Abstract
Nei vertebrati, emopoiesi è regolata da microambienti induttivi (nicchie). Allo stesso modo, nel modello invertebrato organismo Drosophila melanogaster, microambienti induttivi noto come tasche ematopoietiche larvali (HPS) sono stati individuati come siti anatomici per lo sviluppo e la regolazione del sangue cellule (ematociti concentrati), in particolare di auto-rinnovamento lignaggio macrofagi. HPs sono segmentally ripetuto tasche tra l'epidermide e strati muscolari della larva, che comprendono anche i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Nel larva, residenti (sessili) emociti sono esposti a anti-apoptotica, adesivo e segnali proliferativi di questi neuroni sensoriali e potenzialmente altri componenti HPS, come il muscolo rivestimento e strati epiteliali. Durante il normale sviluppo, rilascio graduale di ematociti concentrati residenti dalle HPS alimenta la popolazione di ematociti concentrati circolanti, che culmina nel rilascio di most dei ematociti concentrati residente all'inizio della metamorfosi. Assalti immunitario, lesioni fisiche o disturbo meccanico innescano il rilascio prematuro di ematociti concentrati residenti in circolazione. L'interruttore di ematociti concentrati larvali tra i luoghi residenti e circolazione pone la necessità di uno standard / procedura comune per isolare in modo selettivo e quantificare queste due popolazioni di cellule del sangue da sola larve Drosophila. Di conseguenza, questo protocollo descrive un metodo automatizzato per rilasciare e quantificare il residente e emociti circolanti da singolo larve. Il metodo facilita approcci ex vivo, e può essere adattato a servire una varietà di fasi di sviluppo della Drosophila e altri organismi invertebrati.
Introduction
La ricerca nel modello invertebrato Drosophila melanogaster ha portato alla scoperta di immunità innata 1, e ha facilitato la comprensione di vari aspetti dello sviluppo delle cellule del sangue 2-4. Drosophila emopoiesi può essere diviso in lignaggio di ematociti concentrati embrionali / larvali, originario degli embrione ed espandere nella larva, e il lignaggio di ghiandole linfatiche ematociti concentrati 4,5. Qui, vi presentiamo un protocollo che si concentra sulla stirpe di ematociti concentrati embrionali / larvale, che nella larva di Drosophila comprende principalmente plasmatocytes (macrofagi) e le poche cellule di cristallo 4. Nel larva, ematociti concentrati dell'embrione persistono e colonizzano Tasche segmentally ripetute e terminali ematopoietiche (HPS) che si trova tra l'epidermide e strati muscolari della parete corpo larvale 5,6. Sulla base della loro natura di auto-rinnovamento macrofagi 6, la loro residenza predominante nella microambienti tissutali locali 6, 7, e la loro discendenza dalle prime cellule del sangue che emergono durante lo sviluppo 6,8, questa popolazione di cellule del sangue è considerato simile a vertebrati macrofagi tissutali di auto-rinnovamento, una linea mieloide indipendente, recentemente identificato in una varietà di specie 4,9,10. Tuttavia, in Drosophila, alcune o tutte queste cellule residenti mostrano anche plasticità dare luogo ad altri tipi di cellule del sangue come celle a cristalli 11,12.
Hemocytes larvali sono residenti prevalentemente (sessili), ma sono in uno stato stazionario dinamico tra i vari HPS. Essi vengono progressivamente rilasciati in circolazione, in particolare come il 3 ° larva si avvicina pupariation 5-7. Sfide immunitario, lesioni o piombo disturbo meccanico ad un prematuro, in quest'ultimo caso reversibili, mobilitazione di ematociti concentrati residenti nel emolinfa 4,6,13.
Studi precedenti hanno suggerito che residenti e circolantihemocytes larvali sono dello stesso lignaggio, ma differiscono nella loro adesive o homing proprietà 6,7,13,14. Isolamento selettivo di circolante rispetto ematociti concentrati residenti rivelato livelli elevati di proliferazione della popolazione hemocyte residente, suggerendo la loro esposizione ai segnali induttivi da HPS larvali HPs 6. Drosophila sono fiancheggiate da epidermide e strati muscolari e in seguito sul porto ammassi di neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico (PNS) e la funzionalità epatica simile oenocytes 6. Funzionalmente, esperimenti di ablazione delle cellule mutanti e genetici hanno dimostrato che i neuroni sensoriali presenti negli HPS sostenere la sopravvivenza trofico e la localizzazione di hemocytes larvali 6.
Qui si descrive un metodo per l'isolamento specifica e quantificazione dei residenti e circolanti ematociti concentrati dal singolo larve Drosophila, e un protocollo per la meccanica hemocyte mobilitazione. I metodi possono essere utilizzati per la ex vivostudio di ematociti concentrati e può essere ulteriormente adattato ad altre fasi di sviluppo di Drosophila come la pupa e adulto, e altri sistemi di invertebrati. Dal momento che gli studi precedenti non hanno distinzione tra residenti e hemocytes circolanti, questo protocollo prevede uno standard comune per lo studio delle cellule del sangue, che soggiornano e contribuirà ad aumentare la coerenza della ricerca sulle cellule del sangue invertebrati.
In primo luogo, il hemocyte Bleed / Raschiare saggio descrive l'isolamento differenziale e quantificazione automatizzata di fluorescente residente proteina-marcato e circolanti popolazioni hemocyte dal singolo larve Drosophila; il protocollo prevede due opzioni per microscopi regolari e piastrelle scansione attrezzate (Figura 1). Come risultato, la percentuale di emociti circolanti e il numero totale di emociti per larva si ottengono. Il metodo si basa sul transgenico larve Drosophila che esprimono la proteina fluorescente fra loro delle cellule del sanguepopolazione. La scelta del driver hemocyte o giornalista determina il risultato, cioè, che la popolazione di cellule del sangue è visualizzato e quantificato. Per etichettare principalmente macrofagi (plasmatocytes), che costituiscono la stragrande maggioranza della popolazione residente e la diffusione hemocyte della larva di Drosophila 6, transgeni adatti includono Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 (by H. Agaisse 16), o mangiatore-GAL4 17; per l'etichettatura del relativamente piccola popolazione di cellule di cristallo, le linee adatte sono BcF6-CFP e-GFP 18, o lz-GAL4 (di J. Pollock 19); per lamellocytes etichettatura, un tipo di cellula specializzata indotta principalmente da sfide immunitarie e lesioni 13, ad esempio, MSNF9mo-mCherry può essere utilizzato 17. Alcuni driver transgenici sono espressi in una gamma differenziata di sanguecellule e progenitori, come Lui - GAL4 20, che le etichette circa l'80% di tutte le cellule del sangue larvali 20. Si prega di notare che in tutti i casi in cui vengono utilizzati i driver GAL4, è necessaria combinazione con UAS-GFP o un'altra proteina fluorescente UAS-transgene. Nella sezione Risultati, questo metodo viene utilizzato per monitorare il numero di cellule del sangue e comportamento pratica nel corso dello sviluppo larvale.
In secondo luogo, il hemocyte disturbo Assay descrive una fase precedente progettato per staccare emociti residenti da manipolazioni esterne, che consente poi la valutazione della capacità di emociti di ri-aderire e sede di HPs entro un periodo di tempo limitato (30 - 60 min) 6. In genere questo test è seguito dal Bleed / Raschiare test per determinare la percentuale di ematociti concentrati in circolazione per ogni larva. Vi presentiamo un protocollo semplificato per questo test (Figura 1D), che utilizza disturbi nel vortex ingegnoh perline di vetro, piuttosto che la manipolazione di singola larva con un pennello come descritto in precedenza 6. Nella sezione Risultati, questo test viene utilizzato per dimostrare che transitoriamente indipendente galleggiante ematociti concentrati nel emolinfa e può essere recuperato nella frazione di ematociti concentrati in circolazione. Il test è utile anche per quantificare le differenze di ematociti concentrati nel loro homing / adesione a siti residenti, confrontando ad esempio, diversi background genetici o le condizioni di stimolazione. Si prega di notare che questa manipolazione meccanica riflette un processo reversibile ed è distinto da Infezione o lesioni indotte mobilitazione hemocyte residente, che in genere non sono reversibili in un breve lasso di tempo 4,13.
Protocol
1. hemocyte Bleed / Raschiare Assay
- Preparazione di diapositive:
- Opzione 1 per microscopi senza funzione scansione piastrella: Per ogni larva da analizzare, preparare un vetrino con circa 5 Pap-pen pozzetti di 2 mm quadrati ciascuna, corrispondente all'area di visualizzazione di campo del microscopio; aggiungere circa 5 - 10 ml di mezzi S2 per ogni (Figura 1A). Conservare i vetrini in camera umida per evitare che i pozzi secchi.
- Opzione 2 per microscopi con funzione di scansione tegola: per ogni larva da analizzare, preparare un vetrino con 3 o 4 Pap-pen pozzi di ~ 3-4 mm quadrati ciascuno; aggiungere circa 15 - 20 ml di S2 media per ciascun pozzetto (Figura 1B). Conservare i vetrini in camera umida per evitare che i pozzi secchi.
NOTA: Il numero sopra raccomandato di pozzi è sufficiente per i totali di fino a 3.000 ematociti concentrati per larva (fine 2 ° instar larve, ~ 2,5-3 mm di lunghezza, transgene etichettatura la maggior parte dei larvAl cellule del sangue). Nel valutare il numero di cellule del sangue più grandi, potrebbero essere necessari più pozzi per evitare sovraffollamento.
- Raccolta delle larve:
- Bagnate acqua in un flacone contenente larve mosca e larve a filo in una capsula di Petri, o scoop del cibo contenente le larve in una capsula di Petri e diluire con acqua usando una bottiglia a zampillo.
- Raccogliere delicatamente larve dalla piastra di Petri con un pennello e metterli in acqua in un piatto cavità o su un vetrino su un blocco di raffreddamento.
NOTA: Le larve possono essere conservati per un periodo di tempo limitato in acqua o su un blocco freddo; utilizzare campioni entro 45 minuti o meno per evitare la morte delle larve o effetti indesiderati sulla ematociti concentrati.
- Dissezione:
- Selezionare larve al microscopio a fluorescenza su un blocco di metallo fredda. Misurare le dimensioni e immagine larve se lo si desidera.
- Isolamento di ematociti concentrati in circolazione ("Bleed"):
- Una volta selezionate le larve, mettere una larva nel primo Pap-penna bene (Figura 1C,2A).
- Utilizzare 2 aghi puliti o forbici dissezione e pinze per fare un'incisione sia a posteriori e anteriori estremità della larva. Per evitare di disturbare hemocytes residenti, è meglio fare queste incisioni sul lato ventrale della larva. Per risultati coerenti, rendere le incisioni nelle stesse posizioni per ogni larva. Per il 1 ° instar larve, 1 incisione (nella parte anteriore ventrale) è sufficiente.
- Lasciare larva sanguinare per pochi secondi senza alcuna pressione o agitazione fisica (Figura 2A).
NOTA: Se si lavora su larve multipla è meglio fare queste incisioni per ciascuno di essi prima di procedere alla fase successiva per evitare di mantenere le larve sul ghiaccio troppo lungo che potrebbero influenzare l'integrità dei campioni. - Sollevare delicatamente la larva con gli aghi o pinze e immergerlo nel secondo pozzo per sciacquare ogni residuo emociti circolanti. Dopo di che, seguire con il rilascio di ematociti concentrati residenti.
- Trasferire delicatamente la larva al pozzo successivo (Figura 2C).
- Identificare la ghiandola linfatica della larva, che tipicamente si trova a circa 1/3 dall'estremità anteriore della larva, e che possono fluorescenza dorsalmente attraverso la parete del corpo larvale. Evitare la ghiandola linfatica rilasciando hemocytes residenti da appuntare giù la larva con un ago il più vicino possibile alla ghiandola linfatica per evitare la puntura (Figura 2C).
NOTA: Durante lo sviluppo normale della maturazione di linfa ematociti concentrati ghiandola è in ritardo rispetto al ematociti concentrati larvali, e reporter fluorescenti di ematociti concentrati differenziati non può mostrare un segnale nella ghiandola linfatica di giovani larve. In questi casi, meno attenzione deve essere prestata alla ghiandola linfatica come nessuna contaminazione di diritti differenziati ematociti concentrati larvali fluorescenza etichettati da hemocytes ghiandola linfatica è previsto. - Rilasciare globuli residenti in un dissectiil processo di raschiatura e / o jabbing. Utilizzare un ricamo al pin efficacemente lungo la larva vicino alla ghiandola linfatica (vedi sopra) o altre zone del corpo, se necessario. Utilizzare un altro ago jab ai gruppi di emociti che sono visibili attraverso la parete del corpo larvale (Figura 2C, E), al fine di separare i emociti. Hemocytes può anche essere rilasciato in un movimento raschiatura. Tuttavia, strappando l'epidermide precoce può rilasciare grandi gruppi di cellule del sangue, che potrebbero rendere il conteggio automatizzato più impegnativo.
NOTA: A seconda dell'età e del genotipo della larva, il numero di ematociti concentrati totali varia. Distribuire il processo di rilascio sopra descritta in diversi pozzi per evitare il sovraffollamento di alcuni pozzi di cellule del sangue, che potrebbero rendere unico l'analisi delle immagini delle cellule più difficile. - Se qualche ematociti concentrati rimangono nella carcassa finale, contare questi ematociti concentrati per l'osservazione al microscopio e l'utilizzo di un contatore di conteggio manuale (Figura 2E). Per facilitare il conteggio, ppizzo carcassa su una superficie pulita della stessa slitta e stenderlo più sottile possibile per ridurre il numero di piani ottici.
- Una volta che la dissezione è completo, attesa tra 5 - 10 min per le cellule di stabilirsi (ma non necessariamente aderiscono) prima di imaging pozzetti. Incubare il vetrino in una camera umida per evitare l'essiccamento, e di evitare un trasporto sicuro delle diapositive, che potrebbe disturbare la hemocytes stabiliti.
NOTA: quando la determinazione delle conte hemocyte, le cellule rilasciate non sono fissi e le cellule devono essere ripreso poco dopo la dissezione, preferibilmente entro 30 minuti dopo il rilascio dalla larva. A seconda del volume di proprietà medie e cellule, la stragrande maggioranza delle cellule sarà depositato entro 5 - 10 min, che dovrebbe essere confermata concentrandosi attraverso i piani ottiche del mezzo nel pozzo. Tuttavia, solo una frazione di cellule del sangue avrà aderito alla superficie del vetrino da questo momento, un fatto che deve essere considerato se modificare questo protocollo per approache basato fissazione delle celluleS.
- Prendere immagini dei ematociti concentrati stabilirono sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 2B, D, F). Seguite con quantificazione di ematociti concentrati utilizzando il software ImageJ.
- Immagine Preparare per l'algoritmo conta cellulare ImageJ:
- Aperto immagine di pozzetto utilizzando ImageJ: File → Apri → (individuare il file e selezionare).
- Assicurarsi che l'immagine (s) è a 8-bit o 16-bit. Regolare la soglia per l'immagine selezionando Immagine fare clic su Modifica e selezionare Soglia. Rispettare la "finestra Threshold" (Figura 3A).
- Selezionare l'opzione "Sfondo Scuro". Selezionare "Red" e di aumentare il livello di soglia inferiore (vedi freccia nera) fino a quando ogni cella l'immagine è contrassegnata con un punto rosso (le cellule che non vengono coperti si vedrà in scala di grigi; Figura 3B). Come la soglia inferioreè aumentato alcune cellule diventano non marcato. Questo può essere l'indicatore per quanto lontano impostare la soglia inferiore.
NOTA: A volte gruppi di cellule non possono essere risolti e sarebbero considerati come uno dal contatore di particelle. In tali casi, il numero di cellule in un cluster può essere stimata esaminando dell'immagine (ingrandire se necessario) e conteggio manuale usando un contatore riscontro. In alternativa, la soglia inferiore può essere aumentata per risolvere gruppi di cellule; tutte le cellule non marcate risultanti da questa manipolazione possono essere contati con un contatore riscontro.
- Analizzare numero di cellule utilizzando ImageJ:
- Lanciare l'analizzatore di particelle per contare le cellule (Figura 3C). Selezionare Analizzare e cliccare su Analizza particelle. Opzionalmente selezionare "Overlay Contorni" per vedere le particelle conte algoritmo (Figura 3D). In alternativa, impostare un limite alla dimensione o pixel dell'area di un'unità (ad esempio., Cellule, grumo di cellule, ecc) per l'algoritmo per contare.
- Fare clic su OK. Osservare una finestra di riepilogo con il conteggio (Figura 3E).
2. hemocyte Disturbance Assay
- Disturbare emociti, selezionare le larve e metterli in una provetta da 2 ml con circa 0,5 g di perle di vetro (212 - 600 micron) e aggiungere 0,5 ml di acqua.
- Agitare il tubo, a mano, a velocità 10 per 1 min.
- Recuperare le larve dalle perle di vetro da versare il contenuto della provetta in una piastra di Petri e individuando le larve con un pennello.
- Per la fase di recupero, inserire le larve in piatti precedentemente preparate Petri con piccole quantità di cibo mosca. Lasciare che le larve di ristabilire il loro modello hemocyte per un periodo di 45 minuti o, se lo desideri.
NOTA: Eliminare qualsiasi larve che hanno smesso di muoversi, come sono morti nel processo. Tuttavia, di solito vediamo ldanno ittle dopo 1 min di vortex (vedi sotto e supplementare Figura 1). - Dopo il periodo di recupero, continuare con la Bleed / Raschiare test come descritto nella Sezione 1.
Representative Results
Per illustrare risultati tipici di metodi descritti, in primo luogo abbiamo usato il hemocyte Bleed / Raschiare test per delineare la progressione dei numeri hemocyte larvali e la loro residenza nel corso di sviluppo larvale (Figura 4). Residenti e circolanti popolazioni hemocyte larvali sono stati isolati dal singolo larve (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP, He-GAL4 per etichettare la stragrande maggioranza di ematociti concentrati larvali) e quantificato utilizzando ImageJ. Coorti di larve di dimensioni 1,2 millimetri (~ 48 ore AEL o 1 ° instar), 2,5 mm (~ 80 ore AEL o in ritardo 2 ° instar) e 3,5 mm (~ 96 ore AEL o 3 ° instar) sono stati esaminati (Figura 4) . Numeri hemocyte ampliato nel corso dello sviluppo larvale, correlando con e superando le stime precedenti sulla base di microscopia ottica di colorante macchiato larve 7 e il conteggio in tempo reale di proteina marcata ematociti concentrati fluorescente attraverso la cuticola larvale 6. In 1 ins sttar larve quasi tutti hemocytes erano residenti, mentre la frazione di emociti circolanti aumenta progressivamente nel corso dello sviluppo larvale (Figura 4B, C), in linea con precedenti pubblicazioni 6,7.
Avanti abbiamo esaminato se il metodo controlla fedelmente la transizione ematociti concentrati tra residenti e popolazioni circolanti. Approfittando del fenomeno che emociti residenti possono essere transitoriamente staccati da disturbo meccanico e si ri-aderire ai loro siti residenti spontaneamente 6, ci eravamo dispersi hemocytes residenti nel vortex con perle di vetro come descritto nella hemocyte Disturbance Assay. Infatti, disturbo meccanico di larve ha portato ad un notevole aumento della popolazione di circolazione hemocytes a scapito di emociti residenti (Figura 5). Dopo un periodo di recupero di 45 min, emociti erano sostanzialmente ritornati al loro stato aderente, sia mediante ispezione visiva e dal comepercentuale lutati di cellule circolanti (Figura 5D, E). Come previsto, il numero totale hemocyte rimasti stabili nel tempo, nonostante il passaggio di emociti tra le popolazioni circolanti e residenti.
Alcune considerazioni supplementari sono stati presi in considerazione. Per confermare che vortex non ha causato danni ai tessuti importanti, vortex con perle di vetro è stata eseguita in presenza di blu trypan (Sigma) per diversi periodi di tempo (1, 5, 20 min). Sia 1 e 5 min vortex non ha causato alcuna interruzione del tessuto evidente, mentre il 20 min vortex portato in piccole aree di danno, simile a danni causati da punti aghi utilizzati come controllo positivo (Supplemental Figura 1). Mentre danni interni di epidermide o di altri tessuti, senza danni cuticola non si può escludere, questo scenario sembra piuttosto improbabile come ematociti concentrati di 1 min e 5 ri-aderito larve min-trattati nelle caratteristiche attese e lasso di tempo, suggerendo l'integrità larvale non è stato compromessod (supplementare Figura 1). Al contrario, le larve in agitazione per 20 min sofferto di una mancanza di riadesione, e non ha nemmeno mostrare attaccamento di circolazione hemocytes siti epidermiche della ferita, come è stato descritto in precedenza 14.
Infine, per dimostrare la riproducibilità del metodo, abbiamo confrontato repliche biologiche di 2.5 mm larve di questi due esperimenti, che sono stati condotti da sperimentatori distinti. Come illustrato nella figura 2 supplementare, entrambe le coorti hanno mostrato il numero totale comparabili di ematociti concentrati per larva, e la percentuale di ematociti concentrati circolanti. T test di Student non ha evidenziato differenze statisticamente significative, suggerendo che il metodo è riproducibile e ampiamente applicabile.
Figura 1. hemocyte spurgo / Raschiare e Disturbance Assay s etup e schematico. (A) Immagine singola Imposta diapositiva: cinque piazze 2mm per l'imaging con un obiettivo 5X (B) Piastrelle Imposta diapositiva scansione:. 3 mm quattro piazze per l'imaging di spurgo / graffi di ≤2.5 mm larve con un microscopio scansione tegola. Obiettivi consigliati per l'imaging sono 5x o 10x. (C) Bleed / Raschiare Assay quantificazioni schematiche e conseguenti utilizzando ImageJ. (D) Nel Disturbo test, il modello hemocyte viene interrotto meccanicamente mediante vortex larve con perle di vetro. Le larve sono autorizzati a recuperare per un periodo di 45 minuti durante il quale emociti ri-aderire alle tasche ematopoietiche. Le proprietà adesive di ematociti concentrati possono essere valutate con questo metodo, quantificare la percentuale di ematociti concentrati in circolazione dopo il disturbo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Bleed / Raschiare test per rilasciare circolante e hemocytes residenti. (A) Per spurgare una larva, incisioni ventrali ai posteriori e anteriori estremità della larva sono realizzati (forbici simboli). (B) ematociti concentrati in circolazione fluirà fuori delle incisioni e depositarsi sulla superficie del vetrino. (C) La ghiandola linfatica (LG) si trova e immobilizzato senza pungere esso. Hemocytes residenti sono rilasciati da jabbing e / o raschiare la larva con un ago. Hemocytes (D) residenti sulla trasparenza. (E, F) Il processo viene ripetuto fino Raschiare tutti hemocytes residenti sono rilasciati. La carcassa larvale contenente la ghiandola linfatica intatto è lasciato alle spalle. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. automatizzato quantificazione hemocytes utilizzando ImageJ. (A, B) Dopo aver aperto un file di immagine hemocyte in ImageJ, il livello di soglia inferiore è rettificato per tener conto di tutte le celle nell'immagine. (C, D) Analizzare particelle richiede l'impostazione della dimensione dei pixel delle cellule, circolarità, e la lettura risultato formato (ad esempio, Overlay strutture). (E) finestra di riepilogo che visualizza il numero di hemocytes. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante dei risultati (1). Numero hemocyte e lo stato residente nel corso di sviluppo larvale. (A) Presentazione degli stadi larvali utilizzati; 1 ° instar (48 ore AEL; ~ lunghezza 1,2 mm); 2 ° instar (80 ore AEL; 2,5 mm di lunghezza); 3 ° instar (96 ore AEL; ~ 3,5 mm di lunghezza). Il genotipo è Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; (C) Percentuale di ematociti concentrati circolanti He-GAL4. Fasi sono stati confermati valutando mouthhooks larvali. (B) Schema Bar di numeri hemocyte residente circolanti e ai rispettivi stadi larvali.. Si noti che la frazione di emociti circolanti aumenta sproporzionatamente nel corso dello sviluppo larvale. (D) Totale emociti, risultante dalla somma del circolante e hemocytes residenti per larva. Emociti sono stati quantificati con il metodo di spurgo / Raschiare; n ≥ 6 larve / condizione, barre di errore mostrano la deviazione standard, i risultati confermati in 3 esperimenti indipendenti replicare.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Risultati rappresentativi (2). Effetti di disturbo meccanico sulla residenza hemocyte. (AC) Esempio di una larva prima e dopo vortex con perle di vetro, seguiti da 45 minuti di recupero (A) Nessun controllo disturbo.; ematociti concentrati sono localizzate in caselle ematopoietiche (B) Turbativa modello hemocyte a 0 minuti dopo vortex larve in una sospensione di perline di vetro e acqua (C) modello hemocyte a 45 min di recupero post-disturbo..; molti hemocytes si sono trasferiti per le tasche ematopoietiche; notare allargata dorso-vasi cluster associati e strisce dorsali che sono siti predominanti precoce post-disturbo di accumulo (frecce). Il genotipo è Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 x yw. (D) Percentuale di ematociti concentrati quantificati con il metodo di spurgo / Raschiare circolante. (E) Totale hemocytes, risultante dalla somma di circolante e ematociti concentrati residenti per larva. n ≥ 4 larve / condizione, barre di errore mostrano la deviazione standard, i risultati confermati in 3 esperimenti indipendenti replicare. Test t per confermare significato, NS (non significativo), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui, descriviamo il primo metodo per recuperare quantitativamente globuli residenti e circolanti dal singolo larve Drosophila, e quantificare queste due popolazioni hemocyte. Il protocollo comprende il rilascio sequenziale dei circolanti e residenti cellule del sangue, seguito da imaging e il conteggio delle cellule automatizzato. Hemocytes residenti larvali possono essere transitoriamente mobilitati in circolazione da disturbo meccanico, un processo che è noto per essere in gran parte invertita a 30 - periodo di recupero min 60 6. Di conseguenza, questo protocollo è stato testato in due modi, (1) per valutare il numero hemocyte totale per larva e frazione di circolazione hemocytes nel corso dello sviluppo larvale, e (2) dal sperimentalmente sloggiare emociti residenti con metodo automatico, che ha confermato la stretta correlazione tra la localizzazione e il numero hemocyte hemocyte nel residenti e popolazioni circolanti. Inoltre, la riproducibilità del metodo è stata dimostrata da comparing due set di dati di repliche biologiche.
In passato, i laboratori hanno usato una serie di tecniche per la quantificazione hemocytes larvale 6,13,21. Questo protocollo stabilisce uno standard comune per recuperare e quantificare popolazioni di cellule del sangue, che soggiornano e circolano da larve di Drosophila, fornendo una piattaforma facilmente adattabile. Il metodo descritto è fondamentale per gli studi che si concentrano sul ruolo di ematociti concentrati residenti e il loro microambiente, il Hematopoietic Tasche 4-6, ed è adatto per lo studio della proteina fluorescente-transgene che trasportano Drosophila tensioni wild type e sfondi geneticamente modificati. Il protocollo è importante anche per gli studi che si concentrano su hemocyte mobilitazione dopo sfida immunitario o lesioni, e la segnalazione geneticamente o ambientale indotto che fa scattare la mobilitazione di ematociti concentrati residenti o cambiamenti nel numero hemocyte totale (rivisto in 4). Va notato che, in caso di prematura differentiation e il rilascio di ematociti concentrati dal ghiandole linfatiche, distinguendo embrionale / larvale contro lignaggi ghiandola linfatica possono essere limitate dal pattern di espressione del reporter hemocyte fluorescente usato.
Il protocollo presentato qui si basa su immagini dal vivo, hemocytes fluorescenza marcata. In futuro, può essere modificato per consentire il rilevamento di cellule rilasciati dopo fissazione, ad esempio, mediante immunocitochimica. In questo caso, il protocollo può essere necessario adattare per garantire la completa adesione delle cellule del sangue, ad esempio aumentando i tempi di incubazione adesione, e l'aggiunta di rivestimento dei vetrini adesivo, come concanavalin A. Poiché il metodo consente il recupero di emociti e loro manipolazione ex vivo, che andrà a beneficio di una vasta gamma di sviluppo, cellule studi biologici e biochimici. Cellule residenti e del sangue circolante si trovano in tutte le fasi di sviluppo di Drosophila postembrionale e altri invertebrati, 22 suggesting che l'adattamento di questo metodo potranno beneficiare di una vasta gamma di studi al di là del sistema ematopoietico larvale Drosophila.
Acknowledgments
Ringraziamo Jesper Kronhamn e Dan Hultmark, Michael Galko, e la Bloomington Stock Center per gli stock mosca. Un ringraziamento speciale a Courtney Onodera di consulenza con l'analisi statistica. Ringraziamo Katrina Oro per la lettura critica del manoscritto, e Kalpana Makhijani, Katrina oro, i membri del laboratorio Derynck, e membri del laboratorio Nystul di discussione e commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Programma UCSF per Breakthrough ricerca biomedica (PBBR), Broad Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health e 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (a KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
