Abstract
カルシウムは、血管組織の多くの生理学的プロセスの非常に重要な調節因子です。ほとんどの内皮および平滑筋の機能は非常に細胞内カルシウム（[Ca 2+] i） の一酸化窒素（NO）の変化に依存します。の[Ca 2+] i の 、NOおよび下流分子は血管収縮薬および血管拡張薬に反応して血管によってどのように処理されるかを理解するために、我々はカルシウム標識（またはNO標識）を適用する新規な技術を開発した2光子顕微鏡を有する色素単離された血管におけるカルシウム処理（またはNO産生）を測定しました。ここで説明した内皮細胞または平滑筋細胞内にラット、ラベルカルシウムまたはNOから大動脈を分離する方法を示す詳細なステップバイステップの手順であり、画像のカルシウムトランジェント（またはNO産生）生理次の2光子顕微鏡を用いて、または薬理学的刺激。この方法を使用する利点は、複数倍である：1）それは、同時にすることが可能ですLY異なる刺激に応答して、両方の内皮細胞および平滑筋細胞におけるカルシウムトランジェントを測定します。 2）それは、画像の内皮細胞とそれらの天然の環境における平滑筋細胞のいずれかを可能にします。 3）この方法は、細胞内カルシウムまたはNO変化に非常に敏感であり、正確な測定のための高解像度の画像を生成します。 4）記載の手法は、活性酸素種のような他の分子の測定に適用することができます。要するに、2光子レーザ発光顕微鏡の応用カルシウムトランジェントを監視し、単離された血管の内皮細胞および平滑筋細胞におけるNO産生は、高品質の定量的データを提供しておらず、血管機能を調節するメカニズムの理解を推進してきました。
Introduction
カルシウムは、内皮細胞および平滑筋細胞などの血管細胞内の基本的なセカンドメッセンジャーです。これは、血管収縮のための主要な刺激であり、内皮内のNO発生を介してその効果を含め、血管拡張において重要な役割を果たしています。これにより、撮像技術の制限のために、それは、無傷の血管内カルシウム処理を観察することは事実上不可能でした。 2光子イメージングシステムと新しいカルシウムの作成またはNO標識色素の開発は、カルシウム動態及び血管系内のNO産生を理解し始めるために十分な深さと解像度でイメージすることができます。
二光子顕微鏡は、最近ので、深く低いバックグラウンド蛍光と高い信号感度で組織に浸透するその優れた能力の組織、器官、さらには全体の動物試験に適用されている。1,2イルミネータで2光子励起の狭いスペクトルイオン焦点と非デスキャン検出器の使用は、2光子顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡よりも優れている理由です。共焦点顕微鏡は、自動蛍光および共焦点ピンホールへのピンボケ光の散乱に起因する必要な組織深さで高品質の画像を生成することはできません。したがって、我々は、[Ca 2+] i のシグナルを測定するために2つの光子顕微鏡を使用する方法と、高解像度、低信号対雑音比を有する無傷の、個々の血管細胞におけるNO産生を開発しました。
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Protocol
以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に応じてありました。
ラット大動脈の1の単離
- イソフルラン（5％誘導、1.5から2.5パーセントのメンテナンス）または別のIACUC承認の方法でラットを麻酔。
- 仰臥位でラットを配置します。腹部の臓器を露出させるために、皮膚と皮下組織を通って腹部の小さな腹側正中切開を行います。ガーゼパッドを使用して、穏やかに、図1に示すように、大動脈と大静脈を露出するために腸を偏向させます。
- 簡単に言えば、結合組織からと大静脈から大動脈を解剖鈍いです。縫合糸を使用して、腎臓にできるだけ近い大動脈を縛ります。大動脈2センチ、15ミリリットルの円錐TUに配置 - 約1を分析氷の上で：;（140のNaCl、1.2のMgCl 2、2のCaCl 2、4.5のKCl、6グルコース、10 mMのHEPESでPSS）は、通常の生理食塩液を含むこと。
- 大動脈が分離されると、承認されたIACUCプロトコルに従って動物を安楽死させます。すべての非生存手続きの完了時に動物の人道的な終焉を確実にするために開胸誘導気胸により深く麻酔をかけた動物を安楽死させる。3
- 解剖顕微鏡を使用して、先の細いピンセット、およびmicroscissorsは大動脈のオフ脂肪および結合組織を解剖。大動脈がきれいになったら、縦に大動脈を切断し、後で氷上PSSに配置します。
2.色素添加およびインキュベーション
- アルミ箔で覆われている個々の500μlのチューブに、DMSOベースのソリューションで提供されている1 mMののFluo-4 AM色素のピペット7μlの。時間をかけて、色素の性質を維持するために-20℃の冷凍庫に保管してください。注：これらは非常に分注しlutionsは、少なくとも6ヶ月間安定であるべきです。
- 使用前に、色素溶液を開く前に、室温まで昇温することができます。使用直前に作業溶液を調製します。後で使用するために希釈された試薬を保管しないでください。
- 何のカルシウムを含有しないPSSの450 ULにDMSO溶液に溶解した既製の1mMのFluo-4 AM色素の7μlを添加します。アセトキシメチル（AM）エステルを分散させる助け、カルシウム色素の負荷を改善するために、ローディングカクテルに非DMSOベースの10％プルロニック酸溶液40μlを追加します。
- 1時間（2.3で説明したように）、ローディングカクテルを含む500μlのチューブに解剖した大動脈を置きます。 RTで回転シェーカー上箔と場所ですべてのチューブをカバーしています。
- 血管系におけるNO産生を監視しない場合は、DAF-FMジアセテート染料を使用しています。 450μlのPSS、40μlのプルロニック酸および10mM DAF-FMジアセテートの5μLを含有する溶液中に大動脈をインキュベートします。 （2.3で説明）のカルシウムのインキュベーションプロトコルと同様に、大動脈を配置室温で次の30分間、続いて4℃で30分間回転シェーカー上に箔と場所でカバーNO染料溶液を含む500μlのチューブです。
- NO産生が測定されていない場合、 図4（b）に示すように、対照としてNO産生を遮断しないように、内皮のNO合成酵素阻害薬、L-NAMEを使用します。その手順については、（室温で）インキュベーションの最後の30分間（2.5で説明したように）カクテル100 nmのL-NAMEに追加します。
3.レーザー走査2光子顕微鏡のプロトコル
- 細胞外色素を除去し、クリーンPSSで3回 - 1時間のインキュベーションの後、大動脈2を洗います。
- 通常のPSSまたはCa 2+を含まない緩衝液（実験プロトコルに依存します）のいずれかを含むシリコーン被覆皿に大動脈を転送します。ピンダウンμ状のピンを使用してシリコーン（皿開口部に露出され、すなわち、内皮ルーメン）と接触している外膜を有するシリコーンコーティング上に大動脈。あるいは、スライスアンカーを使用グリッドまたは接着剤は、組織を固定します。
注：ストレスと可能な機械的なアーティファクト、伝達を低減およびCa 2+フリーソリューションを大動脈を修正し、5待つに-実験開始の10分前。 - 薬物の自動または手動のアプリケーションのために、または細胞外溶液を変更するためのシリコーン被覆プレートに蠕動ポンプまたはシリンジを接続します。
- 直立二光子顕微鏡のノーズピースの下に皿を置き、試料の上に25×（NA 1.05と作動距離2mm）を水浸対物レンズを取り付け、位置決めします。注：この特定のレンズが使用できない場合は、通常の目的と比較して飛躍的に信号の解像度を向上させることができるので、特に2光子イメージングのために製造され対物レンズを使用しています。
- ソフトウェアを使用して、2つの光子レーザーをアクティブにします（レーザーは、ポンプとオンし始めます）。チューニング820 nmのレーザー励起。
- エピ蛍光を用いて、大動脈を探し、上の目的を集中粗調整を使用して、内皮表面。
- 励起レーザは、モードロックされ、非デスキャン検出器が係合されると予想される発光スペクトルに適切な放射フィルタがインストールされていることを確認して、2光子レーザ走査顕微鏡モードに切り替えます。注：ここでは、FV10-MRL / R（540 nmの495）を使用しました。
- 約5％のレーザー出力を使用して、生のスキャンを開始し、微細血管内皮細胞を可視化するために、目的の焦点を合わせます。
注：通常のPSSでインキュベートしたときに内皮細胞は強い蛍光シグナルを示すであろう。容器はカルシウムを含まない緩衝液中でインキュベートされたとき、これは著しく弱くなります。内皮細胞は、開いた大動脈の上に存在し、平滑筋細胞は、単に内皮細胞（ 図2参照 ）の下に見られます。血管はいずれも平滑であってもあるので、平滑筋細胞および内皮細胞の両方が存在している場所があります。</ LI> - セルがフォーカスに入ると、顕微鏡ソフトウェアプログラムは、高速スキャンモードで連続画像（ラスタースキャン、1.1秒のフレームコレクションの頻度で512×512ピクセルのウィンドウ）を収集します。フルオ4 AM蛍光と並行して、血管収縮の変化を検出し、より良い実験条件を可視化するために光画像を送信し収集します。
- ベースライン信号画像のコレクションの後、外液中のCa 2+イオン濃度を変更したり、ゆっくりと撮影しながら蠕動ポンプを使用して、薬理学的な刺激剤を適用します。負荷細胞内の蛍光シグナルの増加を観察します。
注：内皮細胞は、フローの変化にこのようにして、それがのCa 2+またはNOシグナル伝達の薬理学的活性剤を塗布する前に、低い層アプリケーションや車両試験を使用することをお勧めし応答します。のFluo-4（のFluo-4 Iの解離定数がロードされた血管内nMの濃度値を、細胞内カルシウムを再計算しますS 345 nM）を、蛍光強度は、ベースライン時およびイオノマイシンとのMnCl 2を添加した後に記録することができた。4
4.画像処理と計算
- フィジーの画像処理パッケージをダウンロードし、インストールします。
- フィジーの画像ファイルを開きます。プロンプトが表示されたら、ファイルをインポートすると、チャンネル（透過光と蛍光信号）を分割します。データ分析のための唯一の蛍光シグナルを使用してください。
- フィジープログラム内で、分析タブをクリックし、[ツール]オプションまでスクロールダウンします。ツールのオプションでは、ROIのマネージャーを言うタブを見つけ、それをクリックしてください。新しいウィンドウが表示されます。
- この後、分析]タブで設定された測定値をクリックしてください。関心のある特定の測定値を選択します。カルシウムトランジェント測定では、平均グレー値のオプションを使用します。
- 円形トレースツールでは、関心領域（ROI）を追跡し、すべてのRのためのROIマネージャ画面で「追加」をクリックして始めますOI。一度興味のあるすべてのセルは、「より」タブの下にマルチメジャーを選択し、ROIマネージャウィンドウで、トレースされています。スプレッドシートにこれらの測定の全てを直接測定値を保存するか、コピー＆ペーストするかを覚えておいてください。
- フィジーから* .txtファイルやExcelスプレッドシートを開き、新しい原点ワークシートに番号を転送します。注：または、さらなる分析のためにシグマプロットやプリズムのようなプログラムを使用します。
- オリジンプログラム内では、すべての過渡応答の概要を観察するためにプロット→線+シンボルメニューを使用します。応答しない細胞の選択を解除します。
- 時間スケール（X軸）へのトレース数を再計算し、列→列値の設定を使用し、（我々の場合1.1sで）画像収集頻度へのトレース番号の列を掛けます。
- 平均（Y軸）および標準エラーのトレースを計算するために選択したすべての記録のための行の解析→統計を使用してください。細胞プロット→線+シンボルの現在のグループのための最終的なグラフをプロットします。
- MEA以下のようにn個のカルシウム過渡計算が記載されています。
- オリジンプログラム内の総カルシウム放出のために、グラフをクリックして、次に統合→メニュー分析→微積分を使用しています。曲線下面積の全積分は、結果ログに表示されます。
- 一過性の動態については、グラフ上でクリックし、メニューを使用します。分析→非線形曲線フィット→[データセット（最大値から過渡応答の最後の範囲でX軸を選択します）。完了→指数関数的減衰1→関数選択→フィッティングを開始します。
注：指数フィッティングがグラフウィンドウに表示され、ログイン結果。得られたデータ（値）をリリースし、カルシウムの総量を表し、チャンネルの動力学は、過渡応答を媒介しました。
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Representative Results
正確に血管の生理学（血管拡張および血管収縮）のカルシウムの寄与を評価するために、プロトコルは、単離された無傷の大動脈の両方の内皮細胞および平滑筋細胞にカルシウム色素をロードするように設計されました。 図1に示されている設定の一般的な実験では、単離およびイメージングの前に容器の製造のための基本戦略を示しています。簡単に言うと、ラットから大動脈を単離した後、それは脂肪および結合組織を除去する必要があり、縦方向にスリット。開かれた大動脈は、プロトコルに記載されており、光に揺らしながら室温で1時間インキュベートしたような従来準備ローディングカクテルを含む箔で覆われた500μlのチューブに配置する必要があります。インキュベーション後、大動脈を上向きにシリコーン及びルーメン最寄りの外膜とシリコンで覆われたプレート上に釘付け、洗浄する必要がありますし、イメージングのための直立2光子顕微鏡に移しました。
ONCE大動脈を顕微鏡上に置かれており、容器にフォーカスがある、内皮細胞は、それらの強い蛍光発光（ 図2A）で見つけることが容易であるべきです。内皮細胞はまた、容器が釘付けにされたときに、主に内皮細胞からなる血管の内腔が、上向きにする必要があるため、焦点に来て最初のオブジェクトになります。内皮細胞を画像化することに加えて、平滑筋細胞（ 図2B）表示されている箇所があります。したがって、内皮細胞および平滑筋細胞の両方が同一の撮像視野（ 図2C）内で識別することができました。同じ撮像視野内の画像の両方の血管の細胞型への能力を持つことは、これらの細胞は共同で、まだ独立して、異なるアゴニストおよび刺激に応答する方法のより良い理解につながることができます。
この方法の有用性を実証するために、大動脈細胞の測定は、添加に応答しますcetylcholine（アセチルコリン）、特に内皮細胞内変化を引き起こす強力な血管拡張剤は、決定されました。 図3Aに示すように、通常のPSSでインキュベートしながら、内皮細胞は、容易に見ることができます。アセチルコリン（ 図3B）を加えた後、内皮細胞の蛍光増加は、細胞内のカルシウム含有量も増加していることを示します。関心領域、または内皮細胞から放出された蛍光の定量化は、 図3Cに示されています。 AChの添加後、細胞内のカルシウムの含有量が増加し、急速に、その後徐々に戻ってベースラインに戻ります。アセチルコリンに応答する血管内皮細胞内のカルシウムの増加は、以前の報告と一致している。5,6
カルシウムの研究と同様に、このプロトコルは、NO産生を内皮ないの検出に適しています。に示すように、これらの実験のために、大動脈内皮細胞は、DAF-FMジアセテート色素を負荷しました図4A。このアプローチは、最近、アセチルコリンの刺激に応答したCa 2+依存性様式でNO産生が増加する。6重要なことに、L-NAME、内皮NOシンターゼ阻害剤で処理した後、この応答は、（ 図4B）ブロックされたことを実証するために利用されました。
この技術は、細胞内カルシウムを測定するために適用する方法の別の代表的な例としては、カルシウムを含有する溶液を、カルシウムを含まない緩衝液中でインキュベートした容器に添加したビデオ1に示されています。大動脈は、最初に（ビデオの開始時）、カルシウムフリー緩衝液中でインキュベートされると、内皮細胞は、細胞内カルシウムの低レベルを示す弱い蛍光性です。しかし、通常のPSSの添加後、細胞はすぐに増加した[Ca 2+] i の濃度および高強度の蛍光を発することによって応答します。この実験は、細胞が生きていることを示しており、外部からの刺激に応答します。この実験はまた、高品質のデータをその収率で、この方法の実行可能性を検証します。
図1.大動脈の単離と実験のセットアップ。1）ラットを麻酔した後、腹部の切開を行い、結合組織および大静脈から大動脈を隔離します。 2）大動脈の抽出に続いて、脂肪および結合組織の血管をきれいにし、縦方向に切断することにより、容器を開きます。 3）わずかに揺らしながら室温で1時間のFluo-4 AM染料で容器をインキュベートします。 4）インキュベーション後、大動脈を洗う上に向けルーメン、シリコーン被覆プレート上にそれを固定し、直立二光子顕微鏡のステージに転送します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2画像平滑筋および内皮細胞は、カルシウム色素の十分なローディング後、画像平滑筋細胞および内皮細胞の両方が可能です。 （A）トップは、単離されたラット大動脈における内皮細胞のフルオ4蛍光の一例です。底部は、蛍光画像は、（同様にBとCの場合）透過光のビューにマージされます。 （B）は 、単離されたラット大動脈における平滑筋細胞の蛍光のFluo 4の例です。による大動脈の不均一な厚さ（C）が 、それは、平滑筋細胞および内皮細胞の両方が存在する画像領域に対しても可能です。スケールバーが表示されます。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。
アセチルコリンに応答して内皮細胞におけるカルシウムトランジェントの測定図3（A）、大動脈は、最初のベースライン記録のための通常のPSS緩衝液中で調製し、インキュベートしました。アセチルコリン（AChの）、細胞内のカルシウムレベルの増加を示す強化内皮細胞（ROIを）によって放出される蛍光シグナルを加えた後（B）。スケールバーが示されています。 （C）のAchに応答した内皮細胞のカルシウムトランジェントがOriginソフトウェアを用いて計算した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
カルシウムConcentratioの変化に内皮細胞の応答性のビデオ1例N。のFluo-4 AM染料で調製およびインキュベーション後、大動脈は、カルシウムを含まない緩衝液で洗浄し、2光子顕微鏡のステージ上に配置されました。容器は、カルシウムを含まない緩衝液中に置かれると、内皮細胞のほとんどが弱い蛍光性です。通常のPSSの添加後、内皮細胞は、細胞内カルシウム濃度を増加させ、強い蛍光シグナルを発することによって応答します。
isoltatedラット大動脈の内皮細胞におけるNO産生の映像2例。 DAF-FMジアセテート染料で調製およびインキュベーションの後、大動脈を2光子顕微鏡のステージ上に配置しました。浴溶液中のAChの添加に続いて、内皮細胞は、細胞内のNを増加させることによって応答しますOの生産と強い蛍光シグナルを発します。このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
実験の概要。より良い血管生理学にカルシウムの寄与を理解し、NOに、新規な方法を測定するために開発されたの[Ca 2+] iと内の平滑筋および単離された無傷の大動脈の内皮細胞NO。 1）機械的分離と準備（酵素消化ない）容器の：一緒に、このプロトコルは、これらの重要なステップで構成されています。これは最適な生理学的記録を得ることが可能な限り健康で無傷の組織を維持することが重要です。 2）プルロニック酸とカルシウム標識色素またはNO-標識色素でインキュベーションは重要である、しかし、いくつかの他の船舶の種類、異なるプルロニック酸およびインキュベーション時間をテストする必要があります。グリッドとピンとシリコーンコートディッシュに大動脈の3）適切な固定は、2光子顕微鏡で撮像中に安定したビューを提供します。血管が収縮と拡張されますので、容器はプロペであることを確認することが重要ですRLY発生する可能性のある運動アーチファクトを回避するために皿に固定されました。結果の4）定量。過渡振幅が常に細胞の生理学的特性を比較するための最良のパラメータでない場合がありますのでご了承ください。一過性の積分が原因で、合計の[Ca 2+] iまたは NO放出に優れて違いを示すことができます。
実験が正しく行われている場合には、 図3および4とビデオ1および2に示されるように、刺激に応答した[Ca 2+] i の （またはNOレベル）が変化する。 エクスビボ製剤の組み合わせを監視することが可能であり、かつ2光子イメージングの使用は、より良好な信号解像度及び血管組織における細胞内プロセスの正確な測定を提供することができます。ここでは、これらの技術は、古典的な非レシオメトリックのCa 2+とNO指標（フルオ4 AMとDAF-FMジアセテート、それぞれ）、にと組み合わせて適用しました。カルシウム過渡応答および単離された全大動脈の個々の細胞におけるNO産生を測定。私たちは、この技術はの[Ca 2+] iと異なる血管細胞型内のNOレベルを調節するメカニズムについての我々の知識を転送するのに役立つと考えています。
修正とトラブルシューティング 。敏感なイオノフォアを持つ単一の平滑筋細胞中のCa 2+シグナル伝達を測定する基本的な原理は、最初は1985年に発表された7レーザー走査型共焦点顕微鏡と孤立を採用しているのCaを、個々の血管細胞における2+レベルを画像化するための最近の方法のほとんどまたは培養の準備。血管のような動的な組織のためには、顕微鏡ベースの技術を用いて、カルシウムまたはインビボで NOのレベルを測定することは困難である。2ここでの主な制限は、循環の動脈側でほぼすべての血管の間にある内弾性板を有することですendotヘリウムおよび平滑筋細胞の最内層。8また、平滑筋および外膜層との間の細胞外物質の大部分がコラーゲンである。8エラスチンとコラーゲンは、高強度の自家蛍光と励起波長の広い範囲の主要な源であります。共焦点イメージングの間に増加する光散乱と結合された強力なバックグラウンドの蛍光が低信号の解像度やカルシウムシグナリングまたはNO産生のため、減少の検出を生成します。意味のある測定を行うのに十分な濃度で血管細胞にロードする蛍光プローブの制限要因は、長いで蛍光を発するアサンテレッドなどイオノフォアの新しいクラスをエクスビボで調製、2光子顕微鏡を用いて、適用することによって解決することができ結合組織および繊維の自己蛍光からの干渉が少ないが存在する波長。しかしながら、この方法の主な制限の一つは、それがDIFであることですイメージング中に2つ以上の色素を結合するficult。 2光子イメージングのために使用可能な染料の大部分の励起スペクトルは、同時に2つの異なるイオノフォアを測定することが困難に広い、多モード分布特性を有しています。しかしながら、低ノイズ検出器は、ハイブリッドイオノフォアは、異なる波長の光を放射すると仮定すると検出発光スペクトルを狭くするために使用することができます。例えば、この記載された手順では、発光スペクトルが重複するので、NOの産生およびCa 2+濃度の変化の両方を測定しないことは不可能です。
血流に直接接触している血管内皮細胞は、流体せん断応力にさらされ、血管の恒常性を調節する。9現在の方法は、流動誘起カルシウムトランジェントおよび内皮細胞のエクスビボでのNO産生をモニターするために適用することができるされています。さらに、この方法は成功したCa 2+ concentraを研究に適用することができ腎臓から抽出された小さな抵抗動脈の平滑筋細胞におけるション変化。この場合、解剖小さな抵抗動脈が原因のCa 2+過負荷に平滑筋細胞の損傷を避けるために、のCa 2+を含まない溶液中でインキュベートされるべきです。この修飾は、細胞死を減少させるために大動脈に適用することができます。
展望 。蛍光ベースのイメージングが広く、インビトロで細胞生理学を研究するために使用されてきました。しかし、単離された細胞モデルは、常に細胞がその本来の環境にある場合に発生する生理的プロセスを再現しません。これは、トランスレーショナルリサーチへの細胞株の適用性を制限している。10ここで説明したように、ex vivoでの製剤の使用は私達に他の細胞型ですべてのローカル生理的プロセスとの相互作用が依然として発生している、新たに単離された組織内の細胞の挙動を監視する機会を与えています。遺伝ENGINの増加と利用可能とヒト疾患を再現モデルの開発eering技術は、ex vivoでの製剤は、トランスレーショナルリサーチのために有用なツールとなります。ここで説明する研究のために、ダール食塩感受性（SS / JrHsdMcwi）高血圧ラット株を用いました。 SSラットはプログレッシブヒト高血圧の多くの側面を再現する食塩感受性高血圧の天然に存在する近交系の遺伝的モデルです。このモデルは、広く使用されており、塩感受性と血管機能不全のメカニズムに重要な洞察を提供してきました。このラットモデルでは11〜13、研究者はのZFNを使用して（高 血圧症のような）複雑な疾患に重要なメカニズムの寄与をテストすることができました、TALENs、およびCRISPR / CASに基づく遺伝子編集技術。6,14-17これらの遺伝子編集リソースと共にここに記載の実験手順を使用して、それが塩にカルシウムやその他の重要な要因の寄与のテストを開始することが可能になりました敏感な高血圧、多くの異なる動物モデルにおける血管機能不全。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、イメージング研究のヘルプは博士ウィリアムCashdollar、およびウィスコンシン州の血液研究所のノースウェスタン·ミューチュアル財団イメージングセンターに感謝します。また、この原稿で、有用な議論の重要な読書のための博士ダリアIlatovskayaに感謝します。本研究は、（AS）に健康補助金HL108880と（AMG）はDP2-OD008396の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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