЭДТА метод диссоциации в сочетании с механической растирания отделить крысу и ткани спинного мозга человека. По сравнению с другими протеазами, папаин является менее вредным, но эффективный, так как ранее было показано с диссоциации послеродовой крыс корковых нейронов 11. Мы обнаружили, что диссоциации только с механическим растиранием, часто используется с эмбриональной ткани, не столь эффективен с тканью от взрослого. После йе ферментативная диссоциация, механическое растирание важно, чтобы разбить оставшиеся фрагменты тканей. Растирание с повторяющимися дисперсии клеток с помощью пипетки должны быть выполнены, так что не осталось фрагментов интактных тканей в результате пасмурный клеточной суспензии. Однако, растирание, не должна быть выполнена слишком сильно, чтобы избежать образования пузырьков в клеточной суспензии и, как следствие гибели клеток.

Для пассирования, крысы нейросферы диссоциируют в суспензии отдельных клеток через механический растирание, как первоначально было описано 2. Тем не менее, нейросферы также могут быть отделены с помощью ферментативных методов, таких как трипсин-ЭДТА, который не повредит поверхности клеток рецепторы или препятствуют формированию сферы, как долго, как ферментативная экспозиции является кратким 12.

Есть ряд преимуществ в использовании нейросфера анализа для культуры NSPCs. Это относительно простой, воспроизводимой, и позволяет для быстрого расширения нейронных стволовых челLs 2,12. Тем не менее, нейросферы гетерогенным состоит в основном из клеток-предшественников, которые более ограничены, и только небольшое количество стволовых клеток. Несколько факторов, таких как плотность клеток и техники пассирования может повлиять на фенотип культур и нейросферы могут также образовывать из клеток-предшественников 13. Нейросферы очень подвижные и могут сливаться даже в условиях низкой плотности клеток 14. Таким образом, количество нейросферах в культуре не представляет собой количество стволовых клеток. Для разделения нервные стволовые клетки из клеток-предшественников, следует использовать нейронную-колониеобразующих клеток анализа 15,16.

Взрослых крыс спинного мозга NSPCs расти также нейросферы в суспензионной культуре в EFH дополнить среду и легко расширяемой. В отличие от этого, мы обнаружили, что взрослые спинного мозга человека NSPCs лучше растут в качестве адгезивного монослоя 10. Человеческий мозг, полученных нервные стволовые клетки могут быть устойчивыми в долгосрочной перспективе в монослоя культаЮр в химически определенной среде в присутствии митогены, которые способствуют их пролиферативную способность 17,18. Как описано в данном протоколе, NSPCs могут быть выделены из взрослого человека спинного мозга от доноров трансплантации органов и пассируют и расширена в качестве адгезивного монослоя в присутствии EGF, оФРФ и гепарин 10. Это легче изолировать от NSPCs моложе старых доноров, клетки расти быстрее, хотя все еще ​​может NSPCs быть изолированы от доноров до нашей максимальной возрасте 60 лет 10. Мы изучили различные адгезивных субстратов, таких как Матригель, фибронектин, коллаген типа I и поли-D-лизина / ламинин, и обнаружили, это, чтобы быть эффективным для присоединения взрослого спинного мозга человека NSPCs 10. Первоначально оба нейросфера и прилипшие культуры содержат клеточные агрегаты, мусор и мертвые клетки. Однако это мусор постепенно удаляется с субкультивирования и фактор роста обогащенный Neurobasal среднего выбирает для пролиферирующих NSPCs, Кроме загрязнений и отходов миелина может быть уменьшено при тщательном рассечения и удаления белого вещества из сегментов спинного мозга ткани. Фильтрование полученной суспензии клеток через сито до обшивки также удаляет миелин.

У нас есть культурные взрослых позвоночника NSPCs человека шнур как прилипшие монослоев, по крайней мере 9 месяцев с участием около 10 проходов, хотя в старых культурах увеличивается риск хромосомных аномалий. Мы провели анализ на кариотип человека NSPCs культивировали в течение 4 месяцев и нашли нормальных диплоидных кариотип без каких-либо хромосомных аномалий (данные не показаны). Мы также обнаружили, что пролиферацию клеток и способность дифференцироваться в олигодендроциты уменьшается с увеличением времени в культуре. Например, относительная доля O4-положительных клеток уменьшилась с 1,3% на 1 месяц в культуре до 0,01% в 4 месяца в культуре 10. И крысы и человека NSPCs поддаются криоконсервации с использованием стандартных замораживания встретилсяHODS и не показывают никаких существенных различий в фенотипической профиль.

Изоляция и расширение мультипотентными NSPCs в культуре позволяет приложений несколько в пробирке в том числе экспертизы различных факторов на взрослого нервной дифференцировки стволовых клеток. Увеличение числа NSPCs могут быть получены в лабораторных условиях и пересаживают в моделях на животных, такие как травмы спинного мозга, инсульт и нейродегенеративных заболеваний, чтобы изучить репаративной реакцию этих нервных стволовых клеток в живом организме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1x HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200 mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10,000 U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10 mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).

Tags

Биология развития выпуск 99 неврологии клеточной биологии нейронные стволовые клетки спинного мозга культура клеток крыса человек
Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of … More

Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter