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Biology

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52734

Abstract

Il calcio è un regolatore molto importante di molti processi fisiologici nei tessuti vascolari. La maggior parte delle funzioni endoteliali e muscolari lisce altamente dipendono dalle variazioni dei calcio intracellulare ([Ca 2+] i) e l'ossido nitrico (NO). Al fine di comprendere come [Ca 2 +] i, NO e molecole a valle sono gestite da un vaso sanguigno in risposta a vasocostrittori e vasodilatatori, abbiamo sviluppato una nuova tecnica che si applica calcio etichettatura (o NO-etichettatura) coloranti con due fotoni microscopia per misurare la movimentazione di calcio (o la produzione di NO) nei vasi sanguigni isolati. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo che illustra come isolare un dell'aorta da un topo, etichetta di calcio o di NO nelle cellule endoteliali o muscolari lisce, e l'immagine del calcio transienti (o la produzione di NO) utilizzando un microscopio a due fotoni seguente fisiologico o stimoli farmacologici. I vantaggi di utilizzare il metodo sono multi-fold: 1) è possibile simultanealy misurare transienti di calcio in entrambe le cellule endoteliali e cellule muscolari lisce in risposta a stimoli diversi; 2) che permette di cellule un'immagine endoteliali e cellule muscolari lisce nel loro ambiente nativo; 3) questo metodo è molto sensibile al calcio intracellulare o nessuna modifica e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise; e 4) approccio descritto può essere applicato alla misura di altre molecole, quali le specie reattive dell'ossigeno. In sintesi, l'applicazione della microscopia a due fotoni emissione laser per monitorare transienti di calcio e la produzione di NO nelle endoteliali e muscolari lisce cellule di un vaso sanguigno isolato ha fornito dati quantitativi di alta qualità e promuovere la nostra comprensione dei meccanismi che regolano la funzione vascolare.

Introduction

Il calcio è un secondo messaggero fondamentale all'interno delle cellule vascolari quali cellule endoteliali e muscolari lisce. È lo stimolo primario per la contrazione vascolare e svolge un ruolo importante nella dilatazione vascolare, compresi i suoi effetti attraverso NO generazione nel endotelio. A causa di limitazioni di tecnologie di imaging, è stato virtualmente impossibile osservare movimentazione calcio all'interno del vaso intatto. Lo sviluppo dei due sistemi di imaging fotonica e la creazione di nuova di calcio o di coloranti di etichettatura, permette di immagine ad una profondità e una risoluzione sufficiente per iniziare a comprendere le dinamiche del calcio e la produzione di NO all'interno del sistema vascolare.

Microscopia a due fotoni è stata recentemente applicata in tessuti, organi e studi, compresi quelli interi a causa della sua superiore capacità di penetrare in profondità i tessuti con sfondo bassa fluorescenza e sensibilità segnale alto animale. 1,2 Lo spettro ristretto di due fotoni alla illuminatpunto focale ioni e l'uso di rilevatori non descanned sono le ragioni per cui due fotoni microscopia è superiore alla microscopia confocale tradizionale. Microscopia confocale non può produrre immagini di alta qualità alla profondità del tessuto necessario a causa della auto-fluorescenza e la dispersione di luce fuori fuoco nella pinhole confocale. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza un microscopio a due fotoni per misurare [Ca 2+] i segnalazione e produzione di NO in intatti, singole cellule dei vasi sanguigni con alta risoluzione ed un basso rapporto segnale-rumore.

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Protocol

Le procedure sperimentali descritte qui di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso il Medical College of Wisconsin ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Isolamento del Topo Aorta

  1. Anestetizzare ratto con isoflurano (5% di induzione, 1,5 a 2,5% di manutenzione) o un altro IACUC metodo approvato.
  2. Posizionare il ratto in posizione supina. Al fine di mostrare gli organi addominali, fare una piccola incisione mediana ventrale attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo addominale. Uso garze deviano delicatamente gli intestini per esporre l'aorta e vena cava come mostrato in Figura 1.
  3. Brevemente, Blunt sezionare l'aorta dal tessuto connettivo e dalla vena cava. Utilizzando sutura, legare l'aorta più vicino possibile al rene. Sezionare circa 1 - 2 cm di aorta e mettetelo in una conica da 15 ml tuessere contenente normale soluzione salina fisiologica (PSS, in mm: 140 NaCl, 1.2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 4.5 KCl, 6 Glucosio, 10 HEPES) su ghiaccio.
  4. Una volta che l'aorta è isolato, l'eutanasia degli animali secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutti i non-sopravvivenza procedure euthanize animali profondamente anestetizzati di toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell'animale. 3
  5. Utilizzando un microscopio dissezione, pinze a punta fine, e microscissors sezionare il grasso e tessuto connettivo fuori dell'aorta. Una volta che l'aorta è pulito, tagliare l'aorta longitudinalmente e posizionarlo nella PSS in ghiaccio per dopo.

2. Dye Caricamento e incubazione

  1. Pipettare 7 ml di 1 mM Fluo-4 del mattino tintura, che viene fornito in soluzione basata DMSO-, in singole provette microlitri 500 che sono stati rivestiti con un foglio di alluminio. Conservare in congelatore a -20 ° C per preservare le proprietà di tintura nel corso del tempo. Nota: questi aliquotati cosìluzione dovrebbe essere stabile per almeno sei mesi.
  2. Prima dell'uso, lasciare che i soluzioni coloranti per riscaldarsi a RT prima dell'apertura. Preparare le soluzioni di lavoro immediatamente prima dell'uso. Non conservare il reagente diluito per un uso successivo.
  3. Aggiungere 7 ml di ready-made 1 mM Fluo-04:00 colorante sciolto in soluzione DMSO a 450 ul di PSS che non contiene calcio. Aggiungere 40 ml di soluzione al 10% di DMSO base non Acid Pluronic al cocktail di carico per contribuire a disperdere le acetossimetil (AM) esteri e migliorare il carico del colorante calcio.
  4. Posizionare le aorte sezionato nelle provette 500 microlitri contenenti il ​​cocktail di carico (come descritto in 2.3) per 1 h. Coprire tutte le provette con pellicola e posto su un agitatore rotante a temperatura ambiente.
  5. Per monitorare la produzione di NO nel sistema vascolare, utilizzare DAF-FM diacetato colorante. Incubare l'aorta in una soluzione contenente 450 microlitri PSS, 40 microlitri di acido Pluronic e 5 ml di 10 mM DAF-FM diacetato. Simile al protocollo di incubazione di calcio (descritto al punto 2.3), posizionare l'aortain un tubo contenente 500 microlitri della soluzione di NO-dye coperto in stagnola e posto su un agitatore rotante per 30 minuti a 4 ° C seguita da successiva 30 minuti a RT.
  6. Quando la produzione di NO è misurata, utilizzare il endoteliale NO sintasi bloccante, L-NAME, per bloccare la produzione di NO come controllo come mostrato nella Figura 4B. Per tale procedura, di aggiungere cocktail (come descritto in 2.5) 100 nM L-NAME per gli ultimi 30 minuti di incubazione (a temperatura ambiente).

3. La scansione laser a due fotoni Microscopia Protocol

  1. Dopo il 1 h di incubazione, lavare l'aorta 2 - 3 volte a pulito PSS per rimuovere tintura extracellulare.
  2. Trasferire l'aorta a un piatto siliconata contenente sia PSS normale o Ca 2+ tampone -free (dipende dal protocollo sperimentale). Pin l'aorta giù sul rivestimento in silicone con avventizia in contatto con il silicone (cioè, lumen endoteliali esposti all'apertura piatto) utilizzando perni a forma μ. In alternativa, utilizzare una fetta di ancoraggiogriglia o colla per fissare il tessuto.
    Nota: per ridurre lo stress e possibili artefatti meccanici, trasferimento e fissare dell'aorta in Ca 2 + -free soluzione e attendere 5 - 10 minuti prima di iniziare l'esperimento.
  3. Collegare una pompa peristaltica o una siringa alla piastra siliconata per l'applicazione automatica o manuale di farmaci o per cambiare la soluzione extracellulare.
  4. Porre la capsula sotto il nasello del montante microscopio a due fotoni, e installare e posizionare un 25 × (NA 1,05 e distanza di lavoro 2 mm) acqua-immersion lente dell'obiettivo sopra il campione. Nota: Se questo obiettivo specifico non è disponibile, utilizzare un obiettivo specificamente fabbricati per l'imaging due fotoni, perché può aumentare la risoluzione del segnale notevolmente rispetto ad un obiettivo normale.
  5. Attivare il laser due fotoni utilizzando il software (il laser inizia a pompare e accendere). Tune l'eccitazione laser a 820 nm.
  6. Utilizzando epifluorescenza, individuare l'aorta e mettere a fuoco l'obiettivo sula superficie endoteliale utilizzando la regolazione grossolana.
  7. Accendere il microscopio in modalità di scansione laser a due fotoni, assicurando che il laser di eccitazione è la modalità di blocco, i rilevatori non descanned sono impegnati e sono installati i filtri di emissione adeguati per gli spettri di emissione previsto. Nota: Qui, il FV10-MRL / R (495-540 nM) sono stati utilizzati.
  8. Iniziare la scansione in tempo reale utilizzando la potenza del laser circa il 5% e finemente focalizzare l'obiettivo, al fine di visualizzare le cellule endoteliali.
    Nota: le cellule endoteliali esporranno un segnale fluorescente forte quando incubate in condizioni normali PSS. Questo sarà notevolmente più debole quando i vasi sono incubati in tampone privo di calcio. Le cellule endoteliali saranno presenti sulla parte superiore dell'aorta aperto e le cellule muscolari lisce sono visibili appena sotto le cellule endoteliali (vedere Figura 2). Poiché i vasi sanguigni sono né liscia né, ci saranno luoghi in cui sono presenti sia le cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. </ Li>
  9. Una volta che le cellule sono a fuoco, programmare il software del microscopio di raccogliere immagini in sequenza in modalità di scansione veloce (scansione raster, finestra 512 x 512 pixel con una frequenza di raccolta cornice di 1,1 s). In parallelo con Fluo-4:00 fluorescenza, raccogliere trasmesse immagini luce per rilevare variazioni vaso contrazione e visualizzare meglio le condizioni sperimentali.
  10. Dopo la raccolta di immagini di base dei segnali, modificare la concentrazione di ioni Ca 2+ nella soluzione esterna o lentamente applicare agenti farmacologici stimolo utilizzando la pompa peristaltica mentre imaging. Osservare l'aumento segnale fluorescente all'interno delle cellule caricate.
    Nota: Le cellule endoteliali rispondono ai cambiamenti nel flusso, in tal modo si raccomanda di utilizzare applicazioni a bassa laminari e di prova del veicolo prima dell'applicazione di attivatori farmacologiche di Ca 2+ o NO segnalazione. Per ricalcolare calcio intracellulare a valori di concentrazione Nm navi cariche di Fluo-4 (costante di dissociazione per Fluo-4 is 345 nM), intensità di fluorescenza potrebbe essere registrato all'inizio dello studio e dopo l'aggiunta di ionomicina e MnCl 2. 4

4. Elaborazione delle immagini e calcoli

  1. Scaricare e installare Figi pacchetto di elaborazione delle immagini.
  2. Aprire il file di immagine in Fiji. Dopo l'importazione del file, dividere i canali (luce trasmessa e di segnale fluorescente) quando richiesto. Utilizzare solo il segnale fluorescente per l'analisi dei dati.
  3. Nell'ambito del programma Fiji, fare clic sulla scheda analizzare e scorrere verso il basso fino all'opzione strumenti. Sotto l'opzione strumenti, trovare la scheda che dice direttore ROI e fare clic su di esso; Apparirà una nuova finestra.
  4. Dopo questo, clicca su misurazioni impostati nella scheda analizzare. Selezionare le misure specifiche di interesse. Per le misure transitorie di calcio, utilizzare l'opzione valore medio grigio.
  5. Con lo strumento traccia circolare, iniziare a tracciare le regioni di interesse (ROI) e cliccare su "aggiungi" nella schermata direttore ROI per ogni ROI. Una volta che tutte le cellule di interesse sono stati rintracciati, nella finestra di gestione ROI, selezionare Misura Multi nella scheda "altro". Ricordati di salvare le misurazioni sia direttamente o copiare e incollare tutte queste misure in un foglio di calcolo.
  6. Aprire file * .txt o foglio di calcolo Excel da Fiji e trasferire i numeri per un nuovo foglio di lavoro di origine. Nota: in alternativa, usare qualsiasi programma come Sigma Plot o Prism per ulteriori analisi.
  7. Nell'ambito del programma di origine, utilizzare il menu Plot Linea + Simbolo → osservare una panoramica di tutte le risposte transitorie. Deselezionare le cellule non rispondono.
  8. Ricalcola il numero di traccia su scala temporale (asse X), utilizzare Colonna → Impostare valori di colonna e moltiplicare la colonna numero di traccia per la frequenza di raccolta di immagini (nel nostro caso 1.1s).
  9. Utilizzare Analisi → Statistiche su righe per tutte le registrazioni selezionate per calcolare Media (asse Y) e traccia errore standard. Tracciare Grafico finale per il gruppo attuale di cellule Plot → Linea + Symbol.
  10. Il mean calcolo transiente di calcio è descritto come seguito.
    1. Per diffusione totale del calcio all'interno del programma Origin, clicca su Grafico, quindi utilizzare il menu Analisi → calcolo → Integra. Integrante totale di area sotto la curva appare nel Registro dei risultati.
    2. Per cinetiche transitori, clicca su Grafico, quindi utilizzare il menu: Curva Analisi → non lineare Fit → Select Data Set (scegliere l'asse X vanno dal massimo al fine di risposta ai transienti). Inizia Fitting → Selezionare la funzione → decadimento esponenziale 1 → Fatto.
      Nota: raccordo esponenziale appare nella finestra di Grafico e Risultato Log. I dati ottenuti (valori) rappresentano quantità totale di calcio rilasciato, e cinetica dei canali mediate la risposta transitoria.

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Representative Results

Per valutare con precisione il contributo di calcio per la fisiologia vascolare (vasodilatazione e vasocostrizione), un protocollo è stato progettato per caricare coloranti calcio in entrambe le cellule endoteliali e le cellule muscolari lisce in isolato aortae intatto. Il sperimentale generale attuato illustrato nella figura 1, mostra la strategia di base per l'isolamento e la preparazione della nave prima di imaging. Brevemente, dopo l'isolamento dell'aorta dal ratto, deve essere pulito di grasso e tessuto connettivo e fessura longitudinalmente. L'aorta aperto deve poi essere posto in una provetta da 500 microlitri foglio coperto contenente la prima loading cocktail preparato come descritto nel protocollo e incubate a temperatura ambiente per 1 ora con dondolo leggera. Dopo l'incubazione, l'aorta deve essere lavato, immobilizzato su un piatto di silicone rivestito con avventizia vicina il silicone e lume verso l'alto, e trasferito ad un microscopio a due fotoni verticale per imaging.

Once l'aorta è stata posta sul microscopio ed il recipiente è a fuoco, le cellule endoteliali dovrebbe essere facile da individuare loro forte emissione fluorescente (Figura 2A). Le cellule endoteliali saranno anche il primo oggetto di venire a fuoco perché il lume del vaso, costituita principalmente da cellule endoteliali, deve essere rivolto verso l'alto quando la nave è immobilizzato. Oltre all'imaging cellule endoteliali, ci saranno posizioni dove le cellule muscolari lisce sono visibili (Figura 2B). Così sia endoteliali e cellule muscolari lisce potrebbero essere individuati all'interno dello stesso campo di imaging (Figura 2C). Avere la possibilità di immagine sia tipi di cellule vascolari nello stesso campo dell'imaging può portare ad una migliore comprensione di come queste cellule congiuntamente, eppure indipendente, rispondono a diversi agonisti e stimoli.

Per dimostrare l'utilità di questo metodo, le misurazioni di cellule di aorta reattività per l'aggiunta di uncetylcholine (ACh), un potente vasodilatatore che provoca specificamente cambiamenti all'interno dell'endotelio, è stata determinata. Come mostrato in Figura 3A, le cellule endoteliali sono facilmente visibili mentre incubate in normale PSS. Dopo l'aggiunta di ACh (figura 3B), i endoteliali aumenta fluorescenza che indichi contenuto di calcio intracellulare è in aumento. La quantificazione della fluorescenza emessa dalle ROI, o le cellule endoteliali, è mostrato in Figura 3C. Dopo l'aggiunta di ACh, il contenuto di calcio intracellulare aumenta ritorna rapidamente e poi lentamente al basale. L'aumento di calcio all'interno delle cellule endoteliali in risposta a ACh è coerente con le precedenti relazioni. 5,6

Simile a studi di calcio, questo protocollo è adatto per la rivelazione di endoteliale produzione di NO. Per questi esperimenti, le cellule endoteliali aortiche sono stati caricati con DAF-FM diacetato colorante come mostratoFigura 4A. Questo approccio è stato recentemente utilizzato per dimostrare che non aumenti di produzione in modo -dipendente Ca 2+ in risposta alla stimolazione ACh. 6 È importante sottolineare che, dopo il trattamento con L-NAME, un endoteliale NO inibitore sintasi, questa risposta è stata bloccata (Figura 4B).

Un altro esempio rappresentativo di come questa tecnica può essere applicata per misurare calcio intracellulare è mostrato in Video 1, in cui la soluzione di calcio contenente inserito in un recipiente che è stato incubato in tampone privo di calcio. Quando aorta vengono inizialmente incubati in tampone privo di calcio (all'inizio del video), le cellule endoteliali sono debolmente fluorescenti indicano bassi livelli di calcio nelle cellule. Tuttavia, dopo l'aggiunta di normale PSS, le cellule rispondono immediatamente aumentando [Ca 2+] i concentrazione ed emettendo alta intensità di fluorescenza. Questo esperimento dimostra che le cellule sono vive esensibile a stimoli esterni. Questo esperimento convalida anche la vitalità di questo metodo con la sua resa di dati di alta qualità.

Figura 1
Figura 1. Aorta Isolamento e Sperimentale Set Up. 1) Dopo anestetizzante ratti, fare un'incisione nell'addome e isolare l'aorta dal tessuto connettivo e la vena cava. 2) Dopo l'estrazione dell'aorta, pulire il vaso del tessuto adiposo e connettivo e aprire il vaso tagliando longitudinalmente. 3) Incubare la nave nel Fluo-04:00 dye per 1 ora a temperatura ambiente con un leggero dondolio. 4) Dopo l'incubazione, lavare l'aorta, pin su un piatto siliconata, lumen rivolta verso l'alto, e trasferirlo sul palco di un microscopio a due fotoni in posizione verticale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Imaging muscolari lisce e cellule endoteliali. Dopo il caricamento sufficiente del calcio-colorante, è possibile immagine sia le cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. (A) superiore, è un esempio di Fluo 4 fluorescenza delle cellule endoteliali in un isolato di aorta di ratto. In basso, è una immagine fluorescente è fusa con vista luce trasmessa (in modo simile per B e C). (B), è un esempio di Fluo 4 fluorescenza delle cellule muscolari lisce in un isolato aorta di ratto. (C) a causa dello spessore non uniforme dell'aorta, è possibile anche aree di immagine in cui sia muscolari lisce e cellule endoteliali sono presenti. Scala barre sono mostrati. Cliccate qui per vedere una versione più grandequesta cifra.

Figura 3
Figura 3. Misura transienti di calcio nelle cellule endoteliali in risposta a ACh. (A) L'aorta è stato inizialmente preparato e incubato in normale tampone PSS per registrazioni di base. (B) Dopo l'aggiunta di acetilcolina (ACh), il segnale fluorescente emessa dalle cellule endoteliali (ROI) migliorate indicando crescenti livelli di calcio all'interno delle cellule. Viene mostrata bar Scala. (C) I transienti di calcio delle cellule endoteliali in risposta a Ach sono stati calcolati utilizzando il software originale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Imaging ossido nitrico nelle cellule endoteliali. (A) Dopo aver caricato l'aorta con il diacetato tintura DAF-FM e l'immissione sul palco di un microscopio a due fotoni, è possibile immagine livelli di NO all'interno delle cellule endoteliali utilizzando fluorescenza emessa. (B) Dopo l'incubazione con il endoteliale NO inibitore sintasi, L-NAME, la fluorescenza generale è diminuita nei ROI, indicando riduzione dei livelli di NO all'interno delle cellule. Scala bar è mostrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1. Esempio di risposta delle cellule endoteliali a variazioni Calcium concentration. Dopo la preparazione e l'incubazione in Fluo-04:00 tintura, l'aorta è stato lavato con tampone senza calcio e posto sul palco di un microscopio a due fotoni. Quando il recipiente viene immesso nel buffer privo di calcio, la maggior parte delle cellule endoteliali sono debolmente fluorescenti. Dopo aggiunta di normale PSS, le cellule endoteliali rispondono aumentando la concentrazione di calcio intracellulare ed emettendo un segnale fluorescente forte.

Video 2
Video 2. Esempio di produzione di NO in cellule endoteliali dei isoltated ratto dell'aorta. Dopo la preparazione e l'incubazione di DAF-FM diacetato tintura, l'aorta è stato posto sul palco di un microscopio a due fotoni. Dopo l'aggiunta di Ach in a soluzione del bagno, le cellule endoteliali rispondono aumentando intracellulare NProduzione O ed emettendo un segnale fluorescente forte. Cliccate qui per vedere il video.

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Discussion

Introduzione sperimentale. Per meglio comprendere l'apporto di calcio e NO alla fisiologia vascolare, un nuovo metodo è stato sviluppato per la misurazione [Ca 2+] i e NO all'interno muscolari lisce e cellule endoteliali dei isolate aorte intatti. Insieme, questo protocollo è composto da questi passaggi critici: 1) l'isolamento meccanico e preparazione (digestione enzimatica non) della nave. È importante mantenere il tessuto sano e intatto il più possibile avere registrazioni fisiologiche ottimali. 2) L'incubazione nella tintura calcio-etichettatura o NO-etichettatura tintura con acido Pluronic è critica, tuttavia, per alcuni altri tipi navi, un tempo diverso di acido e l'incubazione Pluronic può avere bisogno di essere testati. 3) fissaggio corretto dell'aorta al piatto siliconata con la griglia e perni fornirà una vista stabile durante l'imaging con il microscopio a due fotoni. Perché la nave restringono e si dilatano, è importante assicurarsi che la nave è properly fissato al piatto per evitare artefatti da movimento che possono sorgere. 4) La quantificazione dei risultati. Si prega di notare che l'ampiezza transitoria non può essere sempre il miglior parametro per confrontare le caratteristiche fisiologiche delle cellule. L'integrale del transitorio può mostrare una differenza meglio a causa di totale [Ca 2+] i o rilascio di NO.

Quando gli esperimenti vengono eseguite correttamente, è possibile monitorare la [Ca 2+] i (o livelli di NO) cambia in risposta a stimoli come illustrato nelle figure 3 e 4 e video 1 e 2. La combinazione di una preparazione ex vivo e l'uso di due immagini fotone può fornire una migliore risoluzione del segnale e misurazioni precise dei processi intracellulari nei tessuti vascolari. Qui, queste tecnologie sono state applicate in combinazione con il classico non raziometrico Ca 2+ e NO indicatori (Fluo-4 AM ed FM DAF-diacetato, rispettivamente), amisurare transienti di calcio e la produzione di NO in singole cellule di un isolato intero dell'aorta. Noi crediamo che questa tecnica contribuirà a trasmettere le nostre conoscenze sui meccanismi di regolazione [Ca 2+] i e livelli di NO nei diversi tipi di cellule vascolari.

Modifiche e risoluzione dei problemi. I principi fondamentali della misurazione Ca 2 + Segnalazione di singole cellule muscolari lisce con ionofori sensibili è stato pubblicato inizialmente nel 1985. 7 La maggior parte dei recenti metodi di Imaging Ca 2 + livelli in cellule vascolari singole hanno impiegato una scansione laser microscopio confocale e isolati o preparazioni coltivate. Per i tessuti dinamici come vasi sanguigni, è difficile misurare calcio o livelli di NO in vivo utilizzando tecniche basate microscopia-. 2 La limitazione principale è che quasi tutti i vasi sanguigni sul lato arterioso della circolazione hanno una lamina elastica interna che si trova tra il Endotelio e lo strato più interno di cellule muscolari lisce. 8 Inoltre, la maggior parte del materiale extracellulare tra il muscolo liscio e strato avventizia è collagene. 8 elastina e collagene sono una fonte importante di auto-fluorescenza ad alta intensità ed una vasta gamma di lunghezze d'onda di eccitazione . Il forte fluorescenza di fondo unitamente alla maggiore diffusione della luce durante l'imaging confocale produce bassa risoluzione del segnale e di conseguenza, compromettere l'individuazione di segnalazione di calcio o la produzione di NO. Il fattore limitante di sonde fluorescenti di carico nelle cellule vascolari in concentrazioni sufficienti per fare misurazioni significative può essere risolto utilizzando un ex vivo la preparazione, un microscopio a due fotoni, e l'applicazione di una nuova classe di ionofori, come Asante Rosso, che emette fluorescenza a lungo lunghezze d'onda, dove c'è meno interferenza dalla auto-fluorescenza del tessuto connettivo e fibre. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo metodo è che è difficile combinare due o più coloranti durante l'imaging. Gli spettri di eccitazione per la maggior parte dei coloranti disponibili per l'imaging due fotoni hanno ampie, caratteristiche di distribuzione polimodali, che rendono difficile per la misurazione due ionofori diversi contemporaneamente. Tuttavia, i rivelatori ibridi a basso rumore potrebbero essere utilizzati per ridurre le spettri di emissione rilevati ipotizzando che le ionofori emettono luce a diverse lunghezze d'onda. Ad esempio, in questa procedura descritta non è possibile misurare sia la produzione di NO e Ca 2+ variazioni di concentrazione perché gli spettri di emissione si sovrappongono.

Cellule endoteliali vascolari che sono in contatto diretto con il flusso di sangue sono esposti a sollecitazione di taglio fluido e regolano l'omeostasi vascolare. 9 L'attuale metodo può essere applicato anche per monitorare transienti di calcio indotto dal flusso e la produzione di NO in cellule endoteliali ex vivo. Inoltre, questo metodo può essere applicato con successo allo studio Ca 2+ concentrazionecambiamenti zione nelle cellule muscolari lisce delle piccole arterie resistenza estratte dal rene. In questo caso, le piccole arterie di resistenza sezionato devono essere incubate a Ca 2 + -free soluzione per evitare danni alle cellule muscolari lisce a causa di Ca 2+ sovraccarico. Questa modifica può essere applicato anche per l'aorta per ridurre la morte cellulare.

Prospettive. Imaging basato sulla fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per studiare fisiologia cellulare in vitro; tuttavia, modelli cellulari isolate non sempre ricapitolano processi fisiologici che si verificano quando le cellule sono nel loro ambiente nativo. Questo ha limitato l'applicabilità di linee cellulari per la ricerca traslazionale. 10 Come descritto qui, l'uso di preparazioni ex vivo ci ha dato la possibilità di monitorare il comportamento cellulare nel tessuto appena isolato dove tutti i processi fisiologici locali e l'interazione con altri tipi di cellule si verificano ancora . Con il crescente numero di engin geneticatecnologie eering disponibili e lo sviluppo di modelli che ricapitolano malattie umane, ex vivo i preparativi saranno uno strumento utile per la ricerca traslazionale. Per gli studi qui descritti, è stato utilizzato il Dahl sale-sensibili (SS / JrHsdMcwi) ceppo ipertesi ratti. Il ratto SS è un modello genetico innato naturale di ipertensione sale-sensibile che riassume molti aspetti di ipertensione umana progressivo. Questo modello è utilizzato ampiamente e ha fornito conoscenze fondamentali nei meccanismi alla base di sale-sensibilità e disfunzione vascolare. 11-13 Con questo modello di ratto, i ricercatori sono stati in grado di testare il contributo dei meccanismi chiave per malattie complesse (come ipertensione) utilizzando ZFNs , / basati su Cas tecnologie gene editing Talens e CRISPR. 6,14-17 Utilizzando la procedura sperimentale descritta qui con queste risorse gene editing, è ora possibile iniziare a testare il contributo di calcio e di altri fattori chiave per il sale -sensitiveipertensione e disfunzione vascolare in molti modelli animali differenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. William Cashdollar, e la Northwestern Mutual Foundation Imaging Center presso il Sangue Istituto di ricerca del Wisconsin per un aiuto con gli studi di imaging. Ringraziamo anche il dottor Daria Ilatovskaya per la lettura critica di questo manoscritto e utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL108880 (a AS) e DP2-OD008396 (per AMG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAF-FM Life Technologies D-23842
Fluo-4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution Sigma-Aldrich P5556
L-NAME Tocris 0665
Olympus upright microscope Olympus Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL  Spectra Physics Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters Olympus FV10-MRL/R  495 to 540 nm 
25× water-immersion objective lens Olympus XLPL25XWMP N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid  Warner Instrument  SHD-27LH
Other basic reagents  Sigma-Aldrich

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References

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Biologia Cellulare Numero 100 la microscopia a due fotoni fluorescenza vasi calcio intracellulare Fluo-04:00 l'ossido di azoto DAF-FM aorta ratto
A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta
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Endres, B. T., Staruschenko, A.,More

Endres, B. T., Staruschenko, A., Schulte, M., Geurts, A. M., Palygin, O. Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta. J. Vis. Exp. (100), e52734, doi:10.3791/52734 (2015).

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