Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

doi: 10.3791/52735 Published: April 3, 2015

Summary

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Abstract

göç hücrelerin yeteneği tümör ve kanser metastazı embriyonik gelişim yaşamın ve yara iyileşmesi süresince hücre fonksiyonları geniş bir yelpazede çok önemlidir. Yoğun araştırma çabalarına rağmen, hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel prensipler hala tam özellikle fizyolojik ilgili üç boyutlu (3D) mikroçevrelerde, anlaşılmış değildir. Burada, 3B hücre göçü davranışları kantitatif olarak incelenmesini sağlamak için tasarlanmış bir in vitro testi. yöntemi daha önce boş hücre dışı matriks (ECM) göç etmek hücrenin mechanosensing yeteneği ve eğilimi patlatır. Bir model sistem olarak kollajen jel oldukça invazif göğüs kanseri hücrelerinin invazyonu, MDA-MB-231 kullanımı. kültür hafta boyunca hücre popülasyonunun yayılması ve tek tek hücrelerin göç dinamikleri canlı hücre görüntüleme kullanılarak izlenir ve spatiotemporally çözülmüş verilerin çıkarılması için analiz edilebilir. AyrıcaYöntem böylece hücre göçü üzerinde mikroçevresinin biyofiziksel faktörlerin rolünü araştırmak için basit ama güçlü bir şekilde sunan, çeşitli hücre dışı matrisler için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücrelerin göç embriyonik gelişme, hemostaz ve bağışıklık tepkisi gibi gibi vasküler hastalıklar, enflamasyon ve kanser 1 gibi patolojik süreçlerde çeşitli fizyolojik tepkiler içindeki önemli bir rol oynar. Hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel faktörleri Kesme hücresel fonksiyonların temel ilkelerini anlamak için değil, aynı zamanda böyle bir doku mühendisliği anti-metastaz ve anti-enflamatuar ilaç geliştirme gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar ilerletmek için, sadece bu nedenle temel olarak önemlidir. In vivo gözlem teknik açıdan zor olduğundan, çabalarının bir sürü hücre göçü in vitro recapitulation odaklanmıştır.

Hücre göçü incelemek için in vitro yöntemler büyük ölçüde en önemlisi, iki boyutlu (2D) yüzeylerde deneyleri için çizik olarak tasarlanmış veya tahlil 2 yara iyileşmesi edilmiştir. Bu tür deneyler basit deney düzeneği sunuyoruz, kolay yaşanılırhücre görüntüleme ve hücre göçü yatan çeşitli biyokimyasal mekanizmaların yararlı açılımlar sağlamaktadır. Bununla birlikte, bu deneyler, in vivo göç anlaşılmasında kritik yönleri olan hücre dışı matris (ECM), mimari ve yeniden modellenmesi hesaba katmaz. Son zamanlarda, giderek artan bir şekilde 3B kültürü modeli, genellikle kolajen-esaslı matrisler 3, daha iyi in vivo durum benzer bir platform temin ettiği takdir edilecektir. Nitekim, hücreler nedeniyle özellikle çevre 4 farklı boyutluluk için, 2B yüzeylerde olanlardan farklıdır Göçmen dinamikleri sergilerler. Ayrıca, matris biyo-fiziksel ve mekanik özellikleri, hassas tümör hücre istilası 6 bağlamında da dahil olmak üzere, hücre göçünü 5 etkiler.

Burada, biz hazırlık koşulları ile kolayca çeşitli olabilir biyofiziksel özellikleri ile ECM 3D hücre göçü davranışlarını incelemek için bir yöntem mevcut. hücrelerdirBir "iç gel" numaralı seribaşı ve içine kaçmak ve başlangıçta Aselüler "dış jel" işgal izin verilir. yöntem yakından hücre 7 mechanosensing bağlantılı dış jel, hücre-serbest bölgelere, göç hücrenin varlığını tanımak yeteneği ve eğilimine dayanır. Bu çalışmada, biz son derece invaziv meme kanseri hücrelerinin, MD-MBA-231 tarafından işgal ECMs olarak kollajen ağları kullanır. mekanik özellikler ve hem iç hem de dış jellerin mikro 8 olarak ayarlanmış ve fizyolojik olarak uygun koşulları elde etmek için 9 karakterize edilebilir. Hücre parça İmar ve analiz nüfus düzeyi ve bireysel hücre düzeyinde hem de uzaysal göç davranışının ayrıntılı nicel incelenmesine olanak. Önemlisi, konsantrik jel sistemi kurulumu ve böylece önemli anlayışlar sunarak, özellikle kanser hücrelerini istila, hücreler göç ile karşı karşıya in vivo doku topolojisini taklitHücre göçü ve metastaz fiziksel mekanizmaları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hücre Hasat

  1. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe MD-MBA-231 hücreleri elde edilir. % 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Bir T25 şişesi içinde kültürlenmiş bir hücre için Tripsin-EDTA solüsyonu, 1 ml kullanın.
  2. 4 dakika için 200 x g'da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatanı havalandırın, ve tekrar süspansiyon hücreleri kültür ortamı, 5 ml.
  3. Bir hemasitometre kullanarak, ρ, hücre yoğunluğu sayısı.
    Not: Hücre numaralı seribaşı iç jel hazırlamak için, hücre süspansiyonu daha sonra 10 × nihai hücre tohumlama yoğunluğu ulaşmak için seyreltilmiş edilecektir. Bu nedenle, 10 x konsantre hücre süspansiyonu gereklidir.
  4. 10 x hücre konsantrasyonunu elde etmek için gerekli ortamın miktarı hesaplanır:
    Denklem 1
    Not: nihai hücre tohum yoğunluğu son C, yaklaşık 215; 10 6 hücre / ml MD-MBA-231 hücreleri için tavsiye edilir ve bu protokol kullanılır. Diğer tohumlama yoğunlukları da diğer hücre tipleri için keşfedilebilir.
  5. Pelet hücreleri bir kez daha, 4 dakika için 200 x g'da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde süresi ve süpernatan aspire.
  6. Hücre topaklanma en aza indirmek için iyice serumsuz hücre kültür ortamının (adım 1.3 hesaplanan V ortam) gerekli miktarda tekrar süspansiyon hücreleri.
    Not: Fenol kırmızı otomatik floresan ve floresan / yansıma görüntüleme engelleyebilir. Fenol kırmızı içermeyen ortamda kullanılması en iyi görüntü kalitesini elde etmek için kabul edilebilir.

Kollajen Çözümleri 2. Hazırlık

  1. Stok kolajen çözeltisi, 10 x PBS tampon, Milli-Q, H2, O, 0.1 M NaOH ve çeşitli mikrosantrifüj tüpleri elde edilir. Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm tutun, ve steril durumunu korumak.
  2. Steril cam-dengeye37 ° C inkübatör içinde ön ısıtmaya göre alt yemek.
    Not: Bu protokol tüm birimleri de 12 mm cam alt çanak için optimize edilmiştir. Diğer çanak tipi kullanılırsa, buna hacimleri ayarlayın.
  3. Kollajen stok konsantrasyonuna bağlı olarak, iç jeli (çözelti l) 2.4 mg / ml kolajen çözeltisi 50 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır.
    Not: İç jeli diğer kollajen konsantrasyonları da kullanılabilir.
  4. Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı) 'de yavaş yavaş hafif döndürme ile (adım 2.3 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda 10 x PBS tamponu 5 ul ilave edin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin.
  5. Kalibre pH metre kullanılarak 0.1 M NaOH ile 7.4'e karışımın pH ayarlayın. Bir kaba bir kılavuz olarak, (miktar stok konsantrasyonu ve pH değerine bağlı olarak değişir) 7.4 pH yakın getirmek için yaklaşık 5 ul kullanın.
    Not: hacimleri bu işin unutmayınadım standart bir pH metre kullanımı için çok küçüktür. Aşağıdaki hileler birini kullanın:
    1. Birden çok numune için kolajen solüsyonları hazırlayın. Standart pH metre kullanılarak toplu pH ayarlayın ve numuneler arasında kollajen çözümleri dağıtmak.
    2. Seçenek olarak ise, daha büyük bir hacimde bir kolajen çözeltisi pH'ın ayarlanması, (i. E., Standart bir pH metre kullanımına izin hacmi). Nihai pH, pH getirmek için gereken NaOH miktarını not edin. Hacimleri küçültün ve deney için NaOH uygun miktarda kullanın. Turnusol kağıdı kullanılarak pH değeri onaylayın.
    3. Aksi takdirde, daha doğru bir şekilde az miktarda pH değerini ayarlamak için bir mikro pH elektrodu kullanın.
  6. O. H 2 kullanarak ul 45 bir hacme çözüm getir Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın.

Konsantrik Jel Kültür 3. Oluşumu

  1. Önceden ısıtılmış cam alt çanak alın th (adım 2.2 bakınız)E inkübatör.
  2. Çözelti I yeniden askıya almak için (adım 1.5 hazırlandı) 10 x konsantre hücre süspansiyonu 5 ul iyice ekleyin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin. Karışım, hemen 50 ul arasında değişen bir hacme sahip ve (nihai = 2 x 10 6 hücre / ml c) Nihai kollajen konsantrasyonu (2.4 mg / ml) ve hücre yoğunluğu içerir.
  3. Bu kubbe şeklinde bir damla (Şekil 1A) oluşturan bu yüzden de merkezine yavaş hücre içeren bir çözeltinin 20 ul ekle. Bu aşamada kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça iç jel 45 dakika süreyle polimerize izin geri inkübatör çanak koyun.
  4. (Dış, aselüler kollajen jel için) çözüm O bu inkübasyon adımı bitmeden yaklaşık 15 dakika hazırlayın.
    Not: dış jel durumu kollajen konsantrasyonu ve polimerizasyon pH koşullarını değişik olabilirFarklı mikroyapılanna 10 ile ağları edinin. 7.4 arasında bir pH değerinde polimerize 4.0 mg / ml kolajen jel - Bu protokolde, 1.5 odaklanır.
    1. Kollajen stok konsantrasyonuna dayalı olarak, nihai konsantrasyonda kolajen çözeltisi O 200 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır.
  5. 10 x PBS içinde 20 ul yumuşak döndürme ile (adım 3.4 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda yavaş yavaş tampon ekleyin. Kalibre pH metre kullanımı ile, 0.1 M NaOH ile son pH karışımın pH ayarlayın. PH ayarlaması ile ilgili 2,5 adıma nota bakınız.
  6. O H2 kullanılarak ul 200 ul son hacme çözüm getirmek Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın.
  7. İç jel 45 dakika polimerizasyondan sonra inkübatör çanak alın (adım 3.3). Çözelti tamamen iç kaplayacak şekilde yavaşça iç jelinin üzerine çözelti, O 180 uljel ve kuyu (Şekil 1B) doldurur.
    1. Dış jelde homojen olmayan bir lif yönelimleri yol açabilir çözeltisi, karıştırma olmadan dikkatlice adımı gerçekleştirir. Bir pipet ile iç jel dokunmaktan kaçınmak için özen ve kabarcıkları veya hava ceplerinin oluşumunu önlemek için. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça dış jel, polimerik maddelerin izin inkübatör çanak geri yerleştirin.
  8. Polimerizasyon 45 dakika sonra inkübatör çanak alın. yaklaşık olarak kullanıldığı takdirde yine alt yüzeyinden ayırmak, ancak jel zaten oldukça, bu noktada katılaşan olmalıdır.
    1. Yavaşça çanak (Şekil 1C) ısıtıldı hücre kültür ortamının 2 ml dökün. Jel tamamen ortamında batık emin olun. Kültür süresi boyunca 3 gün - her 2 orta yenileyin.

4. Canlı hücre Görüntüleme

  1. Uzun vadeli canlı hücre görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. Dahil dahili bir sıcaklığa (37 ° C) ve CO2 (% 5), kontrol ile inkübasyon odası. Mikroskop açın ve deneye başlamadan önce evre en az 1 saat ısıtın.
    Not: Uzun çalışma mesafesi ile kullanın objektif 3D jellerin hücrelerin gözlem ve lokalizasyonu optimize etmek.
  2. 3D sistemindeki hücrelerin doğru belirlenmesine olanak tanımaktadır, 30 dakika için floresan hücre izleyici boya 5 ul ihtiva eden bir ortam içinde jel inkübe edin. Daha sonra, 1 x PBS ile yıkanarak üç kez bağlanmamış boya çıkarın. Daha sonra, çanak hücre kültür ortamı ilave edin.
  3. Inkübatör çanak alın ve mikroskop aşamasında (Şekil 1D) üzerine yerleştirin.
    Not: Canlı hücre görüntüleme sağ dış jel polimerizasyon sonrası prensip olarak başlayabilirsiniz. Bununla birlikte bu noktada, hücreler in iç jel henüz yayılmış değil. Dış jel, canlı hücre görüntüleme kültürünün başlatılmasından sonra (hücre tipine göre) 24 saat başlayabilir işgal ilk hücrelerinin göçünü incelemek. Bir kaba bir kılavuz olarak, yaklaşık 12 - kültür 14 gün dış jel girmek iç jel hücrelerin çoğu için gereklidir.
  4. İç jel çevreleyen dış jel bölgelerde Manzaralı (VoV en) Seç Birimleri. Kuluçkadan 24 saat, hücre popülasyonu, yayılmış olur sonra, iç ve dış jel arasındaki ara yüzü geçti ve dış jel işgal başladı.
    1. VoV en için, hemen yanındaki dış jel 7, olay yakın jel arayüzü, ara bölgeler ve bölgelere jel bölgelerini içerir. Mümkün olan kenar etkileri önlemek için, jel üst hem de daha yakın bir alt ve yan yüzeyler ile 50 um den bölge hariç. Her VoV tipik x (647 × 647 × 100 mm 3 ölçerZ -stack 5 um aralığında olan, sırasıyla, y ve z, tarifi).
  5. Emin olun görüntüleme modları, kanallar / filtreler, pozlama süreleri ve görüntü çözünürlükleri doğru seçilir. Kollajen ağının etiketi ücretsiz görüntüleme için, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme sırasında eş zamanlı olarak konfokal yansıma mikroskopi kullanın.
  6. Örnek görüntüleri alın yoğunluk histogramlar arsa ve yeterli sinyal gözlemlemek ve histogram sıfır ve maksimum yoğunluğu arasında yatıyor sağlayarak doygunluk önlemek için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Deney süresi boyunca bir daha bu ayarları değiştirmeyin.
  7. 8 saat (veya gerekirse daha uzun) için 10 dakika, bir zaman aralığı, Δ t ile, seçilen VoV yılların zaman atlamalı görüntüleri çekin.

5. Hücre İzleme ve Veri Analizi

  1. ÖDENEK kullanarak z -stack görüntülerden kantitatif görüntü post-processing yürütmek te görüntü işleme yazılımı.
    1. Segment time-lapse görüntüleri otomatik olarak (x, y, z, t) 3D hücre pozisyonları seçin.
    2. Her çerçeve için, elle lokalizasyon doğruluğunu kontrol ve hücreler için yanılmış olabilir hücre artıkları ve hücresel çıkıntılar nedeniyle yanlış pozitif kaldırın. Farklı nesnelere analiz ve bölünmüş örtüşen veya bağlı hücreleri çoğalma hücreleri çıkarmak.
  2. Zaman dizisi her hücrenin yerini bağlayarak önceki aşamada elde edilen hücre koordinatları (x, y, z, t), 3D hızlandırılmış hücre parçaları üretir.
  3. Bir eşik hat uzunluğu (genellikle 20 dk) daha kısa parçaları kaldırarak rastgele ve sistem gürültüsünü ortadan kaldırın.
  4. Gerekirse parça gelen toplam net değiştirmeleri çıkarılarak örnek sürüklenme için düzeltin.
  5. Hücre deplasman hesaplayın,iles / ftp_upload / 52.735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/> ve hücre göçü mesafesi, Denklem 3 Gözlenen hücre yörüngeleri, burada zaman, bir hücrenin 3D konumunu temsil eden bir vektördür ve zaman noktalarının toplam sayısıdır.
    1. Δ t kare arasındaki zaman aralığı S d = / (n • Δ t) gibi hücre hızı, hesaplayın. P = Δd / d kullanarak hücre göçü yönlülük (veya sebat) hesaplayın. Sebat Bu basit önlem P = 0 net deplasman sıfır ve p = 1 için yörünge düz yönlü çizgi olduğunu ima eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada yer alan eş-merkezli jel tahlili, yüksek oranda istilacı meme kanseri hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi, MDA-MB-231, 2.4 mg / ml'lik bir iç kollajen jel ve bir örnek olarak = 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir hücre tohumlama yoğunluğuna sahip. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tipik olarak kültür birkaç gün sonra, hücreler, iç-dış jel arayüzü ihlal ve dış jel işgal başladı. hücre popülasyonu radyal olarak dışarı doğru ağırlıklı olarak yayıldı.

Dış jel polimerizasyon koşulları hücre göçü özelliklerine matrisinin yoğunluğu ve mekanik özelliklerin rolünü incelemek için modifiye edilebilir. 3 1.5 mg dış jel içinde bulunan hücrelerin hareketleri göstermektedir / ml, 2.4 mg / ml ve 4.0 mg / ml kolajen, pH 7.4 ile polimerize edilir. Konfokal zaman atlamalı görüntüler 8 saat süre ile, iç ve dış jel arasındaki sınırda elde edilen ve üç farklı kolajen konsantrasyonunda hücre değiştirme edildiyerel yönetim bu beyaz oklarla belirtilmiştir. Hücre tohum yoğunluğu ve proliferasyon oranına bağlı olarak, yaklaşık 200 tek tek hücre yörüngeleri tipik olarak elde edilebilir ve her bir numune içinde analiz edilmiştir.

Biz kantitatif ortalama net deplasman açısından, katedilen mesafe, yön sebat 3 farklı kollajen konsantrasyonları hücre yörüngeleri analiz ve görüntüleme 8 saat (Şekil 4) üzerinde hız demek. Hücreler arasında yer değiştirmesi ve mesafe anlamlı bir fark 2.4 mg / ml ile 4.0 mg / ml jellerde olmasına rağmen bu, yer değiştirme ve mesafe sırasıyla 58 um ve 141.5 um, de 4.0 mg / ml arasında bir konsantrasyonda en yüksek olduğu anlamına gözlenmiştir . 1.5 mg / ml jel, deplasman ve mesafe küçük olduğunu anlamına gelir. Bu gözlem işgal verimliliği kollajen konsantrasyonu 11,12 artan jeller azaldığı gösteriyor son raporlar çelişiyor gibi görünebilir. Ancak, unutmayın ki deplasmanları vetahlilimizde mesafeler esas olarak radyal olarak dışarı doğru göç nüfus içinde tüm bireysel hücre parçaları ölçülür. Bu parametreler, bu nedenle daha az duyarlı hızlı hareket hücre alt popülasyonuna ve tamamen stokastik hareketler hakim değildir.

Her durumda, (Şekil 4B) katedilen toplam mesafe net deplasman (Şekil 4A) daha büyüktü. Sadece mesafeye yerinden arasındaki oran olarak sebat tanımlanması, hepimiz jel koşullarında (Şekil 4C) arasında 0.4 ~ ısrarını aldı. Bu nispeten düşük kalıcılık bizim deneyde hücrelerin özünde zayıf yönlü göç yansıtır. Biz yönlü kemotaktik uyaranlara veya biyokimyasal geçişlerini varlığı potansiyel kollajen konsantrasyonu-bağımlı bir şekilde, sebat artacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, biz de hücre göçü ortalama hızı önemli ölçüde wi değişmedi görülmektedirçünkü (kolajen konsantrasyonu ile artar), matris sertliği ve 10, hem de hücre popülasyonunun 7 içinde göç özelliklerine uzaysal değişim (kollajen konsantrasyonu düşer) gözenek büyüklüğü arasındaki etkileşim olasılığı inci kollajen konsantrasyonu (Şekil 4D). ortalama hız, 7 um / saat en az tek tek hücre hızı ve 114 mm / saatlik bir maksimum tek hücre hızı, 31 mm / saat ve 37.5 um / s arasında değişmiştir.

Şekil 1,
Konsantrik jel 3D göç tahlil kurma alan adımları Şekil 1. şematik. (A) cam alt çanak iyi merkezinde iç kollajen jel oluşumu, hücreleri içeren. (B) oluşumu (aselüler) iç kapsülleme dış kollajen jeljel. (C) hücre kültür ortamı içinde jellerin daldırma. Hücreler daha sonra dengeye ve çevreleyen lifli matris bağlanmasına izin verilir. Bu adım jel polimerizasyon başlandıktan sonra 1 gün öncesine kadar bir kaç saat sürebilir. (D) Canlı hücre görüntüleme, dış jel içine hücre popülasyonunun yayılmasını izlemek.

Şekil 2,
Şekil 2. hücre popülasyonunun yayılması. (A) kültür 12 gün sonra, MDA-MB-231 hücreleri iç-dış jel arayüzü ihlal ettiğini (yeşil kesikli çizgi) ve başlangıçta aselüler dış jel (ölçek çubuğu = 200 mikron) içine dışa işgal. koyu alanlar bu faz kontrast görüntüsündeki hücre içermeyen bölgeler ise parlak alanları, hücrelerin kapladığı bölgelerdir. Sarı dikdörtgenler 3D kanser hücresi invazyonu izlendi ilgi, bir VoV 's temsil eder. ceoklarla gösterildiği gibi LLS, radyal olarak dışarı doğru ağırlıklı olarak göç göç, MDA-MB-231 hücrelerinin konfokal floresan görüntü (kırmızı, yeşil sözde renkli kolajen ile kaplanmış sarı) (B) Kaplama. Kolajen matrisin ve yansıtma görüntü ( yeşil). Oklar 5 saatlik bir süre içinde tek tek hücrelerin göç yönüne işaret etmektedir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Time-lapse görüntüleri Gönderen (C), hücrelerin izleri elde edilebilir. İşte hücre parçaları renk kodlu renk çubuğu (timescale = 8 saat) tarafından belirtildiği gibi, zaman içindir. Güneş ve ark 7,10 den uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Farklı kollajen jel yoğunlukları Şekil 3. Hücre hareketi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Analiz hücre göçü yörüngeleri Şekil 4.. 8 üzerinde saat (A) net deplasman, (B) mesafe açısından ölçüldü bireysel MD-MBA-231 hücrelerinin göç yörüngeleri, (C) sebat ve (D) demek Farklı dış jel kolajen konsantrasyonları hızı: 1.5 mg / ml, 2.4 mg / ml ve 4.0 mg /mi. Time-lapse görüntüleri iç ve dış jellerin arabiriminin yanında satın alındı. Veriler ortalama ± her durumda 3 bağımsız deneyde 200'ün hücre yörüngeleri elde edilen ortalama (SEM) standart hatasını ifade etmektedirler. Yıldız (*) istatistiksel olarak anlamlı fark (p-değeri <0.01) belirtmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar kritik tartışmalar W. Sun ve K. Jansen teşekkür ve Singapur Ulusal Üniversitesi Nano Biyomekanik Lab tarafından destek kabul. NAK Marie Curie IIF Bursu ile destek kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture incubator Fisher Scientific Pte Ltd Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope Nikon A1R Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR Life Technologies C2927
Glass-bottom dish IWAKI Cell Biology 3931-035 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer iN CYTO DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter Hanna Instruments pH 211
Nutragen Collagen Advanced BioMatrix #5010-D Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
pH meter Sartorius S/No 29153352 Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13, (19), R756-R759 (2003).
  2. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
  3. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
  4. Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (11), 743-747 (2012).
  5. Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
  6. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11, (7), 512-522 (2011).
  7. Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7, (2), 205-217 (2014).
  8. Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2, (4), 664-680 (2010).
  9. Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13, (3), 691-698 (2012).
  10. Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11, (99), 20140638 (2014).
  11. Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35, (25), 6954-6963 (2014).
  12. Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201, (7), 1069-1084 (2013).
  13. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (7), 445-457 (2009).
  14. Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28, (6), 370-379 (2013).
  15. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (8), 538-549 (2009).
  16. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31, (25), 6425-6435 (2010).
  17. Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20, (4), 360-367 (2014).
  18. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  19. Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13, (4), 839-849 (2014).
  20. Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125, (7), 1361-1374 (2006).
  21. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95, (11), 5374-5384 (2008).
  22. Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9, (8), 893-904 (2007).
  23. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105, (10), 2240-2251 (2013).
Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).More

Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter