Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

doi: 10.3791/52735 Published: April 3, 2015

Summary

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Abstract

Het vermogen van cellen om te migreren is cruciaal diverse celfuncties levenslange uit embryonale ontwikkeling en wondheling tumor en kanker metastase. Ondanks intensieve onderzoeksinspanningen, de fundamentele biochemische en biofysische principes van celmigratie worden nog niet volledig begrepen, vooral in het fysiologisch relevante driedimensionale (3D) micro-omgevingen. Hier beschrijven we een in vitro assay ontwikkeld om kwantitatieve onderzoek van 3D celmigratie gedrag mogelijk. De methode maakt gebruik van de cel mechanosensing vermogen en de neiging om te migreren naar voorheen leegstaande extracellulaire matrix (ECM). We gebruiken de invasie van sterk invasieve borstkanker cellen, MDA-MB-231, collageen gels als modelsysteem. De verspreiding van de celpopulatie en de migratie dynamiek van individuele cellen over weken van de cultuur kan worden gecontroleerd met behulp van live-cell imaging en geanalyseerd om spatiotemporeel-opgelost gegevens te extraheren. BovendienDe werkwijze gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende extracellulaire matrices biedt dus een eenvoudige maar krachtige manier om de rol van biofysische factoren in het micromilieu op celmigratie te onderzoeken.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Migratie van cellen speelt een belangrijke rol in verscheidene fysiologische reacties zoals embryonale ontwikkeling, hemostase en immuunrespons en in pathologische processen zoals vaatziekten, ontstekingen en kanker 1. Opheldering van de biochemische en biofysische oorzaken celmigratie derhalve fundamenteel belang niet alleen om de basisprincipes van cellulaire functies, maar ook voor verschillende biomedische toepassingen, zoals in weefselmanipulatie, anti-metastase en ontstekingsremmend ontwikkeling van geneesmiddelen bevorderen. Aangezien in vivo waarneming technisch uitdagend, heeft veel inspanningen gericht op de in vitro recapitulatie van celmigratie.

In vitro werkwijzen om celmigratie te onderzoeken grotendeels zijn ontworpen voor assays op tweedimensionale (2D) oppervlakken, met name de kras of wondgenezing assay 2. Dergelijke tests bieden eenvoudige experimentele opstelling, eenvoudig live-cell imaging, en nuttige inzichten in verschillende biochemische mechanismen die ten grondslag liggen cel migratie. Echter, deze testen geen rekening met de extracellulaire matrix (ECM) architectuur en remodeling, die kritisch aspecten inzicht in vivo migratie. Onlangs is langzamerhand duidelijk zijn dat een 3D cultuurmodel, vaak op basis van collageen matrices 3, een platform dat beter lijkt de in vivo situatie. Inderdaad cellen vertonen migratierichting dynamiek die verschilt van die van 2D oppervlakken, vooral door de verschillende dimensionaliteit van het milieu 4. Bovendien, de biochemische en mechanische eigenschappen van de matrix gevoelig beïnvloeden celmigratie 5, ook in het kader van tumorcel invasie 6.

Hier presenteren we een methode om 3D celmigratie gedrag bestuderen ECM met biofysische eigenschappen die gemakkelijk afgewisseld met preparaat kan worden. De cellen zijngezaaid in een "innerlijke gel" en zijn toegestaan ​​om te ontsnappen in en binnen te vallen de aanvankelijk acellulaire "buitenste gel". De werkwijze berust op het vermogen van de cel om de aanwezigheid van herkennen en neiging tot migreren naar celvrije gebieden in de buitenste gel, die nauw verbonden cel mechanosensing 7. In deze studie maken we gebruik van collageen netwerken als de ECM's binnengevallen door zeer invasieve borstkanker cellen, MD-MBA-231. De mechanische eigenschappen en de microstructuur van zowel de binnenste en buitenste gels kunnen worden afgesteld 8 en 9, met het kenmerk fysiologisch relevante omstandigheden te bereiken. Reconstructie en analyse van de cel tracks staan ​​gedetailleerde kwantitatieve onderzoek van de tijdruimtelijk migratiegedrag zowel op populatieniveau en individuele cel niveau. Belangrijk is dat de opzet van het concentrische gel systeem bootst de in vivo weefsel topologie waarmee migrerende cellen, vooral binnendringende kankercellen, en biedt dus belangrijke inzichten inde fysische mechanismen van celmigratie en metastase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cell Oogsten

  1. Verkrijgen MD-MBA-231 cellen van de 37 ° C, 5% CO2 incubator. Los cellen uit weefselkweek plaat met behulp van 0,5% trypsine-EDTA-oplossing. Gebruik 1 ml trypsine-EDTA oplossing cel gekweekt in een T25 fles.
  2. Pellet cellen in een 15 ml conische buis door centrifugatie bij 200 x g gedurende 4 min, zuig de supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml kweekmedium.
  3. Telling celdichtheid, ρ, met behulp van een hemocytometer.
    Opmerking: Om de cel geplaatste innerlijke gel te bereiden, zal de celsuspensie later worden verdund 10 × tot de laatste cel zaaien dichtheid te bereiken. Daarom is 10 x geconcentreerde celsuspensie vereist.
  4. Bereken het volume medium vereist om een ​​10 x celconcentratie te bereiken:
    Vergelijking 1
    Opmerking: Een laatste cel zaaien dichtheid, c finale, van ongeveer 215; 10 6 cellen / ml wordt aanbevolen voor MD-MBA-231-cellen en wordt in dit protocol. Andere zaaien dichtheden kan ook worden onderzocht voor andere celtypen.
  5. Pellet cellen één keer in een 15 ml conische buis door centrifugatie bij 200 x g gedurende 4 minuten en zuig de supernatant.
  6. Resuspendeer de cellen in de vereiste hoeveelheid (V medium berekend in stap 1.3) serumvrij celkweekmedium grondig cel klonteren minimaliseren.
    Opmerking: Fenolrood is auto-tl, en kunnen interfereren met fluorescentie / reflectie beeldvorming. Het gebruik van fenol-rood-vrij medium kan worden beschouwd als beste beeldkwaliteit.

2. Voorbereiding van Collageen Solutions

  1. Haal de stock collageenoplossing, 10 x PBS buffer, Milli-Q H 2 O, 0,1 M NaOH en enkele microcentrifugebuizen. Houd alle op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen, en steriele conditie te houden.
  2. Equilibreer een steriele glas-onderste schaal door vooraf verwarmen op 37 ° C incubator.
    Opmerking: Alle volumes in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor een glazen bodem schotel met 12 mm goed. Als een ander type gerecht wordt gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen van de volumes.
  3. Bereken het vereiste volume nodig 50 ui 2,4 mg / ml collageen te bereiden voor de binnenste gel (oplossing I) op basis van het collageen voorraad concentratie.
    Opmerking: Andere collageen concentraties voor de binnenste gel kan ook worden gebruikt.
  4. In een steriele (gewoonlijk een bio kap), voeg langzaam 5 ui 10 x PBS buffer tot de vereiste hoeveelheid collageen voorraadoplossing (berekend in stap 2.3) onder zachtjes wervelen. Zorg ervoor dat de vorming luchtbel te voorkomen.
  5. Stel de pH van het mengsel op 7,4 met 0,1 M NaOH met geijkte pH-meter. Als een indicatie, gebruiken ongeveer 5 ul om de pH in de buurt van 7,4 te brengen (het bedrag varieert afhankelijk van de voorraad concentratie en pH).
    Opmerking: Let op dat de betrokken volumes in dezestap is te klein voor het gebruik van standaard pH-meter. Gebruik een van de volgende trucs:
    1. Bereid collageen oplossingen voor meerdere monsters. Stel de pH in bulk met behulp van standaard pH-meter en distribueren van de collageen-oplossingen in de monsters.
    2. Als alternatief, pas de pH van een oplossing van collageen in grotere volume (i. E., Volume dat het gebruik van standaard pH-meter staan). Let op de hoeveelheid NaOH om de pH op de uiteindelijke pH brengen. De schaal van de volumes en gebruik de juiste hoeveelheid NaOH voor het experiment. Bevestig de pH-waarde met behulp van Lakmoespapier.
    3. Anders een micro pH-elektrode om de pH van kleine hoeveelheden nauwkeuriger regelen.
  6. Breng de oplossing tot een volume van 45 ui met H2O Voer alle stappen op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen.

3. Vorming van Concentric Gel Cultuur

  1. Neem de voorverwarmde glazen bodem schaal (zie stap 2.2) van the incubator.
  2. Voeg 5 ul van de 10 × geconcentreerde celsuspensie (opgesteld in stap 1.5) naar oplossing I. Hersuspendeer grondig. Zorg ervoor dat de vorming luchtbel te voorkomen. Het mengsel heeft nu een volume van 50 pl en bevat de uiteindelijke collageen concentratie (2,4 mg / ml) en celdichtheid (c uiteindelijke = 2 x 10 6 cellen / ml).
  3. Voeg 20 ul van de cel-bevattende oplossing ik langzaam naar het midden van de put, zodat vormt een koepelvormige druppel (Figuur 1A). Zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen bij deze stap te vermijden. Als een zeepbel vormen, voorzichtig maar snel proberen om ofwel scheurt het of uitzuigen met een pipet tip. Plaats voorzichtig de schotel terug in de incubator te laten de innerlijke gel polymeriseren gedurende 45 min.
  4. Pesticide O (voor de buitenste, acellulair collageen gel) ongeveer 15 minuten vóór het einde van de incubatiestap.
    Opmerking: De buitenste gel voorwaarde kan worden gevarieerd in termen van collageenconcentratie en polymerisatie pHnetwerken te verkrijgen met verschillende microstructuren 10. In dit protocol, gericht op een 1,5-4,0 mg / ml collageengel gepolymeriseerd bij een pH van 7,4.
    1. Op basis van de collageen voorraadconcentratie Bereken het vereiste volume nodig is om 200 pl collageenoplossing O bereiden de eindconcentratie.
  5. Voeg 20 ul van 10 x PBS buffer langzaam de vereiste hoeveelheid collageen voorraadoplossing (berekend in stap 3.4) onder zachtjes wervelen. Stel de pH van het mengsel aan de uiteindelijke pH met 0,1 M NaOH met behulp van gekalibreerde pH-meter. Zie toelichting naar stap 2.5 met betrekking tot aanpassing van de pH.
  6. Breng de oplossing tot een eindvolume van 200 pl met H2O Voer alle stappen op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen.
  7. Neem de schaal uit de incubator na 45 min polymerisatie van de binnenste gel (zie stap 3.3). Voeg voorzichtig 180 ul oplossing O bovenop de binnenste gel, zodat de oplossing volledig bedekt binnenstegel en vult de put (Figuur 1B).
    1. Voer deze stap voorzichtig zonder roeren van de oplossing, wat kan leiden tot ongelijkmatige vezel oriëntaties in de buitenste gel. Zorg om te voorkomen dat het aanraken van de binnenste gel met een pipet, en om de vorming van bellen of luchtzakken te voorkomen. Als een zeepbel vormen, voorzichtig maar snel proberen om ofwel scheurt het of uitzuigen met een pipet tip. Plaats voorzichtig de schotel terug in de incubator te laten de buitenste gel polymeriseren.
  8. Neem de schaal uit de incubator na 45 min van de polymerisatie. De gel moet reeds vrij solidified op dit punt, maar het kan nog los van het bodemoppervlak als ruw behandeld.
    1. Giet 2 ml opgewarmd celcultuurmedium om de schotel (figuur 1C). Zorg ervoor dat de gel volledig is ondergedompeld in het medium. Vernieuwen het medium elke 2 - 3 dagen tijdens de gehele duur van de cultuur.

4. Live-cell imaging

  1. Voer beeldvorming met behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met langdurige live cell imaging vermogen. Neem een ingebouwde incubatiekamer met een temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%) controle. Schakel de microscoop en opwarmen het stadium ten minste 1 uur voor de proef begon.
    Opmerking: Gebruik objectief met lange werkafstand de waarneming en lokalisatie van cellen te optimaliseren in de 3D gels.
  2. Incubeer de gel in medium dat 5 pl fluorescerende cel tracker kleurstof gedurende 30 min nauwkeurige lokalisatie van de cellen in het 3D systeem mogelijk. Vervolgens verwijdert ongebonden kleurstof door drie keer wassen met 1 x PBS. Daarna voeg celkweekmedium van de schaal.
  3. Neem de schaal uit de incubator en plaats het op de microscoop podium (figuur 1D).
    Opmerking: beeldvorming van levende cellen kan beginnen in principe direct na de polymerisatie van de buitenste gel. Echter op dit moment de cellen in de binnenste gel nog niet verspreid. De migratie van de eerste cellen die zijn binnengevallen de buitenste gel, live-cell imaging 24 uur begint (afhankelijk van het type cel) na het begin van de cultuur onderzocht. Als vuistregel, ongeveer 12 - 14 dagen kweken zijn vereist voor de meeste van de cellen in de binnenste gel naar de buitenste gel voeren.
  4. Select Volumes of View (VOV's) in de regio's in de buitenste gel rond de binnenste gel. Na 24 uur incubatie wordt de celpopulatie hebben verspreid, staken de interface tussen de binnenste en buitenste gels, en begon de buitenste gel binnenvallen.
    1. Voor de VOV's, onder meer de gel regio's direct naast de gel-interface, tussenliggende gebieden en regio's dicht bij de rand van de buitenste gel 7. Gebieden uitsluiten dichter dan 50 urn van de bodem en zijvlakken, en uit de bovenkant van de gel, om eventuele randeffecten te vermijden. Elke VOV meet 647 × 647 × 100 micrometer 3 meestal (in x, Y en z-richtingen, respectievelijk) met 5 pm interval in de z -stack.
  5. Zorgen imaging modes, kanalen / filters, belichting tijden, en het beeld resoluties correct geselecteerd. Voor label-free beeldvorming van het collageen netwerk, gebruikt confocale microscopie reflectie gelijktijdig tijdens de time-lapse live cell imaging.
  6. Neem voorbeeldbestanden, plotten de intensiteit histogrammen, en de winsten en offsets aan te passen om voldoende signaal te observeren en verzadiging te voorkomen door ervoor te zorgen dat het histogram ligt tussen nul en de maximale intensiteit. Deze instellingen niet meer veranderen gedurende de looptijd van het experiment.
  7. Neem time-lapse beelden van de geselecteerde VOV's met een tijdsinterval Δ t, 10 min gedurende 8 uur (of langer indien nodig).

5. Cel Tracking en Data-analyse

  1. Het verrichten van kwantitatieve nabewerking van de beelden van de z -stack beelden met behulp Aangepast decor te beeldbewerkingssoftware.
    1. Segment de time-lapse beelden automatisch de 3D ​​cel posities (x, y, z, t) te selecteren.
    2. Voor elk frame, handmatig controleren van de juistheid lokalisatie en verwijder valse positieven te wijten aan cel puin en cellulaire uitsteeksels die mogelijk zijn aangezien voor cellen. Verwijder proliferatieve cellen van de analyse en splitsing overlappende of geschakelde cellen in afzonderlijke objecten.
  2. Genereer 3D time-lapse cel nummers van de cel coördinaten (x, y, z, t) in de vorige stap verkregen door het koppelen van de locatie van elke cel in de tijdreeks.
  3. Elimineer willekeurig en systeem geluid door het verwijderen van sporen korter dan een drempel rupslengte (meestal 20 min).
  4. Corrigeren voor monster drift door het aftrekken van de totale netto verplaatsingen van de tracks indien nodig.
  5. Bereken cel verplaatsing,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/>, en cel migratie afstand, Vergelijking 3 Van de waargenomen cel trajecten, waarbij een vector die de 3D-locatie van een cel op tijdstip en het aantal tijdstippen.
    1. Bereken cel snelheid S = d / (n • Δ t), waarin Δ t is de tijd tussen frames. Bereken cel migratie gerichtheid (of persistentie) met P = Ad / d. Deze eenvoudige maatregel van persistentie houdt in dat voor P = 0 de netto verplaatsing nul is en voor P = 1 de baan is een rechte directionele lijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De concentrische gel assay hier gepresenteerde werd uitgevoerd met sterk invasieve borstkankercellen MDA-MB-231, 2,4 mg / ml binnenste collageengel en een mobiele zaaidichtheid van = 2 x 10 6 cellen / ml, als voorbeeld. Zoals getoond in figuur 2, gewoonlijk na een paar dagen kweken werden de cellen geschonden binnenste buitenste gel interface en begon de buitenste gel binnenvallen. De celpopulatie uitgespreid hoofdzakelijk radiaal naar buiten.

De polymerisatieomstandigheden van de buitenste gel kan worden aangepast om de rol van de dichtheid en mechanische eigenschappen van de matrix op celmigratie eigenschappen te bestuderen. Figuur 3 toont de bewegingen van afzonderlijke cellen in de buitenste gels van 1,5 mg / ml, 2,4 mg / ml, en 4,0 mg / ml collageen, gepolymeriseerd bij pH 7,4. Confocale time-lapse beelden werden verkregen bij de grens tussen de binnenste en buitenste gel gedurende 8 uur, en de verplaatsing van de cellen in de drie verschillende collageen concentraties wordt aangegeven in witte pijlen. Afhankelijk van de cel zaaidichtheid en proliferatiesnelheid, -200 individuele cel trajecten kan meestal worden gewonnen en in elk monster geanalyseerd.

We kwantitatief geanalyseerd cel trajecten in 3 verschillende concentraties collageen in termen van gemiddelde nettoverplaatsing, afgelegde afstand, directionele persistentie en gemiddelde snelheid over 8 h beeldvorming (figuur 4). Waargenomen werd dat de gemiddelde verplaatsing en afstand waren het hoogst voor 4,0 mg / ml concentratie 58 urn en 141,5 urn respectievelijk hoewel er geen significant verschil in de verplaatsing en de afstand tussen de cellen in 2,4 mg / ml en 4,0 mg / ml gels . In 1,5 mg / ml gel, de gemiddelde verplaatsing en afstand waren kleinst. Deze observatie kan verschijnen recente rapporten die aantonen dat de invasie efficiëntie verlaagt in gels met een toename van collageen concentratie 11,12 tegenspreken. Merk echter op dat de verplaatsingen enafstanden in onze test worden gemeten van alle individuele mobiele nummers binnen overwegend radiaal naar buiten migreren bevolking. Deze parameters zijn dus veel minder gevoelig voor de snelstbewegende cel subpopulatie en niet volledig gedomineerd door stochastische bewegingen.

In alle gevallen is de totale afgelegde afstand (figuur 4B) is groter dan de netto verplaatsing (figuur 4A). Het definiëren van persistentie gewoon als de verhouding tussen de verplaatsing van de afstand, we verkregen persistentie van ~ 0,4 over alle gel omstandigheden (figuur 4C). Deze relatief lage persistentie weerspiegelt de intrinsiek zwakke directionele migratie van de cellen in onze test. We verwachten dat de aanwezigheid van directionele chemotactische stimuli of biochemische gradiënten persistentie toenemen, eventueel collageen concentratie afhankelijke wijze. Verder zagen we ook dat de gemiddelde snelheid van de cel migratie wi niet significant veranderenth collageenconcentratie (figuur 4D), waarschijnlijk vanwege de wisselwerking tussen matrix stijfheid (die toeneemt met collageen concentratie) en poriegrootte (die afneemt met collageen concentratie) 10, alsmede de spatiotemporele variatie migratie karakteristieken binnen de celpopulatie 7. De gemiddelde snelheid varieerde tussen 31 um / uur en 37,5 um / uur, met een minimum individuele cel snelheid van 7 um / uur en een maximale individuele cel snelheid van 114 pm / uur.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van de fasen om de concentrische gel 3D migratietestsysteem. (A) Vorming van het binnenste collageengel in het midden van de put in de glazen onderste schaal, die de cellen. (B) Vorming van de (acellulair) buitenste collageengel inkapseling van het binnenstegel. (C) Onderdompeling van de gels in celkweekmedium. De cellen worden vervolgens equilibreren en hechten aan het omringende vezelige matrix. Deze stap kan een paar uur tot 1 dag na de start van gel polymerisatie. (D) live-cell imaging, monitoring van de verspreiding van de celpopulatie in de buitenste gel.

Figuur 2
Figuur 2. Het verspreiden van de celpopulatie. (A) Na 12 dagen van cultuur, had MDA-MB-231 cellen de binnenste-outer gel-interface geschonden (groene stippellijn) en viel buiten in de oorspronkelijk acellulaire buitenste gel (schaal bar = 200 pm). De heldere gebieden zijn gebieden bezet door cellen, terwijl de donkere gebieden zijn cel-vrije regio's in deze afbeelding fase contrast. De gele rechthoeken geven de VOV's van belang, waar de 3D kankercel invasie werd gecontroleerd. De cells gemigreerd overwegend radiaal buitenwaarts, zoals aangegeven door de pijlen (B) Overlay confocale fluorescentie beeld van de migrerende MDA-MB-231-cellen (rood, geel als bedekt groen pseudo-gekleurde collageen met) van. en reflectie beeld van de collageen matrix ( groen). De pijlen wijzen naar de migratie richting van afzonderlijke cellen binnen een tijdspanne van 5 uur. Schaal bar = 50 um. (C) van de time-lapse beelden, titels van de cellen kan worden verkregen. Hier de cel tracks hebben een kleurcodering voor tijd, zoals aangegeven door de gekleurde balk (tijdschaal = 8 uur). Aangepast van Sun et al 7,10. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Celbeweging verschillende collageengel dichtheden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Analyse van de cel migratie trajecten. De migratie trajecten van de individuele MD-MBA-231 cellen meer dan 8 uur werden gekwantificeerd in termen van (A) netto verplaatsing, (B) afstand, (C) persistentie, en (D) betekenen snelheid voor verschillende buitenste gel collageen concentraties: 1,5 mg / ml, 2,4 mg / ml en 4,0 mg /ml. Time-lapse beelden werden verkregen nabij het grensvlak van de binnenste en buitenste gels. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) verkregen van meer dan 200 cellen trajecten in 3 onafhankelijke experimenten per conditie. Sterretjes (*) geven een statistisch significant verschil (p-waarde <0,01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken W. Zon en K. Jansen voor de kritische discussies, en erkennen ondersteuning door de Nano biomechanica Lab aan de National University of Singapore. NAK erkent ondersteuning door een Marie Curie Fellowship IIF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture incubator Fisher Scientific Pte Ltd Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope Nikon A1R Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR Life Technologies C2927
Glass-bottom dish IWAKI Cell Biology 3931-035 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer iN CYTO DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter Hanna Instruments pH 211
Nutragen Collagen Advanced BioMatrix #5010-D Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
pH meter Sartorius S/No 29153352 Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13, (19), R756-R759 (2003).
  2. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
  3. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
  4. Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (11), 743-747 (2012).
  5. Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
  6. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11, (7), 512-522 (2011).
  7. Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7, (2), 205-217 (2014).
  8. Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2, (4), 664-680 (2010).
  9. Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13, (3), 691-698 (2012).
  10. Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11, (99), 20140638 (2014).
  11. Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35, (25), 6954-6963 (2014).
  12. Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201, (7), 1069-1084 (2013).
  13. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (7), 445-457 (2009).
  14. Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28, (6), 370-379 (2013).
  15. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (8), 538-549 (2009).
  16. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31, (25), 6425-6435 (2010).
  17. Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20, (4), 360-367 (2014).
  18. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  19. Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13, (4), 839-849 (2014).
  20. Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125, (7), 1361-1374 (2006).
  21. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95, (11), 5374-5384 (2008).
  22. Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9, (8), 893-904 (2007).
  23. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105, (10), 2240-2251 (2013).
Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).More

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter