Summary
As propriedades mecânicas e a micro estrutura da matriz extracelular afectar fortemente a migração de células 3D. Um método in vitro para estudar o comportamento de migração celular no espaço-temporal ambientes biofísico variáveis, tanto na população e os níveis de células individuais, é descrito.
Abstract
A capacidade das células para migrar é crucial numa grande variedade de funções celulares ao longo da vida do desenvolvimento embrionário e na cicatrização de tumor e a metástase do cancro. Apesar dos esforços intensos de investigação, os princípios bioquímicos e biofísicos básicos de migração de células ainda não são totalmente compreendidos, especialmente nas três dimensões (3D) microambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, nós descrevemos um ensaio in vitro concebido para permitir a análise quantitativa de 3D comportamentos de migração celular. O método explora mechanosensing capacidade da célula e propensão para migrar para dentro da matriz extracelular previamente desocupado (ECM). Usamos a invasão de células do cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, em géis de colagénio, tal como um sistema modelo. A disseminação da população de células e as dinâmicas migratórias de células individuais ao longo de semanas de cultura pode ser controlada por meio de imagens ao vivo de células e analisados para extrair dados espaço-temporalmente-resolvidos. Além Do Mais, O método é facilmente adaptável para diversas matrizes extracelulares, oferecendo assim uma maneira simples e poderosa para investigar o papel dos factores biofísicos no microambiente sobre a migração celular.
Introduction
A migração de células desempenha um papel chave em várias respostas fisiológicas, tais como o desenvolvimento embrionário, hemostase, e resposta imunitária, bem como em processos patológicos tais como doenças vasculares, inflamação e cancro 1. Dissecando os factores bioquímicos e biofísicos subjacentes a migração celular é portanto fundamentalmente importante não só para compreender os princípios básicos de funções celulares, mas também para fazer avançar várias aplicações biomédicas, tais como em engenharia de tecidos, anti-metástases e desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias. Desde observação in vivo é tecnicamente desafiador, uma série de esforços tem sido focada em in vitro recapitulação da migração celular.
Os métodos in vitro para estudar a migração de células têm sido amplamente concebido para ensaios em duas superfícies (2D) dimensionais, mais notavelmente o arranhão ou ferimento ensaio 2 de cura. Tais ensaios oferecem configuração experimental simples, fácil live-imagens de células, e fornecer informações úteis sobre vários mecanismos bioquímicos subjacentes migração celular. No entanto, estes ensaios não têm em conta a arquitetura da matriz extracelular (ECM) e remodelação, que são aspectos críticos na compreensão da migração vivo. Recentemente, tem sido cada vez mais apreciado que um modelo de cultura 3D, muitas vezes em matrizes à base de colagénio 3, fornece uma plataforma que melhor se assemelha à situação in vivo. De fato, as células apresentam dinâmicas migratórias que são distintas daquelas em superfícies 2D, especialmente devido à diferente dimensionalidade do meio ambiente 4. Além disso, as propriedades biofísicas e mecânicas da matriz afecta sensivelmente a migração celular 5, nomeadamente no contexto de invasão de células tumorais 6.
Aqui, apresentamos um método para estudar o comportamento de migração celular 3D em ECM com propriedades biofísicas que podem ser facilmente variado, com condições de preparação. As células sãosemeadas em um "gel interior" e estão autorizados a escapar para dentro e invadir o "gel exterior" inicialmente acelular. O método baseia-se na capacidade da célula para reconhecer a presença de, e a propensão para migrar para dentro, regiões livres de células no exterior de gel, que está intimamente ligado à célula mechanosensing 7. Neste estudo, utilizamos redes de colágeno que a ECMs invadidas por células de câncer de mama altamente invasivos, MD-MBA-231. As propriedades mecânicas e microestrutura de ambos os géis de interiores e exteriores pode ser sintonizado 8 e 9 caracterizado para atingir as condições f isiologicamente relevantes. Reconstrução e análise das faixas de células permitir o exame quantitativa detalhada do comportamento de migração espaço-temporais, tanto a nível da população e nível de célula individual. É importante notar que a configuração do sistema de gel concêntrico imita a topologia de tecido in vivo enfrentado pelas células migrantes, especialmente células cancerosas invasoras, oferecendo, assim, conhecimentos importantespara os mecanismos físicos de migração celular e metástase.
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Protocol
Colheita 1. celular
- Obter MD-MBA-231 a partir do 37 ° C, 5% de CO2. Separar as células do tecido placa de cultura utilizando-se 0,5% de solução de Tripsina-EDTA. Use 1 ml de solução de tripsina-EDTA para células cultivadas num frasco T25.
- Células de pellets em um tubo de 15 ml por centrifugação a 200 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de cultura.
- Contagem de densidade celular, ρ, utilizando um hemocitómetro.
Nota: Para preparar o gel interior da célula-semeado, a suspensão de células vai ser, mais tarde, diluiu-se 10 × para atingir a densidade final de células de semeadura. Portanto, 10 × suspensão concentrada de célula é necessário. - Calcula-se o volume de meio necessário para atingir uma concentração de 10 × celular:
Nota: A densidade final semeadura de células, c final, de cerca de 215; 10 6 células / ml é recomendado para MD-MBA-231 e é utilizado no presente protocolo. Outros densidades de sementeira podem também ser explorado para outros tipos de células. - Células de pellets mais uma vez em um tubo de 15 ml por centrifugação a 200 × g por 4 min, e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células na quantidade necessária (V médio calculadas no passo 1.3) de meio de cultura celular livre de soro cuidadosamente para minimizar a aglutinação celular.
Nota: O fenol vermelho é auto-fluorescente, e pode interferir com a imagiologia por fluorescência / reflectância. O uso de meio isento de vermelho de fenol pode ser considerado para alcançar melhor qualidade de imagem.
2. Preparação de Soluções de colágeno
- Obter a solução de colagénio de estoque, 10 × tampão PBS, Milli-Q H 2 O, NaOH a 0,1 M, e vários tubos de microcentrífuga. Mantenha tudo no gelo para evitar a polimerização prematura de colágeno, e manter a condição estéril.
- Equilibrar uma Glass- estérilprato inferior por pré-aquecendo-a no 37 ° C incubadora.
Nota: Todos os volumes neste protocolo foram otimizados para um prato fundo de vidro de 12 mm assim. Se outro tipo prato é usado, ajustar os volumes proporcionalmente. - Calcular o volume requerido necessário para preparar 50 ul de solução de colagénio a 2,4 mg / ml para o gel interior (solução I) com base na concentração de estoque de colagénio.
Nota: Outras concentrações de colagénio para o interior de gel pode também ser usado. - Em um ambiente estéril (tipicamente um capuz biosegurança), adiciona-se lentamente 5 mL de 10 × tampão PBS para a quantidade necessária de solução-mãe de colagénio (calculado no passo 2.3), com agitação suave. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.
- Ajustar o pH da mistura para 7,4 utilizando NaOH 0,1 M calibrado usando medidor de pH. Como orientação geral, utilizar cerca de 5 ul para trazer o pH para perto de 7,4 (a quantidade varia dependendo da concentração estoque e pH).
Nota: Observe que os volumes envolvidos nestepasso é demasiado pequeno para o uso do medidor de pH padrão. Use um dos seguintes truques:- Preparar soluções de colágeno para várias amostras. Ajustar o pH em grandes quantidades usando um medidor de pH padrão e distribuir as soluções de colagénio entre as amostras.
- Em alternativa, ajustar o pH de uma solução de colagénio em maior volume (i. E., O volume que permitem o uso de medidor de pH padrão). Note-se a quantidade de NaOH necessária para trazer o pH para o valor final de pH. Reduza os volumes e usar a quantidade apropriada de NaOH para o experimento. Confirme o valor pH utilizando papel Litmus.
- Caso contrário, utilizar um eléctrodo de pH de micro para ajustar de forma mais precisa o pH de pequenas quantidades.
- Levar a solução para um volume de 45 ul usando H 2 O. Execute todas as etapas no gelo para evitar a polimerização prematura de colágeno.
3. Formação de Concentric Cultura Gel
- Pegue o prato com fundo de vidro pré-aquecido (veja o passo 2.2) a partir de the incubadora.
- Adiciona-se 5 ul da suspensão de células de 10 x concentrado (preparado no passo 1.5) a solução I. Ressuspender completamente. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. A mistura agora tem um volume de 50 ul e contém a concentração final de colagénio (2,4 mg / ml) e a densidade celular (final c = 2 × 10 6 células / ml).
- Adicionar 20 ul da solução contendo as células que se lentamente para o centro do poço, de modo a formar uma gotícula (Figura 1A) em forma de cúpula. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas nesta etapa. Caso se forme um bolha, com cuidado, mas rapidamente quer tentar rompê-lo ou sugá-lo para fora usando uma ponteira. Suavemente colocar o prato de volta na incubadora para permitir que o gel interior polimerizar durante 45 minutos.
- Preparar a solução de O (para o, gel de colagénio acelular exterior) cerca de 15 minutos antes do final deste passo de incubação.
Nota: A condição exterior de gel pode ser variada em termos de concentração de colagénio e ao pH de polimerizaçãoobter redes com diferentes microestruturas 10. Neste protocolo, o foco sobre um 1,5 - gel de colagénio a 4,0 mg / ml polimerizada a um pH de 7,4.- Com base na concentração de estoque de colagénio, calcular o volume requerido necessário para preparar 200 mL de solução de colagénio O na concentração final.
- Adicionar 20 ul de tampão PBS 10 × lentamente para a quantidade necessária de solução-mãe de colagénio (calculado no passo 3.4), com agitação suave. Ajustar o pH da mistura para o valor final de pH utilizando NaOH 0,1 M e o uso de medidor de pH calibrado. Veja a nota para o passo 2.5 relativamente ao ajuste de pH.
- Levar a solução para um volume final de 200 ul usando H 2 O. Execute todas as etapas no gelo para evitar a polimerização prematura de colágeno.
- Leve o prato da incubadora após 45 min de polimerização do gel interior (veja o passo 3.3). Adicionar cuidadosamente 180 ul de solução de S no topo do gel interior, de modo que a solução de cobre completamente o interiorgel e enche-se a cavidade (Figura 1B).
- Executar este passo cuidadosamente sem agitar a solução, o que pode levar a orientações de fibras não-uniformes no exterior de gel. Tome cuidado para evitar tocar o gel interno com uma ponteira, e para evitar a formação de bolhas ou bolsas de ar. Caso se forme um bolha, com cuidado, mas rapidamente quer tentar rompê-lo ou sugá-lo para fora usando uma ponteira. Suavemente colocar o prato de volta na incubadora para permitir que a polimerizar exterior de gel.
- Leve o prato da incubadora após 45 min de polimerização. O gel deve ser já bastante solidificado, neste ponto, embora ainda pode destacar da superfície inferior, se manuseada com cuidado.
- Suavemente para 2 ml de meio de cultura celular aquecida ao prato (Figura 1C). Certifique-se de que o gel é completamente submergido no meio. Atualize a médio a cada 2-3 dias ao longo do período de cultura.
4. Imagens ao vivo de células
- Realizar imagem usando um microscópio confocal invertido equipado com capacidade de geração de imagens de células vivas de longo prazo. Incluir um embutido câmara de incubação com uma temperatura (37 ° C) e CO2 (5%) de controlo. Ligue o microscópio e aquecer o palco, pelo menos, 1 hora antes do início do experimento.
Nota: Use lente objetiva com longa distância de trabalho para otimizar a observação e localização das células nos géis 3D. - Incubar o gel em meio contendo 5 ul de corante de rastreador de células fluorescentes durante 30 min para permitir uma localização precisa das células no sistema 3D. Posteriormente, remover o corante não ligado por lavagem três vezes com 1 × PBS. Em seguida, adicionar meio de cultura de células para o prato.
- Leve o prato da incubadora e colocá-lo no palco microscópio (Figura 1D).
Nota: imagens de células vivas pode começar em princípio, logo após a polimerização do gel exterior. No entanto, neste momento, as células in O gel interno não se espalharam ainda. Para examinar a migração das primeiras células que invadiram o exterior de gel, de imagem de células vivas pode começar 24 horas (dependendo do tipo de células) após o inicio da cultura. Como um guia, em torno de 12 - são necessárias mais 14 dias de cultura para a maioria das células no interior do gel para entrar no exterior de gel. - Selecionar volumes de Vista (VOV de) em regiões do gel exterior em torno do gel interior. Após 24 h de incubação, a população de células terá difundido, atravessou a interface entre os geles de interior e exterior, e começou a invadir o exterior de gel.
- Para o VOV de, incluem as regiões de gel imediatamente ao lado da interface de gel, regiões intermédias, e as regiões perto da periferia da gel exterior 7. Excluir regiões mais próximas do que 50 mm a partir das superfícies de fundo e laterais, bem como a partir do topo do gel, a fim de evitar possíveis efeitos de borda. Cada VOV tipicamente mede 647 × 647 × 100 mm 3 (em x, y, z e indicações, respectivamente), com intervalo de 5 mm na -stack z.
- Assegurar modos de imagem, canais / filtros, tempos de exposição, e resoluções de imagem estão corretamente selecionado. Para imagens de livre-label da rede de colágeno, utilize microscopia confocal de reflectância simultaneamente durante o lapso de tempo de imagens ao vivo de células.
- Tome imagens de exemplo, traçar os histogramas de intensidade, e ajustar os ganhos e compensações para observar sinal suficiente e evitar a saturação, assegurando que o histograma fica entre zero e a intensidade máxima. Não altere estas configurações mais durante todo o período do experimento.
- Tome imagens de lapso de tempo dos VOV de selecionados, com um intervalo de tempo, Δ t, de 10 min para 8 horas (ou mais, se necessário).
5. Acompanhamento de celular e Análise de Dados
- Realizar imagem quantitativa pós-processamento das imagens -stack z utilizando appropria software de processamento de imagem te.
- Segmento as imagens de lapso de tempo para selecionar automaticamente as posições celulares 3D em (x, y, z, t).
- Para cada quadro, verificar manualmente a precisão de localização e remover falsos positivos devido a restos de células e saliências celulares que podem ter sido confundido com células. Remover as células de proliferação a partir da análise e as células que se sobrepõem ou ligados divididas em objetos distintos.
- Gerar faixas de células de lapso de tempo em 3D a partir de células (as coordenadas x, y, z, t) obtidos no passo anterior, ligando a localização de cada célula na sequência de tempo.
- Elimine o ruído aleatório e sistema removendo faixas mais curtos do que um comprimento de rasto limiar (tipicamente 20 minutos).
- Corrija para a amostra deriva subtraindo os deslocamentos líquidos globais dos trilhos, se necessário.
- Calcular o deslocamento de células,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/>, e distância de migração celular,
, A partir de células observadas as trajectórias, em que é um vector que representa a localização de uma célula de 3D em tempo e é o número total de pontos de tempo. - Calcular a velocidade célula como S = d / (n • Δ t), onde Δ t é o intervalo de tempo entre os quadros. Calcule direcionalidade migração celular (ou persistência) usando P = Δd / d. Esta simples medida de persistência implica que, para P = 0 o deslocamento líquido é zero e para P = 1 a trajetória é uma linha reta direcional.
, A partir de células observadas as trajectórias, em que é um vector que representa a localização de uma célula de 3D em tempo e é o número total de pontos de tempo. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O ensaio de gel concêntrico aqui apresentada foi realizada utilizando células de cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, com 2,4 mg / ml de gel de colagénio interior e uma densidade de sementeira de células de = 2 x 10 6 células / ml, como um exemplo. Como mostrado na Figura 2, tipicamente depois de alguns dias de cultura, as células violou a interface gel interior-exterior e começou a invadir o exterior de gel. A população de células predominantemente espalhar radialmente para o exterior.
As condições de polimerização do exterior de gel pode ser modificada para estudar o papel das propriedades mecânicas e da densidade da matriz sobre as características de migração de células. A Figura 3 mostra os movimentos de células individuais em géis exterior de 1,5 mg / ml, 2,4 mg / ml, e 4,0 mg / ml de colagénio, polimerizada a um pH de 7,4. Imagens confocais de lapso de tempo foram adquiridos na fronteira entre o gel interior e exterior durante 8 horas, e o deslocamento das células nas três diferentes concen colagéniotrações é indicado em setas brancas. Dependendo da taxa de densidade de sementeira e proliferação celular, ~ 200 trajectórias de células individuais podem tipicamente ser extraídos e analisados em cada amostra.
Foram analisados quantitativamente as trajetórias celulares nos três concentrações diferentes de colágeno em termos de deslocamento líquido médio, distância percorrida, persistência direcional, e velocidade média ao longo de 8 h de imagem (Figura 4). Observou-se que a distância média do deslocamento e eram mais elevada para 4,0 mg / ml de concentração a 58 mm e 141,5 mm, respectivamente, apesar de não haver diferença significativa no deslocamento e a distância entre as células em 2,4 mg / ml e 4,0 mg / ml géis . Em 1,5 mg / ml de gel, a média de deslocamento e distância eram menores. Esta observação pode parecem contradizer os relatórios recentes que mostram que a eficiência invasão diminui em géis com o aumento da concentração de colágeno 11,12. Note-se, contudo, que os deslocamentos edistâncias em nosso ensaio são medidos a partir de todas as faixas de células individuais dentro de população predominantemente radialmente para fora migrando. Estes parâmetros são, portanto, muito menos suscetíveis a subpopulação de células-se movendo mais rápido e não são completamente dominado pelos movimentos estocásticos.
Em todos os casos, a distância total percorrida (Figura 4B) foi maior do que o deslocamento de líquido (Figura 4A). Definindo persistência simplesmente como a razão entre a distância de deslocamento, obteve-se a persistência de ~ 0,4 em todas as condições de gel (Figura 4C). Este relativamente baixa persistência reflete o fraco intrinsecamente migração direcional das células no nosso ensaio. Nós antecipamos que a presença de estímulos quimiotáticos direcionais ou gradientes bioquímicos vai aumentar a persistência, potencialmente em colágeno forma dependente da concentração. Além disso, observamos também que a velocidade média de migração de células não se alterou significativamente with concentração de colagénio (Figura 4D), provavelmente por causa da interacção entre a rigidez da matriz (que aumenta com a concentração de colagénio) e tamanho de poro (que diminui com a concentração de colagénio) 10, bem como a variação espaço-temporal das características de migração dentro da população de células 7. A velocidade média variou entre 31 mm / hr e 37,5 mm / h, com uma velocidade de célula individual mínima de 7 mm / hr e uma velocidade de célula individual máxima de 114 mm / h.
Figura 1. Diagrama esquemático dos passos envolvidos na configuração do ensaio de migração em gel 3D concêntrico. (A) A formação do gel de colagénio interior no centro do poço no fundo da placa de vidro, que contém as células. (B) Formação do (acelular) gel de colágeno exterior encapsular o interiorgel. (C) imersão dos geles em meio de cultura celular. As células são então deixadas a equilibrar e atribuem à matriz fibrosa circundante. Esta etapa pode demorar algumas horas até 1 dia após o início da polimerização gel. (D) criação de imagens de células vivas, monitorando a disseminação da população de células no gel exterior.
Figura 2. Espalhar da população de células. (A) após 12 dias de cultura, MDA-MB-231 tinha violado a interface gel interno-externo (linha tracejada verde) e invadiu exteriormente no gel exterior originalmente acelular (escala bar = 200 mm). As áreas mais brilhantes são regiões ocupadas pelas células, enquanto que as áreas mais escuras são regiões livres de células esta imagem de contraste de fase em. Os rectângulos amarelos representam os VOV de de interesse, onde a invasão da célula cancerosa 3D foi monitorada. O cells migrou predominantemente radialmente para fora, tal como indicado pelas setas (B) Sobreposição de imagem confocal de fluorescência das migram MDA-MB-231 (vermelho; amarelo quando sobrepostos pseudo-coloridas com colagénio verde) de. imagem e reflectância da matriz de colagénio ( verde). As setas apontam para a direcção da migração das células individuais dentro de um intervalo de tempo de 5 h. Escala da barra = 50 m. (C) A partir das imagens de lapso de tempo, faixas das células pode ser obtida. Aqui as faixas de células são o tempo, como indicado pela barra de cor (escala de tempo = 8 horas) codificados por cores. Adaptado de Sun et al 7,10. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. movimento celular em diferentes densidades de gel de colágeno. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise de trajetórias de migração celular. As trajetórias de migração do indivíduo MD-MBA-231 mais de 8 horas foram quantificados em termos de (A) deslocamento net, (B) a distância, (c), persistência, e (d), com média velocidade para diferentes concentrações de colagénio exterior de gel: 1,5 mg / ml, 2,4 mg / ml, e 4,0 mg /ml. Imagens de lapso de tempo foram adquiridos junto da interface dos géis interiores e exteriores. Os dados são a média ± erro padrão da média (SEM) obtido a partir de mais do que 200 células trajectórias em 3 experiências independentes em cada condição. Os asteriscos (*) indicam diferença estatisticamente significativa (p <0,01).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem W. Sun e K. Jansen para as discussões críticas, e reconhecer o apoio pelo Nano Laboratório de Biomecânica da Universidade Nacional de Cingapura. NAK reconhece o apoio por um Marie Curie IIF Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
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