Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52734

Abstract

Кальций очень важный регулятор многих физиологических процессов в тканях сосудов. Большинство эндотелиальных и гладкомышечных функции сильно зависят от изменений внутриклеточного кальция ([Ca2 +] I) и оксида азота (NO). Для того, чтобы понять, как [Ca 2+] я, нет и вниз по течению молекулы обрабатываются кровеносного сосуда в ответ на сосудосуживающих и сосудорасширяющих, мы разработали новый метод, который применяется кальций-маркировку (или NO-маркировку) красители с двумя фотонов микроскопии для измерения обработку кальция (или NO) производства в отдельных кровеносных сосудов. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедура, которая демонстрирует, как изолировать аорты от крыс, этикетки кальция или НЕТ в эндотелиальных или гладкомышечных клеток, и изображение кальция переходные (или НЕТ производство), используя два фотона микроскоп следующие физиологические или фармакологические раздражители. Преимущества использования метода являются несколько раз: 1) это возможно одновременноелы измерения переходных кальция в обоих эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток в ответ на различные стимулы; 2) позволяет изображения эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в их родной обстановке; 3) этот метод очень чувствителен к внутриклеточного кальция или без изменений и генерирует изображения высокого разрешения для точных измерений; и 4) Описанный подход может быть применен к измерению другими молекулами, такими как активными формами кислорода. В целом, применение двух фотонов микроскопии лазерного излучения для контроля переходных кальция и не производство в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированного кровеносного сосуда предоставил высококачественные и количественные данные способствовало наше понимание механизмов, регулирующих функции сосудов.

Introduction

Кальций является основным вторичным посредником в сосудистых клетках, таких как эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Это основной стимул для сокращения сосудов и играет важную роль в расширении сосудов, в том числе его последствий через NO поколения в эндотелия. Из-за ограничений технологии формирования, это было практически невозможно наблюдать обработку кальция в неповрежденной судна. Развитие двух систем визуализации фотонов и создания новой кальция или Нет маркировки красителей, делает возможным изображение на достаточной глубине и разрешения, чтобы начать понимать динамику кальция и не производство внутри сосудов.

Два фотона микроскопии недавно были применены в ткани, органы и даже целые исследования на животных из-за его превосходной способностью глубоко проникать в ткани с низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью сигнала. 1,2 узкий спектр возбуждения двух фотонов в Подсветкаионная фокусом и использование не-descanned детекторов причины, почему два фотона микроскопии превосходит традиционные конфокальной микроскопии. Конфокальной микроскопии не может производить высококачественные изображения на необходимую глубину тканей вследствие авто-флуоресценции и рассеяния из фокуса света в конфокальной обскуры. Следовательно, мы разработали метод, используя два фотона микроскоп для измерения [Ca 2+] я сигнализации и нет производства в неповрежденных, отдельных клеток кровеносных сосудов с высоким разрешением и низким коэффициентом сигнал-шум.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные методики, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Медицинском колледже штата Висконсин в и были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Выделение аорты крыс

  1. Обезболить крыс с ИФ (5% индукции, от 1,5 до 2,5%) технического обслуживания или другой метод IACUC одобрен.
  2. Поместите крысу в положении лежа на спине. Для того, чтобы разоблачить брюшной полости, сделать небольшой вентральный срединный разрез через кожу и подкожную ткань живота. Использование марлевые подушечки аккуратно отвлечь кишечник, чтобы разоблачить аорты и полой вены, как показано на рисунке 1.
  3. Вкратце, тупым рассекать аорты от соединительной ткани и от полой вены. Использование шов, галстук аорты как можно ближе к почке. Проанализируйте около 1 - 2 см аорты и поместить его в 15 мл конической втбыть, содержащий нормальный физиологический раствор соли (PSS, в мм: 140 NaCl, MgCl 2 1.2, 2 CaCl 2, 4,5 KCl, 6 глюкозы, 10 HEPES) на льду.
  4. После того, как аорта изолированы, усыпить животное в соответствии с утвержденными протоколами IACUC. По завершении всех не-выживания процедуры эвтаназии глубоко анестезировали животных от торакотомии, вызывающего пневмоторакс, чтобы обеспечить гуманное кончину животного. 3
  5. Использование рассечение микроскоп, остроконечный пинцет, и microscissors рассекают жира и соединительной ткани от аорты. После того, как аорта чистый, разрезать продольно аорты и поместить его в PSS на льду на потом.

2. Краска Загрузка и инкубация

  1. Пипеткой 7 мкл 1 мМ Fluo-4 утра красителя, который поставляется в ДМСО основе решения, в отдельных 500 мкл труб, которые были покрыты алюминиевой фольгой. Хранить в морозильнике при температуре -20 ° С, чтобы сохранить свойства красителей с течением времени. Примечание: эти аликвоты такlutions должно быть стабильным в течение по крайней мере шести месяцев.
  2. Перед использованием, позволяют решения красителя, чтобы согреться до комнатной температуры перед открытием. Подготовьте рабочие растворы непосредственно перед использованием. Не храните разведенный реагент для последующего использования.
  3. Добавить 7 мкл готового 1 мМ Fluo-4 утра красителя, растворенного в растворе ДМСО до 450 мкл PSS, не содержащем кальция. Добавить 40 мкл ДМСО несоблюдения на основе 10% -ного раствора Pluronic кислоты в загрузочном коктейль, чтобы помочь рассеять ацетоксиметиловые (AM) эфиры и улучшить загрузку красителя кальция.
  4. Поместите расчлененный аорты в 500 мкл пробирки, содержащие загрузки коктейль (как описано в разделе 2.3) в течение 1 ч. Обложка все трубы с фольгой и поместите на вращающуюся шейкере при комнатной температуре.
  5. Чтобы контролировать NO производства в сосудистой, используйте DAF-FM диацетат краситель. Инкубируйте аорты в растворе, содержащем 450 мкл PSS 40 мкл Pluronic кислоты и 5 мкл 10 мМ DAF-FM диацетата. Подобно протоколу инкубации кальция (описано в 2.3), поместите аортыв 500 мкл раствора, содержащего трубку не-красителя, покрытый фольгой и поместите на вращающуюся шейкере в течение 30 мин при 4 ° С с последующим следующих 30 мин при комнатной температуре.
  6. При отсутствии производства не измеряется, не использовать эндотелиального NO-синтазы блокатор, L-NAME, не блокировать NO производства в качестве контроля, как показано на рисунке 4В. Для этой процедуры, добавить в коктейль (как описано в 2.5) 100 нМ L-NAME в течение последних 30 мин инкубации (при комнатной температуре).

3. Лазерное сканирование двух фотонов Протокол микроскопия

  1. После 1 ч инкубации, мыть аорты 2 - 3 раза в чистой PSS для удаления внеклеточного краситель.
  2. Перевести аорты в силиконовым покрытием блюдо, содержащей либо нормальный PSS или Ca 2+ -free буфер (зависит от экспериментального протокола). Pin аорту вниз на силиконовым покрытием с адвентиции в контакте с силиконом (т.е., эндотелиальные просвета подверженных отверстие блюдо) с использованием μ-образный булавки. Кроме того, используйте Slice ЯкорьСетка или клей, чтобы зафиксировать ткань.
    Примечание: Для того, чтобы уменьшить стресс и возможные механические артефакты, передача и исправить аорты в Са 2+ -бесплатно решение и ждать 5 - 10 минут до начала эксперимента.
  3. Подключите перистальтического насоса или шприца в силиконовым покрытием пластины для автоматического или ручного применения препаратов или изменения внеклеточного раствора.
  4. Поместите блюдо под нос кусок вертикальном два фотона микроскопом, и установить и расположить 25 × (Н.А. 1,05 и рабочее расстояние 2 мм) воды погружение объектив над образцом. Примечание: Если этот конкретный объектив не доступны, используйте цель специально изготовленного для двух фотонов изображений, потому что это может увеличить разрешение сигнала драматически сравнению с обычной цели.
  5. Активируйте двух фотонов лазера с помощью программного обеспечения (лазер начинает качать и включите). Настройтесь лазерного возбуждения до 820 нм.
  6. Использование эпифлуоресцентной, найдите аорты и сосредоточиться на целиповерхности эндотелиальных помощью грубой регулировки.
  7. Включите микроскоп в два фотона режиме лазерного сканирования, гарантируя, что лазер возбуждения режим заблокирован, не-descanned детекторы занимаются и выбросов фильтры, подходящие для спектров излучения ожидаемого установлены. Примечание: Здесь были использованы FV10-MRL / R (495 540 нм).
  8. Начало живой сканирование с использованием примерно 5% мощности лазера и точной фокусировки цели для визуализации эндотелиальные клетки.
    Примечание: эндотелиальные клетки будут демонстрировать сильный флуоресцентный сигнал при инкубации в обычном PSS. Это будет заметно слабее, когда сосуды инкубировали в бескальциевой буфера. Эндотелиальные клетки будут присутствовать в верхней части открытой аорты и гладкомышечные клетки можно увидеть чуть ниже эндотелиальных клеток (рисунок 2). Поскольку кровеносные сосуды ни гладкой, ни даже, будет места, где оба клетки гладкой мышцы и эндотелиальные клетки присутствуют. </ LI>
  9. После того, как клетки находятся в фокусе, программа программное обеспечение микроскоп для сбора последовательных изображений в режиме быстрого сканирования (растрового сканирования, 512 х 512 пикселей окно с частотой кадров сбора 1,1 с). Параллельно с Fluo-4 флуоресценции AM, собирать проходящем свете изображения для того, чтобы обнаружить изменения в сужении сосудов и лучше визуализировать экспериментальные условия.
  10. После сбора исходных изображений сигнала, изменить концентрацию ионов Ca 2+ во внешнем растворе или медленно применяются фармакологические агенты по стимулированию при помощи перистальтического насоса при визуализации. Соблюдайте флуоресцентный увеличение сигнала в загруженных клеток.
    Примечание: эндотелиальные клетки реагируют на изменения расхода, при этом рекомендуется использовать низкие ламинарные приложений и тестирование автомобиля перед применением фармакологических активаторов Ca 2+ или без сигнализации. Для пересчета внутриклеточный кальций в значения концентрации нМ в сосудах, нагруженных Fluo-4 (константы диссоциации для Fluo-4 Iс 345 нМ), интенсивность флуоресценции может быть записан в начале и после того иономицина и MnCl 2. 4

4. Обработка изображений и расчеты

  1. Скачать и установить Фиджи обработки изображений пакет.
  2. Откройте файл изображения на Фиджи. По импортировать файл, разделить каналы (в проходящем свете и флуоресцентные сигналы), когда будет предложено. Используйте только флуоресцентный сигнал для анализа данных.
  3. В рамках программы Фиджи, нажмите на вкладке анализа и прокрутите вниз до опции инструментов. В опции инструментов, найти вкладку, которая говорит менеджер ROI и нажмите на нее; Появится новое окно.
  4. После этого, нажмите на набор измерений на вкладке анализа. Выберите конкретные измерения интереса. Для кальция переходных измерений, используйте опцию среднее значение серого.
  5. С круговой инструмент трассировки, начинают проследить регионы интереса (ROI) и нажмите кнопку "Добавить" на экране менеджера ROI для каждого RО.И.. После того, как все клетки интересом были прослежены в окне менеджера ROI, выберите Мульти Мера под "больше" вкладке. Запомнить либо сохранить измерения непосредственно или скопировать и вставить все эти измерения в таблицу.
  6. Открыть файл * .txt или Excel таблицы с Фиджи и передачи чисел в новый лист происхождения. Примечание: В качестве альтернативы, использовать любую программу, как Sigma участок или Prism для дальнейшего анализа.
  7. В рамках программы происхождения, использовать участок → Строка меню + Symbol наблюдать обзор всех переходных процессов. Отмените выбор негибких клетки.
  8. Пересчитать трассировки число в шкале времени (ось X), используйте столбцов → заданных значений столбцов и умножить столбец частоты сбора изображений Трейс (в нашем случае 1.1s).
  9. Использовать анализ → Статистика по строкам для всех выбранных записей для расчета среднего (ось Y) и стандартный трассировки ошибки. Участок окончательной график для текущей группы клеток Участок → Line + Symbol.
  10. МЭАп кальция переходных расчет описано, как следует.
    1. Для полного высвобождения кальция в рамках программы происхождения, нажмите на график, а затем использовать меню Analysis → исчисление → интеграции. Всего интеграл площади под кривой появляется в результатах Вход.
    2. Для переходных кинетики, нажмите на график, а затем использовать меню: Анализ → Нелинейная Кривая Fit → Выбрать набор данных (выбор оси X в пределах от максимальной до конца переходного ответ). Начните Место → Выберите функцию → экспоненциальное затухание 1 → Готово.
      Примечание: Экспоненциальная Место появляется в Graph окна и Результат журнал. Полученные данные (значения) представляют собой общее количество кальция выпущен, и кинетика каналов опосредуется переходную характеристику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы точно оценить вклад кальция в сосудистой физиологии (вазодилатации и вазоконстрикции), протокол был разработан, чтобы загрузить красители кальция в обоих эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в изолированных неповрежденной аорты. Вообще Экспериментальная установка изображена на рисунке 1, показывает основные стратегии для изоляции и подготовке судна до визуализации. Вкратце, после выделения из аорты крысы с, он должен быть очищен от жира и соединительной ткани и разрезать в продольном направлении. Открыт аорты должны быть помещены в фольге, покрытой 500 мкл пробирку, содержащую предварительно приготовленную загрузки коктейль, как описано в протоколе, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа с легкой качания. После инкубации аорта должна быть вымыта, скована на силиконовой пластины, покрытой с адвентиции ближайшего силикона и просвет вверх, и переносили в вертикальном два фотона микроскопом для визуализации.

Oncе аорта была помещена на микроскопе, и судно находится в фокусе, эндотелиальные клетки должны быть легко найти их сильной флуоресценции (фиг.2А). Эндотелиальные клетки также будет первый объект для фокусировки, так как просвет сосуда, который состоит в основном из эндотелиальных клеток, должна быть обращена вверх, когда судно прижат вниз. В дополнение к томографии эндотелиальные клетки, то будет места, где видны (2В) гладкомышечные клетки. Таким образом, оба эндотелиальных и гладкомышечных клеток могут быть определены в той же области изображения (фиг.2с). Обладающую способностью изображения обоих типов клеток сосудов в той же области изображения может привести к лучшему пониманию того, как эти клетки совместно, но независимо друг от друга, реагировать на различные агонисты и стимулов.

Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, измерения аорты клеток ответная реакция на добавлениеcetylcholine (АЧ), мощным сосудорасширяющим, что конкретно вызывает изменения в эндотелия, была определена. Как показано на фигуре 3А, эндотелиальные клетки можно легко увидеть, а инкубируют в нормальной PSS. После того АХ (фиг.3В), эндотелиальные клетки увеличивается флуоресценции, указывающий, что внутриклеточный содержание кальция также увеличивается. Количественное определение испускаемой флуоресценции от трансформирования или эндотелиальных клеток, как показано на фиг.3С. После того АХ, внутриклеточные увеличивается содержание кальция быстро, а затем медленно возвращается к базовой линии. Увеличение кальция в эндотелиальных клетках в ответ на АХ согласуется с предыдущими сообщениями. 5,6

Подобно исследований кальция, этот протокол является подходящим для обнаружения эндотелиальной производства. Для этих экспериментов, клетки эндотелия аорты были загружены DAF-FM диацетата красителя, как показано на4А. Этот подход был недавно использовали, чтобы показать, что никакого производства увеличивается в Са 2+ -зависимые образом в ответ на АХ стимуляции. 6 Важно отметить, что после обработки L-NAME, эндотелиальной NO синтазы, этот ответ был заблокирован (4В).

Еще один представитель пример того, как этот метод может быть применен для измерения внутриклеточного кальция показано на видео 1, где кальция, содержащий раствор добавляют к сосуду, который инкубировали в кальция свободного буфера. При аорты первоначально инкубировали в кальция свободного буфера (в начале видео), эндотелиальные клетки слабо люминесцентные указывает низкие уровни кальция в клетках. Тем не менее, после того нормальной PSS, клетки немедленно реагировать на повышение [Ca2 +] я и концентрация излучающих высокую интенсивность флуоресценции. Этот эксперимент показывает, что клетки живы иреагировать на внешние раздражители. Этот эксперимент также подтверждает жизнеспособность этого метода с его выходом данных высокого качества.

Фигура 1
Рисунок 1. Аорта Выделение и экспериментальной установки. 1) После анестезии крыс, сделать надрез в брюшной полости и изолировать аорты из соединительной ткани и полой вены. 2) После извлечения аорты, очистить судно жира и соединительной ткани и откройте сосуд, сокращая в продольном направлении. 3) Инкубируют сосуд в AM красителя Fluo-4 в течение 1 часа при комнатной температуре с легким покачиванием. 4) После инкубации, мыть аорты, контактный его на силиконовой покрытием пластины, просвет вверх, и передать его на сцене вертикальном два фотона микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. изображений гладких мышц и эндотелиальных клеток. После достаточного загрузки кальция красителя, можно изображение как гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки. (А) Вверх, является примером Fluo 4 флуоресценции эндотелиальных клеток в изолированной аорте крысы. Нижняя, является флуоресцентное изображение объединилась с проходящем свете зрения (аналогично для В и С). (В), является примером Fluo 4 флуоресценции клеток гладких мышц в изолированной аорте крысы. (С) из-за неравномерной толщины аорты, также возможно, чтобы изображения регионах, где оба гладких мышц и эндотелиальных клеток присутствуют. Масштаб бары показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэтот показатель.

Рисунок 3
Рисунок 3. Измерение переходных процессов кальция в эндотелиальных клеток в ответ на АХ. (А) аорты изначально готовили и инкубировали в обычном буфере PSS для исходных записей. (Б) После того ацетилхолина (ACh), флуоресцентного сигнала, испускаемого эндотелиальных клеток (трансформирования) Повышение указывает повышение уровня кальция в клетках. Масштаб отображается строка. (C) кальция переходные процессы эндотелиальных клеток в ответ на Ach были рассчитаны с использованием программного обеспечения Origin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4Рисунок 4. изображений окиси азота в эндотелиальных клетках. () После загрузки аорты с диацетатной красителя DAF-FM и размещение его на стадии двух фотонов микроскопом, это не возможно, чтобы изображение НЕТ уровнях в эндотелиальных клетках с помощью излучаемого флуоресценции. (Б) После инкубации с эндотелиальной NO-синтазы ингибитор L-NAME, общая флуоресценции снизился в трансформирования, указывая снижение уровня NO в клетках. Масштаб отображается строка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Видео 1
Видео 1. Пример эндотелиальных клеток к реагированию на изменения в кальция Concentratioп. После подготовки и инкубации в Fluo-4 утра красителя, аорту промывают бескальциевой буфера и помещен на сцене два фотона микроскопом. Когда судно находится в бескальциевой буфере, большинство из эндотелиальных клеток слабо люминесцентные. После добавления нормальной PSS, эндотелиальные клетки отвечают на повышение концентрации внутриклеточного кальция и излучающих сильный флуоресцентный сигнал.

Видео 2
Видео 2. Пример NO производства в эндотелиальных клетках аорты крысы isoltated. После получения и инкубации в DAF-FM диацетатной красителя, аорта была помещена на сцене два фотона микроскопом. После добавления к Ach в растворе ванны, эндотелиальные клетки отвечают за счет увеличения внутриклеточного NПроизводство вывода и испуская сильный флуоресцентный сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспериментальная Обзор. Чтобы лучше понять вклад кальция и НЕТ сосудистой физиологии, новый метод был разработан для измерения [Ca 2+] я и НЕТ в гладких мышцах и клетках эндотелия аорты изолированных интактных. Вместе этот протокол состоит из следующих основных шагов: 1) механической изоляции и подготовка (не ферментативное расщепление) судна. Важно, чтобы ткань здоровыми и нетронутыми, насколько это возможно, чтобы получить оптимальные физиологические записи. 2) Инкубация в кальций-маркировки красителем или НЕТ маркировка краситель с плуроника кислоты является критическим, однако, для некоторых других типов судов, другое время плюрониевого кислоты и инкубации может потребоваться тестирование. 3) Правильное крепление аорты к силиконовым покрытием блюдо с сеткой и булавки обеспечит стабильную вид во время съемки с двух фотонов микроскопом. Потому что судно будет сжиматься и расширяться, важно, чтобы убедиться, что судно propeжелезная дорога крепится к чашке, чтобы избежать артефактов движения, которые могут возникнуть. 4) Количественное определение результатов. Пожалуйста, обратите внимание, что переходный амплитуда не всегда может быть лучшим показателем для сравнения физиологических характеристик клеток. Интеграл переходного могут показать более разницу в связи с полной [Ca 2+] Я или NO-релизе.

Когда эксперименты выполнены правильно, то можно контролировать [Са 2+] я (или NO уровней) изменяется в ответ на раздражители, как показано на рисунках 3 и 4 и Видео 1 & 2. Сочетание экс естественных условиях подготовки и использование двух фотонов изображений может обеспечить лучшее разрешение сигнала и точные измерения внутриклеточных процессов в сосудистых тканях. Вот эти технологии были применены в сочетании с классической, не логометрической Ca 2+ и нет показателей (Fluo-4 утра и DAF-FM диацетатной, соответственно), визмерения переходных кальция и не производство в отдельных клетках изолированной всей аорты. Мы считаем, что этот метод поможет направить наши знания о регулировании механизмов [Са 2+] я и NO уровнях в различных типах клеток сосудов.

Модификации и устранение неисправностей. Основные принципы измерения Са 2+ сигналов в одиночных клетках гладкой мускулатуры с чувствительной ионофоров изначально была опубликована в 1985 году 7 Большинство современных методов визуализации для Ca 2+ уровня в отдельных клетках сосудов использовали лазерный-сканирующей конфокальной микроскопии и изолированной или культивированный препараты. Для динамических тканей, таких как кровеносные сосуды, трудно измерить количество кальция или вообще без уровни в естественных условиях, используя методы микроскопии на основе. 2 Основным ограничением является то, что почти все кровеносные сосуды на артериальной стороне циркул ции имеют внутреннюю эластичную пластинку, которая находится между endotгелий и внутренний слой клеток гладких мышц. 8 Кроме того, большую часть внеклеточного материала между гладких мышц и адвентиции слой является коллаген. 8 эластин и коллаген являются основным источником автофлуоресценции с высокой интенсивностью и в широком диапазоне длин волн возбуждения , Сильный фон флуоресценции в сочетании с повышенным рассеянием света во время конфокальной микроскопии производит низкое разрешение сигнала и поэтому, снижение обнаружение сигналов кальция или NO производства. Ограничивающим фактором нагрузки флуоресцентных зондов в клетках сосудов в концентрациях, достаточных, чтобы сделать значимые измерения могут быть решены с помощью экс естественных условиях подготовки, два фотона микроскоп и применяя новый класс ионофоров, таких как Asante красный, который испускает флуоресценцию при длительном Длины волн, где существует меньше помех от автофлуоресценции соединительной ткани и волокна. Тем не менее, одним из основных недостатков этого метода является то, что DIFтрудностей добиться объединить два или более красителей во время съемки. Спектры возбуждения для большинства из доступных красителей для двух фотонов изображений имеют широкие, полимодальной характеристики распределения, которые делают его трудным для измерения двух различных ионофоры одновременно. Тем не менее, низкий уровень шума гибридные детекторы могут быть использованы, чтобы сузить обнаруженные спектры эмиссии в предположении, что ионофоры излучать свет на различных длинах волн. Например, в описанном порядке это не возможно, чтобы измерить и отсутствии производства и Ca 2+ изменения концентрации, поскольку спектры эмиссии перекрываются.

Сосудистых эндотелиальных клеток, которые находятся в непосредственном контакте с потоком крови подвергаются напряжения сдвига жидкости и регулируют сосудистый гомеостаз. 9 тока метод может быть также применен для контроля потока индуцированных переходных кальция и не производства в эндотелиальных клетках исключая виво. Кроме того, этот метод может быть успешно применен для изучения Са 2+ ConCentraизменения Тион в гладкомышечных клетках мелких артерий сопротивления, извлеченных из почки. В этом случае, рассеченные мелких артерий сопротивления должны быть выведены в Са 2+ -free решение, чтобы избежать повреждения гладкой мышечных клеток за счет Ca 2+ перегрузки. Эта модификация может быть также применен к аорте, чтобы уменьшить гибель клеток.

Перспективы. Флуоресценции на основе широко используются для изучения клеточной физиологии в пробирке; Однако, модели изолированные клеточные не всегда воспроизводят физиологические процессы, которые происходят, когда клетки находятся в их родной среде. Это ограничивает применимость клеточных линий для трансляционных исследований. 10 Как описано здесь, использование бывших естественных условиях подготовки дал нам возможность контролировать клеточный поведения в свежевыделенными ткани, где все местные физиологические процессы и взаимодействие с другими типами клеток все еще ​​происходят , С ростом числа генетических Engineering технологии доступны и разработка моделей, которые воспроизводят человеческие болезни, экс VIVO препараты будут полезным инструментом для трансляционных исследований. Для исследований, описанных здесь, была использована соль-чувствительных (СС / JrHsdMcwi) гипертоническая крыс штамма Даль. СС крыса естественным инбредных генетическая модель соли чувствительных гипертония, что повторяет многие аспекты прогрессивного человека гипертензии. Эта модель широко используются и при условии, ключевых идей в механизмах, лежащих соль-чувствительности и сосудистой дисфункции. 11-13 С этой крысиной модели, исследователи смогли проверить вклад ключевых механизмов для сложных заболеваний, как гипертония (), используя ZFNs , Talens и CRISPR / технологии генной редактирования Кас основе. 6,14-17 Использование экспериментальной методике, описанной здесь вместе с этими генами редактирования ресурсов, теперь можно начать тестирование вклад кальция и других ключевых факторов для соли , чувствительнымигипертония и сосудистая дисфункция в различных моделях на животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Уильяма Cashdollar, и Northwestern Mutual Foundation Imaging центр в крови научно-исследовательского института штата Висконсин за помощь в исследованиях изображений. Мы также благодарим доктора Дарья Ilatovskaya для критического чтения этой рукописи и полезные обсуждения. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов HL108880 (как) и DP2-OD008396 (в AMG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAF-FM Life Technologies D-23842
Fluo-4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution Sigma-Aldrich P5556
L-NAME Tocris 0665
Olympus upright microscope Olympus Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL  Spectra Physics Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters Olympus FV10-MRL/R  495 to 540 nm 
25× water-immersion objective lens Olympus XLPL25XWMP N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid  Warner Instrument  SHD-27LH
Other basic reagents  Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
  3. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
  4. Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
  5. Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
  6. Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
  7. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
  8. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
  9. Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
  10. Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
  11. Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
  12. Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
  13. Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
  14. Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
  15. Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
  16. Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
  17. Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).

Tags

Клеточная биология выпуск 100 Двухфотонное микроскопии флуоресценции сосудистая внутриклеточный кальций Fluo-4 утра оксид азота DAF-FM аорты крыс
Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Endres, B. T., Staruschenko, A.,More

Endres, B. T., Staruschenko, A., Schulte, M., Geurts, A. M., Palygin, O. Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta. J. Vis. Exp. (100), e52734, doi:10.3791/52734 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter