Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

गाढ़ा जेल प्रणाली 3 डी सेल प्रवास पर मैट्रिक्स microenvironment के biophysical का भूमिका का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/52735 Published: April 3, 2015

Summary

यांत्रिक गुणों और बाह्य मैट्रिक्स के microstructure दृढ़ता से कोशिकाओं के 3 डी प्रवास प्रभावित करते हैं। इन विट्रो विधि जनसंख्या और अलग-अलग सेल दोनों स्तरों पर biophysically चर वातावरण में spatiotemporal सेल प्रवास व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, वर्णित है।

Abstract

विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता ट्यूमर और कैंसर मेटास्टेसिस को भ्रूण के विकास से जीवन और घाव भरने के दौरान सेल कार्यों की एक विस्तृत विविधता में महत्वपूर्ण है। गहन अनुसंधान के प्रयासों के बावजूद, सेल प्रवास के बुनियादी जैव रासायनिक और biophysical सिद्धांतों अभी भी पूरी तरह से विशेष रूप से physiologically प्रासंगिक तीन आयामी (3 डी) microenvironments में, समझ नहीं रहे हैं। यहाँ, हम 3 डी सेल प्रवास व्यवहार का मात्रात्मक परीक्षा की अनुमति के लिए बनाया गया एक में इन विट्रो परख का वर्णन है। विधि पहले से खाली बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में विस्थापित करने के लिए सेल के mechanosensing क्षमता और प्रवृत्ति का लाभ उठाते। हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में कोलेजन जैल में अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण, एमडीए MB-231, का उपयोग करें। संस्कृति के हफ्तों में सेल की आबादी के प्रसार और व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रवास गतिशीलता रहते सेल इमेजिंग का उपयोग पर नजर रखी और spatiotemporally हल डेटा निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। और भी, विधि इस प्रकार सेल प्रवास पर microenvironment में biophysical कारकों की भूमिका की जांच के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली तरीका पेशकश, विविध कोशिकी matrices के लिए आसानी से अनुकूल है।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

कोशिकाओं के प्रवास ऐसी भ्रूण के विकास, haemostasis, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के वाहिका रोगों, सूजन, कैंसर और एक के रूप में रोग प्रक्रियाओं में विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल प्रवास अंतर्निहित जैव रासायनिक और biophysical कारकों विदारक सेलुलर कार्यों के बुनियादी सिद्धांतों को समझने के लिए, लेकिन यह भी इस तरह के ऊतक इंजीनियरिंग, विरोधी मेटास्टेसिस और विरोधी भड़काऊ दवा के विकास के रूप में विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, अग्रिम करने के लिए न केवल इसलिए मूल रूप से महत्वपूर्ण है। इन विवो अवलोकन तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है के बाद से, के प्रयासों का एक बहुत सेल प्रवास के इन विट्रो आवृत्ति पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो के तरीकों में काफी हद तक सबसे विशेष रूप से, दो आयामी (2 डी) सतहों पर assays के लिए खरोंच या डिजाइन परख दो घाव भरने की गई है। ऐसे assays सरल प्रयोगात्मक स्थापना का प्रस्ताव है, आसान live-सेल इमेजिंग, और सेल प्रवास अंतर्निहित विभिन्न जैव रासायनिक तंत्र में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। हालांकि, इन assays विवो प्रवास में समझ में महत्वपूर्ण पहलू हैं जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) वास्तुकला और remodeling, के लिए खाते में नहीं है। हाल ही में, यह तेजी से एक 3 डी संस्कृति मॉडल, अक्सर कोलेजन आधारित matrices के तीन में, बेहतर vivo स्थिति जैसा एक मंच प्रदान करता है कि सराहना की गई है। दरअसल, कोशिकाओं को विशेष रूप से की वजह से पर्यावरण 4 के विभिन्न dimensionality करने के लिए, 2 डी सतहों पर उन लोगों से अलग कर रहे हैं कि migrational गतिशीलता दिखा रहे हैं। इसके अलावा, मैट्रिक्स के biophysical और यांत्रिक गुणों संवेदनशीलता ट्यूमर सेल आक्रमण 6 के संदर्भ में, सहित सेल प्रवास 5 प्रभावित करते हैं।

यहाँ, हम तैयारी शर्तों के साथ आसानी से अलग किया जा सकता है कि biophysical गुणों के साथ ईसीएम में 3 डी सेल प्रवास व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कोशिकाओं रहे हैंएक 'आंतरिक जेल "में वरीयता प्राप्त और में बचने के लिए और शुरू में अकोशिकीय" बाहरी जेल "पर आक्रमण करने की अनुमति दी जाती है। विधि बारीकी सेल 7 mechanosensing से जुड़ा हुआ है, जो बाहरी जेल में सेल मुक्त क्षेत्रों में विस्थापित करने के लिए सेल की उपस्थिति पहचान करने की क्षमता है, और प्रवृत्ति पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, हम अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं, एमडी-एमबीए-231 द्वारा हमला ECMs के रूप में कोलेजन नेटवर्क को रोजगार। यांत्रिक गुणों और दोनों आंतरिक और बाह्य जैल के microstructure 8 देखते और physiologically प्रासंगिक शर्तों को प्राप्त करने के लिए 9 लक्षण वर्णन किया जा सकता है। सेल पटरियों के पुनर्निर्माण और विश्लेषण जनसंख्या के स्तर पर और व्यक्तिगत सेल दोनों स्तर पर spatiotemporal प्रवास व्यवहार का विस्तृत मात्रात्मक परीक्षा अनुमति देते हैं। महत्वपूर्ण बात है, गाढ़ा जेल प्रणाली की स्थापना के इस प्रकार में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की पेशकश की, विशेष रूप से कैंसर की कोशिकाओं पर हमला, पलायन कोशिकाओं द्वारा सामना में विवो ऊतक टोपोलॉजी mimicsसेल प्रवास और मेटास्टेसिस के शारीरिक तंत्र के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. सेल कटाई

  1. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर से एमडी-एमबीए-231 कोशिकाओं प्राप्त करते हैं। 0.5% trypsin-EDTA समाधान का उपयोग कर टिशू कल्चर प्लेट से कोशिकाओं को अलग। एक T25 फ्लास्क में सुसंस्कृत सेल के लिए trypsin-EDTA समाधान के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  2. 4 मिनट के लिए 200 × छ पर centrifugation द्वारा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में गोली कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, और resuspend कोशिकाओं संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर में।
  3. एक hemocytometer का उपयोग, ρ, सेल घनत्व की गणना।
    नोट: सेल वरीयता प्राप्त भीतरी जेल तैयार करने के लिए, सेल निलंबन पर बाद में 10 × अंतिम सेल बोने घनत्व तक पहुँचने के लिए पतला हो जाएगा। इसलिए, 10 × केंद्रित सेल निलंबन की आवश्यकता है।
  4. एक 10 × सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की गणना:
    1 समीकरण
    नोट: अंतिम सेल बोने घनत्व, अंतिम सी, लगभग 2 में से15; 10 6 कोशिकाओं / एमएल एमडी-एमबीए-231 कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है और इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है। अन्य बोने घनत्व भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए पता लगाया जा सकता है।
  5. गोली कोशिकाओं एक और चार मिनट के लिए 200 × छ पर centrifugation द्वारा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में समय है, और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  6. सेल clumping को कम करने के लिए अच्छी तरह से सीरम मुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से (1.3 चरण में गणना वी मध्यम) आवश्यक राशि में कोशिकाओं Resuspend।
    नोट: phenol लाल ऑटो फ्लोरोसेंट है, और प्रतिदीप्ति / reflectance इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। फिनोल लाल मुक्त माध्यम का प्रयोग सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए विचार किया जा सकता है।

कोलेजन समाधान की 2. तैयारी

  1. शेयर कोलेजन समाधान, 10 × पीबीएस बफर, मिल्ली क्यू एच 2 हे, 0.1 एम NaOH, और कई microcentrifuge ट्यूब प्राप्त करते हैं। समय से पहले कोलेजन के polymerization रोकने के लिए बर्फ पर सभी रखो, और बाँझ हालत बनाए रखें।
  2. एक बाँझ गिलास संतुलित करना37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में यह पूर्व वार्मिंग से नीचे पकवान।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के सभी संस्करणों में अच्छी तरह से 12 मिमी के साथ एक गिलास नीचे पकवान के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य पकवान प्रकार प्रयोग किया जाता है, तो तदनुसार संस्करणों को समायोजित।
  3. कोलेजन शेयर एकाग्रता के आधार पर भीतरी जेल (समाधान आई) के लिए 2.4 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान के 50 μl तैयार करने की जरूरत के लिए आवश्यक मात्रा की गणना।
    नोट: इनर जेल के लिए अन्य कोलेजन सांद्रता का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. एक बाँझ वातावरण (आमतौर पर एक जैव सुरक्षा हुड) में, धीरे धीरे कोमल घूमता साथ (2.3 कदम में गणना) कोलेजन स्टॉक समाधान के लिए आवश्यक राशि के लिए 10 × पीबीएस बफर के 5 μl जोड़ें। हवा बुलबुला गठन से बचने के लिए ध्यान रखना।
  5. Calibrated पीएच मीटर का उपयोग कर 0.1 एम NaOH का उपयोग कर 7.4 मिश्रण का पीएच को समायोजित करें। एक मोटा गाइड के रूप में, (राशि शेयर एकाग्रता और पीएच पर निर्भर करता है) 7.4 पीएच को करीब लाने के लिए लगभग 5 μl का उपयोग करें।
    नोट: संस्करणों इस में शामिल है कि नोटकदम मानक पीएच मीटर के उपयोग के लिए बहुत छोटा है। निम्नलिखित चाल में से एक का उपयोग करें:
    1. कई नमूने लिए कोलेजन समाधान तैयार करें। मानक पीएच मीटर का उपयोग कर थोक में पीएच को समायोजित करें और नमूने भर में कोलेजन समाधान वितरित।
    2. वैकल्पिक रूप से, बड़ी मात्रा में एक कोलेजन समाधान के पीएच को समायोजित (मैं। ई।, मानक पीएच मीटर का उपयोग करने की अनुमति है कि मात्रा)। अंतिम पीएच पीएच लाने की जरूरत NaOH के राशि ध्यान दें। संस्करणों नीचे पैमाने पर है और प्रयोग के लिए NaOH के उचित मात्रा में उपयोग करें। लिटमस पेपर का उपयोग पीएच मूल्य की पुष्टि करें।
    3. अन्यथा, अधिक सही कम मात्रा का पीएच को समायोजित करने के लिए एक माइक्रो पीएच इलेक्ट्रोड का उपयोग करें।
  6. ओ एच 2 का उपयोग कर μl 45 की मात्रा का हल लाओ समय से पहले कोलेजन के polymerization रोकने के लिए बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करें।

गाढ़ा जेल संस्कृति 3. संरचना

  1. पूर्व गर्म गिलास नीचे पकवान ले लो वें से (2.2 कदम देखें)ई इनक्यूबेटर।
  2. समाधान मैं Resuspend करने के लिए (1.5 कदम में तैयार) 10 × केंद्रित सेल निलंबन के 5 μl अच्छी तरह से जोड़ें। हवा बुलबुला गठन से बचने के लिए ध्यान रखना। मिश्रण अब 50 μl की एक मात्रा है और (अंतिम = 2 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल ग) अंतिम कोलेजन एकाग्रता (2.4 मिलीग्राम / एमएल) और सेल घनत्व में शामिल है।
  3. यह एक गुंबद के आकार छोटी बूंद (चित्रा 1 ए) के रूपों इतना है कि मैं अच्छी तरह से केंद्र के लिए धीरे-धीरे सेल युक्त समाधान के 20 μl जोड़ें। इस चरण में बुलबुला गठन से बचने के लिए ध्यान रखना। एक बुलबुला रूपों हैं, तो ध्यान से लेकिन जल्दी करने की कोशिश या तो इसे टूटना या एक विंदुक टिप का उपयोग कर इसे बाहर चूसना। धीरे भीतरी जेल में 45 मिनट के लिए भाजन जाने के लिए वापस इनक्यूबेटर में पकवान जगह है।
  4. (बाहरी, अकोशिकीय कोलेजन जेल के लिए) समाधान हे इस ऊष्मायन कदम के अंत से पहले के बारे में 15 मिनट तैयार करें।
    नोट: बाहरी जेल हालत कोलेजन एकाग्रता और polymerization पीएच के मामले में अलग किया जा सकता हैअलग microstructures के 10 के साथ नेटवर्क प्राप्त करते हैं। 7.4 के पीएच पर polymerized 4.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन जेल - इस प्रोटोकॉल में, एक 1.5 पर ध्यान केंद्रित।
    1. कोलेजन शेयर एकाग्रता के आधार पर, अंतिम एकाग्रता में कोलेजन समाधान ओ के 200 μl तैयार करने की जरूरत के लिए आवश्यक मात्रा की गणना।
  5. 10 × पीबीएस के 20 μl कोमल घूमता साथ (3.4 कदम में गणना) कोलेजन स्टॉक समाधान के लिए आवश्यक राशि के लिए धीरे-धीरे बफर जोड़ें। Calibrated पीएच मीटर के उपयोग के साथ 0.1 एम NaOH का उपयोग कर अंतिम पीएच के लिए मिश्रण का पीएच को समायोजित करें। पीएच समायोजन के संबंध में 2.5 कदम करने के लिए नोट देखें।
  6. ओ एच 2 का उपयोग कर μl 200 के अंतिम मात्रा का हल लाओ समय से पहले कोलेजन के polymerization रोकने के लिए बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करें।
  7. भीतरी जेल के 45 मिनट के polymerization के बाद इनक्यूबेटर से पकवान ले लो (कदम 3.3 देखें)। समाधान पूरी तरह से आंतरिक को शामिल किया गया है, ताकि धीरे, भीतरी जेल के शीर्ष पर समाधान ओ के 180 μl जोड़नेजेल और अच्छी तरह से (चित्रा 1 बी) भरता है।
    1. बाहरी जेल में गैर वर्दी फाइबर झुकाव पैदा कर सकते हैं जो समाधान, क्रियाशीलता के बिना ध्यान से इस चरण को पूरा करें। एक विंदुक टिप के साथ भीतरी जेल को छू से बचने के लिए ध्यान रखना, और बुलबुले या हवा जेब के गठन से बचने के लिए। एक बुलबुला रूपों हैं, तो ध्यान से लेकिन जल्दी करने की कोशिश या तो इसे टूटना या एक विंदुक टिप का उपयोग कर इसे बाहर चूसना। धीरे बाहरी जेल भाजन जाने के लिए इनक्यूबेटर में पकवान वापस जगह है।
  8. Polymerization के 45 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से पकवान ले लो। मोटे तौर पर संभाला अगर यह अभी भी नीचे की सतह से अलग कर सकते हैं, हालांकि जेल में पहले से ही काफी है, इस बिंदु पर जम जाना चाहिए।
    1. धीरे पकवान (चित्रा 1C) के लिए गरम सेल संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर डालना। जेल पूरी तरह से मध्यम में डूबे हुए है कि सुनिश्चित करें। संस्कृति की अवधि के दौरान 3 दिन - हर 2 मध्यम ताज़ा करें।

4। लाइव सेल इमेजिंग

  1. लंबी अवधि के रहने कक्ष इमेजिंग क्षमता से लैस एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग इमेजिंग प्रदर्शन। शामिल एक निर्मित में एक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सीओ 2 (5%) पर नियंत्रण के साथ ऊष्मायन चैम्बर। माइक्रोस्कोप पर स्विच और प्रयोग शुरू करने से पहले चरण में कम से कम एक घंटा तक गर्म।
    नोट: लंबे समय तक काम दूरी के साथ प्रयोग करें उद्देश्य लेंस 3 डी जैल में कोशिकाओं का अवलोकन और स्थानीयकरण अनुकूलन करने के लिए।
  2. 3 डी प्रणाली में कोशिकाओं की सटीक स्थानीयकरण अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर डाई के 5 μl युक्त मध्यम में जेल सेते हैं। बाद में, 1 × पीबीएस के साथ धोने से तीन बार अनबाउंड डाई को हटा दें। बाद में, डिश के लिए सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
  3. इनक्यूबेटर से पकवान ले लो और खुर्दबीन मंच (चित्रा -1) पर जगह है।
    नोट: लाइव सेल इमेजिंग सही बाहरी जेल के polymerization के बाद सिद्धांत रूप में शुरू कर सकते हैं। हालांकि इस बिंदु पर, कोशिकाओं मैंएन भीतरी जेल अभी तक नहीं फैला है। बाहरी जेल, जीना सेल इमेजिंग संस्कृति की दीक्षा के बाद (सेल प्रकार पर निर्भर करता है) 24 घंटा शुरू कर सकते हैं पर आक्रमण किया है कि पहली कोशिकाओं के प्रवास की जांच करने के लिए। एक मोटा गाइड के रूप में, लगभग 12 - संस्कृति के 14 दिनों के बाहरी जेल में प्रवेश करने के भीतरी जेल में कोशिकाओं के अधिकांश के लिए आवश्यक हैं।
  4. भीतरी जेल आसपास के बाहरी जेल में क्षेत्रों में देखें (Vov है) का चयन करें वॉल्यूम। ऊष्मायन के 24 घंटा, सेल की आबादी में फैल गया है जाएगा करने के बाद, आंतरिक और बाह्य जैल के बीच इंटरफेस को पार कर गया है, और बाहरी जेल पर आक्रमण करने के लिए शुरू कर दिया।
    1. Vov के लिए, तुरंत अगले बाहरी जेल 7 के outskirt के करीब जेल इंटरफेस, मध्यवर्ती क्षेत्रों, और क्षेत्रों को जेल क्षेत्रों में शामिल हैं। संभव बढ़त प्रभाव से बचने के लिए, जेल के ऊपर से और साथ ही, करीब नीचे और साइड सतहों से 50 माइक्रोन से क्षेत्रों को बाहर निकालें। प्रत्येक Vov आम तौर पर एक्स में (647 × 647 × 100 माइक्रोन तीन उपायोंZ -stack में 5 माइक्रोन अंतराल के साथ क्रमश: पहला, दूसरा, और z निर्देश,),।
  5. सुनिश्चित करें इमेजिंग मोड, चैनल / फिल्टर, जोखिम बार, और छवि प्रस्तावों को सही ढंग से चुने गए हैं। कोलेजन नेटवर्क के लेबल से मुक्त इमेजिंग के लिए, समय चूक रहते सेल इमेजिंग के दौरान एक साथ confocal reflectance माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
  6. , नमूना छवियों लो तीव्रता histograms साजिश, और पर्याप्त संकेत का पालन और हिस्टोग्राम शून्य और अधिकतम तीव्रता के बीच स्थित यह सुनिश्चित करके कि संतृप्ति से बचने के लिए लाभ और ऑफ़सेट समायोजित करें। प्रयोग की अवधि के दौरान किसी भी अधिक इन सेटिंग में बदलाव न करें।
  7. आठ बजे (या यदि आवश्यक हो तो लंबे समय तक) के लिए 10 मिनट की एक समय अंतराल, Δ टी के साथ, चयनित Vov के समय चूक छवियों ले लो।

5. सेल ट्रैकिंग और डेटा विश्लेषण

  1. Appropria का उपयोग कर Z -stack छवियों से मात्रात्मक छवि पोस्ट प्रसंस्करण के लिए बाहर ले ते इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर।
    1. खंड समय चूक छवियों को स्वचालित रूप से (एक्स, वाई, जेड, टी) में 3 डी सेल पदों पर चयन करने के लिए।
    2. हर फ्रेम के लिए, मैन्युअल स्थानीयकरण शुद्धता की जांच करने और कोशिकाओं के लिए गलत किया गया है हो सकता है कि सेल मलबे और सेलुलर उभार के कारण झूठी सकारात्मक हटा दें। अलग वस्तुओं में विश्लेषण और विभाजन अतिव्यापी या लॉग इन कोशिकाओं से proliferative कोशिकाओं निकालें।
  2. समय क्रम में प्रत्येक कोशिका के स्थान को जोड़ने के द्वारा पिछले चरण में प्राप्त सेल निर्देशांक (एक्स, वाई, जेड, टी) से 3 डी समय व्यतीत सेल पटरियों उत्पन्न करता है।
  3. एक सीमा से ट्रैक की लंबाई (आमतौर पर 20 मिनट) से भी कम पटरियों को हटाने के द्वारा बिना सोचे समझे और सिस्टम शोर को समाप्त।
  4. यदि आवश्यक हो तो पटरियों से समग्र शुद्ध विस्थापन घटाकर नमूना बहाव के लिए सही।
  5. सेल विस्थापन की गणना,Iles / ftp_upload / 52,735 / 52735eq2.jpg "चौड़ाई =" 80 "/>, और सेल प्रवास दूरी, 3 समीकरण , मनाया सेल प्रक्षेप पथ से, जहां समय में एक सेल के 3 डी स्थान का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक वेक्टर है और समय अंक की कुल संख्या है।
    1. Δ टी फ्रेम के बीच समय अंतराल है, जहां एस = डी / (एन • Δ टी) के रूप में सेल की गति की गणना। पी = Δd / डी का उपयोग करते हुए सेल प्रवास दिशात्मकता (या हठ) की गणना। हठ के इस सरल उपाय पी = 0 के लिए शुद्ध विस्थापन शून्य है और पी = 1 के लिए प्रक्षेपवक्र एक सीधे दिशात्मक लाइन है कि निकलता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

यहाँ प्रस्तुत गाढ़ा जेल परख अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, एमडीए MB-231, 2.4 मिलीग्राम / एमएल भीतरी कोलेजन जेल और एक उदाहरण के रूप में = 2 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल बोने घनत्व के साथ। चित्रा 2 में दिखाया गया है, जो आम तौर पर संस्कृति के कुछ ही दिनों के बाद, कोशिकाओं भीतरी-बाहरी जेल इंटरफ़ेस का उल्लंघन और बाहरी जेल पर आक्रमण करने के लिए शुरू कर दिया। सेल की आबादी त्रिज्यात बाहर मुख्य रूप से फैल गया।

बाहरी जेल के polymerization शर्तों सेल प्रवास विशेषताओं पर मैट्रिक्स के घनत्व और यांत्रिक गुणों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। 3 1.5 मिलीग्राम के बाहरी जैल में व्यक्ति की कोशिकाओं के आंदोलनों से पता चलता है / एमएल, 2.4 मिलीग्राम / एमएल, और 4.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन, 7.4 पीएच में polymerized। Confocal समय चूक छवियों आठ घंटे के लिए आंतरिक और बाहरी जेल के बीच सीमा पर हासिल कर लिया, और तीन अलग अलग कोलेजन ध्यान केंद्रित में कोशिकाओं के विस्थापन गयाtrations सफेद तीरों में संकेत दिया है। सेल बोने घनत्व और प्रसार की दर पर निर्भर करता है, ~ 200 व्यक्ति सेल trajectories के लिए आम तौर पर निकाला जा सकता है और प्रत्येक नमूने में विश्लेषण किया गया।

हम मात्रात्मक मतलब शुद्ध विस्थापन की शर्तें, दूरी की यात्रा की, दिशात्मक हठ में तीन अलग कोलेजन सांद्रता में सेल प्रक्षेप पथ का विश्लेषण किया है, और इमेजिंग के 8 घंटे (चित्रा 4) से अधिक गति से मतलब है। कोशिकाओं के बीच विस्थापन और दूरी में कोई महत्वपूर्ण अंतर 2.4 मिलीग्राम / एमएल और 4.0 मिलीग्राम / एमएल जैल में वहां गया था, हालांकि यह विस्थापन और दूरी क्रमश: 58 माइक्रोन और 141.5 मीटर, पर 4.0 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता के लिए उच्चतम थे मतलब है कि मनाया गया । 1.5 मिलीग्राम / एमएल जेल में, विस्थापन और दूरी सबसे छोटे थे मतलब है। इस अवलोकन आक्रमण दक्षता कोलेजन एकाग्रता 11,12 बढ़ाने के साथ जैल में कम हो जाती है कि पता चलता है कि हाल ही में रिपोर्ट का खंडन करने के लिए प्रकट हो सकता है। नोट, हालांकि यह है कि विस्थापन औरहमारे परख में दूरी मुख्यतः त्रिज्यात जावक पलायन आबादी के भीतर सभी व्यक्तिगत सेल पटरियों से मापा जाता है। इन मानकों इसलिए बहुत कम संभावना सबसे तेजी से बढ़ सेल उप-जनसंख्या के लिए कर रहे हैं और पूरी तरह से स्टोकेस्टिक आंदोलनों का प्रभुत्व नहीं कर रहे हैं।

सभी मामलों में, (4B चित्रा) कवर कुल दूरी शुद्ध विस्थापन (चित्रा -4 ए) की तुलना में अधिक था। बस दूरी के विस्थापन के बीच अनुपात के रूप में दृढ़ता की परिभाषा, हम सब जेल शर्तों (चित्रा 4C) भर में 0.4 ~ के हठ प्राप्त की। यह अपेक्षाकृत कम हठ हमारे परख में कोशिकाओं की आंतरिक रूप से कमजोर दिशात्मक प्रवास को दर्शाता है। हम दिशात्मक chemotactic उत्तेजनाओं या जैव रासायनिक ढ़ाल की उपस्थिति संभावित कोलेजन एकाग्रता पर निर्भर तरीके, हठ वृद्धि होगी आशा करते हैं कि। इसके अलावा, हम भी सेल प्रवास का मतलब गति काफी वाई बदल नहीं किया था कि मनायाक्योंकि (कोलेजन एकाग्रता के साथ बढ़ जाता है) मैट्रिक्स कठोरता और 10 है, साथ ही सेल की आबादी सात भीतर प्रवास विशेषताओं के spatiotemporal भिन्नता (कोलेजन एकाग्रता के साथ कम हो जाती है) छेद के आकार के बीच परस्पर क्रिया की संभावना वें कोलेजन एकाग्रता (चित्रा 4D),। मतलब गति 7 माइक्रोन / घंटा की एक न्यूनतम व्यक्तिगत सेल गति और 114 माइक्रोन / घंटा की अधिकतम व्यक्तिगत सेल की गति के साथ, 31 माइक्रोन / घंटा और 37.5 माइक्रोन / घंटा के बीच विविध।

चित्र 1
गाढ़ा जेल 3 डी प्रवास परख की स्थापना में शामिल कदम की चित्रा 1. योजनाबद्ध। (ए) गिलास नीचे डिश में अच्छी तरह के केंद्र में आंतरिक कोलेजन जेल के गठन, कोशिकाओं से युक्त। (बी) के गठन (अकोशिकीय) भीतरी encapsulating बाहरी कोलेजन जेलजेल। (सी) सेल संस्कृति माध्यम में जैल का विसर्जन। कोशिकाओं तो संतुलित करना और आसपास रेशेदार मैट्रिक्स को संलग्न करने के लिए अनुमति दी जाती है। यह कदम जेल polymerization के दीक्षा के बाद एक दिन के लिए कुछ घंटे लग सकते हैं। (डी) लाइव सेल इमेजिंग, बाहरी जेल में सेल की आबादी के प्रसार की निगरानी।

चित्र 2
चित्रा 2. सेल की आबादी का प्रसार। (ए) संस्कृति के 12 दिनों के बाद, एमडीए MB-231 कोशिकाओं भीतरी-बाहरी जेल इंटरफ़ेस का उल्लंघन किया था (ग्रीन लाइन धराशायी) और मूल अकोशिकीय बाहरी जेल (पैमाने बार = 200 माइक्रोन) में बाहर आक्रमण किया। गहरा क्षेत्रों में इस चरण विपरीत छवि में सेल मुक्त क्षेत्रों के हैं जबकि उज्जवल क्षेत्रों, कोशिकाओं द्वारा कब्जा क्षेत्रों के हैं। पीले रंग की आयतों 3 डी कैंसर सेल आक्रमण नजर रखी थी, जहां ब्याज की Vov का प्रतिनिधित्व करते हैं। सीईतीर द्वारा संकेत के रूप में LLS, त्रिज्यात जावक मुख्य रूप से माइग्रेट पलायन एमडीए MB-231 कोशिकाओं के confocal प्रतिदीप्ति छवि (लाल, हरी छद्म रंग कोलेजन से मढ़ा जब पीला) (बी) ओवरले। कोलेजन मैट्रिक्स की और reflectance छवि ( हरा)। तीर 5 घंटे की समय अवधि के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रवास दिशा को इंगित करें। स्केल बार = 50 माइक्रोन। समय चूक छवियों से (सी), कोशिकाओं की पटरियों प्राप्त किया जा सकता है। यहां सेल पटरियों रंग कोडित रंग पट्टी (timescale के = 8 बजे) ने संकेत दिया है, के रूप में समय के लिए कर रहे हैं। सूर्य एट अल 7,10 से अनुकूलित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
अलग कोलेजन जेल घनत्व में चित्रा 3. सेल आंदोलन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
विश्लेषण सेल प्रवास trajectories के चित्रा 4। 8 बजे (ए) के शुद्ध विस्थापन, (बी) दूरी के संदर्भ में मात्रा निर्धारित किया गया व्यक्ति एमडी-एमबीए-231 कोशिकाओं के प्रवास प्रक्षेप पथ, (सी) हठ, और (डी) मतलब विभिन्न बाहरी जेल कोलेजन सांद्रता के लिए गति: 1.5 मिलीग्राम / एमएल, 2.4 मिलीग्राम / एमएल, और 4.0 मिलीग्राम /एमएल। समय चूक छवियों भीतरी और बाहरी जैल के इंटरफेस के पास हासिल किया गया। डेटा मतलब ± हर हालत में तीन स्वतंत्र प्रयोगों में 200 से अधिक सेल प्रक्षेप पथ से प्राप्त मतलब (SEM) की मानक त्रुटि रहे हैं। तारक (*) सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (पी मूल्य <0.01) निरूपित।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों महत्वपूर्ण विचार विमर्श के लिए डब्ल्यू सूर्य और लालकृष्ण Jansen धन्यवाद, और सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में नैनो बायोमैकेनिक्स लैब द्वारा समर्थन को स्वीकार करते हैं। NAK एक मैरी क्यूरी IIF फैलोशिप द्वारा समर्थन मानता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture incubator Fisher Scientific Pte Ltd Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope Nikon A1R Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR Life Technologies C2927
Glass-bottom dish IWAKI Cell Biology 3931-035 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer iN CYTO DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter Hanna Instruments pH 211
Nutragen Collagen Advanced BioMatrix #5010-D Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
pH meter Sartorius S/No 29153352 Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13, (19), R756-R759 (2003).
  2. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
  3. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
  4. Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (11), 743-747 (2012).
  5. Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
  6. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11, (7), 512-522 (2011).
  7. Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7, (2), 205-217 (2014).
  8. Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2, (4), 664-680 (2010).
  9. Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13, (3), 691-698 (2012).
  10. Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11, (99), 20140638 (2014).
  11. Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35, (25), 6954-6963 (2014).
  12. Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201, (7), 1069-1084 (2013).
  13. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (7), 445-457 (2009).
  14. Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28, (6), 370-379 (2013).
  15. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (8), 538-549 (2009).
  16. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31, (25), 6425-6435 (2010).
  17. Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20, (4), 360-367 (2014).
  18. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  19. Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13, (4), 839-849 (2014).
  20. Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125, (7), 1361-1374 (2006).
  21. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95, (11), 5374-5384 (2008).
  22. Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9, (8), 893-904 (2007).
  23. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105, (10), 2240-2251 (2013).
गाढ़ा जेल प्रणाली 3 डी सेल प्रवास पर मैट्रिक्स microenvironment के biophysical का भूमिका का अध्ययन करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).More

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter