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Immunology and Infection

啮齿动物疟原虫原虫的体内评估和裂殖子入侵流式细胞仪

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

疟原虫侵入和重复内红细胞。裂殖子入侵和原虫的准确评估,因此在评估疟疾感染的过程中是至关重要的。在这里,我们描述了一种流式细胞仪基础的协议用于疟疾的小鼠模型中,这些参数的测量。

Protocol

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所有的程序均按照麦考瑞大学的政策进行,符合国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)实践澳洲代码。根据协议道德没有ARA 2012/017批准,并从动物伦理委员会在麦考瑞大学获得进行这项工作。所有实验均在SJL / J小鼠进行,除非另有说明。

1.鼠标和实验疟疾感染

  1. 家鼠控制温度(21°C)具有12:12小时明暗周期下。
  2. 解冻冷冻保存P的等分试样chabaudi阿达米 DS用5%寄生红细胞(pRBCs)注入200微升进入腹腔的C57BL / 6小鼠供体腔。
  3. 使用流式细胞仪在第3节中描述2天 - - 本协议的4监察捐助鼠标原虫每1。一旦捐助者达到5 - 15%原虫,通过心脏穿刺采血如下:
    1. 吸100微升肝素溶液(300 U / ml肝素在小鼠林格液(MTR)(154毫米氯化钠,5.6毫米氯化钾,1毫米氯化镁2,2.2毫米氯化钙2,20毫米的HEPES,10毫米的葡萄糖,30 U / ml的肝素,pH值7.4,0.22微米过滤灭菌))到一个1ml注射器用26ģ针。
    2. 麻醉小鼠通过吸入,用5%异氟烷,由缺乏踏板戒断反应及角膜反射确认麻醉的所需深度。
    3. 放置鼠标在其一侧并垂直插入针的正下方的弯头,通过肋,并进入心脏。慢慢拉出注射器活塞和0.5,直到旋转针 - 1毫升血液中获得。
    4. 通过颈脱位麻醉下执行人道的安乐死。
  4. 计算每个供体血容量pRBCs假设的9×10 6 RBC /μL(血液计数,即,如果捐助者是在10%原虫牺牲时,血液将包含9×10 5猪红细胞/微升)。稀释血液寄生于Krebs缓冲盐水(126 mM氯化钠,2.5mM的氯化钾,25mM的碳酸氢钠 ,1.2毫的NaH 2 PO 4,1.2毫的MgCl 2,2.5mM氯化钙 ,0.2%葡萄糖,pH为7.2,灭菌0.22μm的过滤器)使浓度为每200微升1×10 4个pRBCs并注入200μl的进腹腔所需红细胞标签和输血实验小鼠的空腔。
  5. 使用流式细胞仪在第3描述2天 - - 4本协议的监控原虫每1。

2.标签红细胞和输血

  1. 如在步骤1.3中描述收集来自小鼠的肝素化血液通过心脏穿刺,并放置在冰上。保持血液在4℃下在任何时候。收集每只小鼠约200微升的血液被注入。如果需要的话,分离血成两个样品,并根据需要处理一个样本。
    注:以这种方式,侵入经处理的SAMP的乐可以比作对照,未处理的样品( 见图1的原理图)。
  2. 制备各荧光红细胞标签的2倍的溶液。
    1. 稀阿托633-N-羟基(阿托633-NHS)在地铁的2毫克/毫升的储备溶液,使其浓度为20微克/毫升。
    2. 稀释生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(生物素NHS)在地铁的25毫克/毫升的储备溶液,使其浓度为250微克/毫升。
  3. 拆分血样成两个管和2倍阿托633-NHS溶液等体积添加到一个管中,与2倍生物素 - NHS等体积的其他管。立即混合。孵育血液在4℃下1小时以恒定缓慢混合,或可替代地,混合样品每10 - 15分钟。
  4. 与地铁(MTR + 0.5%牛血清白蛋白(BSA),灭菌0.22μm滤器)洗涤标记的血液的3倍,如下所示:
    1. 至少添加2体积地铁,离心机在750×g离心5分钟,去除上清,并resuspend。在至少2卷地铁沉淀。重复2次以上。
    2. 在最后的洗涤,离心,在750×g离心5分钟,并结合后以不同的组合的沉淀血液( 即,未处理的阿托633 /治疗生物素,未处理的生物素/处理阿托633)。加入地铁弥补对每只小鼠200微升体积被注入。
  5. 注入标记的血液进入血管内灭鼠疟疾感染的小鼠或未受感染的控制如下:
    1. 在寄生虫裂殖生殖高峰15%原虫 - 执行输血2。
      注:本约一半是通过暗周期( 在12 -上午02时在一个正常的光照周期,或12 -下午2点在反向光周期)。
    2. 用热灯5-10分钟暖小鼠增加血流量,但须小心不要过热的小鼠。小鼠放置在约束装置和血管内注入200微升标记的血液(约1 - 2×10 9 RBCS)通过尾静脉。
  6. 如在第3节中所述采集血样,在注射后不同的时间点。
    注:侵入率可以定量小于10分钟注射后,根据不同的受体小鼠的寄生虫血症。

3.收集血液样品,并准备流式细胞仪

  1. 制备50微升的每个样品染色溶液,再加额外,在实验当天如下:
    1. 除霜6毫JC-1储存在-20℃,在​​二甲基亚砜(DMSO)的等分试样。
    2. 温暖的50微升地铁每个样品,再加上额外的,到37℃。
    3. 而连续地涡旋预热地铁,加入JC-1,使最终浓度为12μM。这样做是为了减少JC-1聚集体的形成;如果不聚集形成,不离心管,因为这将防止染色。
      注:少量聚集不会影响结果。
    4. 添加抗CD45 APC eFluor 780和抗CD71 PerCP eFluor 710,以使最终浓度为1微克/毫升。如果执行所述标记的RBC实验中,添加链霉抗PE-Cy7的,以使最终浓度为1微克/毫升。
  2. 通过尾部内的血管的尾部或裂伤的尖端的截肢执行尾出血。将一滴鲜血尾巴上的小重量船或搏命。采血后,确保出血已停止。吸管3微升尾巴血成50微升染色溶液预加热到37℃,并孵育样品在37℃下20分钟。
  3. 除霜的4mM的赫斯特33342储存在-20℃下在蒸馏水中(如果使用355纳米的激光)或2mM的赫斯特34580储存在-20℃下在蒸馏水中(如果使用405nm的激光)的等分试样。准备500微升每个样品,再加上额外的,对赫斯特的地铁4微米或2微米的解决方案,分别为。
  4. 加入500μl的4μM赫斯特33342或2微米的Hoechst 34580到样品和在室温下孵育20分钟。
  5. 离心机细胞在750 XG为3分钟,在4°C,弃上清,加入700μl地铁和流式细胞流动分析。

4.流式细胞仪

  1. 用355/488/633 nm激光或405/488/633 nm激光仪器分析样品。
  2. 通过一个35微米的细胞分析之前,立即滤网过滤器样品。冲洗细胞过滤的样品,并再利用之间蒸馏水。
  3. 记录足够的事件,以便人口最少包含至少500事件(通常是100 - 10,000,000每个样品总的事件)。
  4. 激发的Hoechst 33342使用355纳米的激光,并通过一个五十分之四百六十〇滤波器检测事件。激发的Hoechst 34580使用405nm的激光,并通过一个五十分之四百六十〇滤波器检测事件。激发JC-1,抗CD71 PerCP eFluor 710和链霉PE-Cy7的使用488nm的激光,并通过一个四十〇分之五百三检测事件,40分之692和750LP过滤各自LY。激发阿托633和抗CD45 APC eFluor 780使用633纳米激光分别检测通过三十零分之六百七十或750LP过滤事件。
  5. 使用适当的流式细胞仪分析软件如下进行分析和补偿:
    1. 选择全细胞和排除噪声,碎屑,并且基于FSC / SSC特性( 图2A)的血小板。选择基于任一触发脉冲宽度( 图2B)或通过使用FSC峰面积与高度之比( 图2C)的单细胞。
    2. 选择成熟红细胞,并排除红细胞祖细胞和白细胞,基于在PerCP eFluor 710和APC eFluor 780的通道( 图2D)负荧光。
    3. 如果执行标记RBC实验,选择基于PE-Cy7的和阿托633荧光标记的红细胞的每个人口和分析这些分开( 图3A)。
    4. 基于积极的荧光为JC-1和赫斯特选择pRBCs(

5.计算和统计

  1. 除以pRBCs的数目由红细胞的总数目计算原虫( 在栅极Q2由事件数在闸门G4划分事件的数量)。当进行两个标记的种群的侵袭测定寄生虫血症可以通过将标记pRBCs的数目由标记的RBCs的数目中,人口(计算数量的事件,因为他们位于两个栅极L1和Q2,由事件的数量除以在门的L1)。
    注意:标记原虫而变化很大,取决于多种因素,例如内源性原虫和循环裂殖子的数量。出于这个原因,它是有帮助的报告原虫比率,其计算公式为经处理的标记的人口由控制标记的人口的寄生虫在每个单独小鼠划分的寄生虫血症。为了纠正可能的染料的影响,报告结果正穿过两个染料组合的平均原虫比例。
  2. 确定使用一个样本t检验与1为假想的平均比率的统计显着性。

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Representative Results

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测量原虫的。

对于寄生虫血症的测定,血细胞应首先被选择,和噪音,碎片和血小板中排除,基于FSC / SSC特性( 图2A)。根据所使用的流式细胞仪,然后应根据任一触发脉冲宽度( 图2B),或FSC峰高度以面积比( 图2C)中选出的单细胞。其余的事件应包括白细胞,染色呈阳性的APC eFluor 780,红细胞祖细胞(包括网织红细胞),染色阳性PerCP eFluor 710和成熟红细胞,负两种这些污渍( 图2D)。选择成熟RBC人口后,事件应该分成四个群体,当JC-1荧光暗算赫斯特33342( 图2E,F)和赫斯特34580( 图2G,H)的荧光。双阳性人群表示寄生的红细胞,而第remaining种群要么未感染RBC(双阴性),HJ-红细胞(Hoechst的正,JC-1阴性),或未知的细胞(JC-1阳性,Hoechst的负数)。值得注意的是,JC-1荧光可能会移动从最大在529纳米到一个宽的发射峰值在590nm处,这取决于细胞的线粒体膜电位。无论这种转变的JC-1将在四十〇分之五百三纳米通道强烈荧光,使这一渠道的分析最适合的。然而,在某些情况下,可能值得在42分之585纳米通道,其可以提供细胞的线粒体膜电位的指示附加记录荧光。在未感染的样本事件小于0.007%应是双重阳性( 图2E,G)。这一结果将取决于流式细胞仪的清洁度,并且可以有很大的不同,在分析前彻底清洗可能改进结果。 HJ-红细胞占0.3 - 成熟红细胞的0.9%,使得加入的JC-1染料临界用于ACC低原虫的尿酸盐测量。

裂殖子入侵评估。

注射标记的RBCs成感染小鼠后的相对侵袭率为两个标记的群体可以被确定。血样应截取的并且描述的用于测定寄生虫血症通过加入链霉抗PE Cy7的制备。在该样品所用的时间取决于实验条件和分析的期望结果。在一般情况下,一个较早的时间点会最好地反映了入侵的表型,虽然它可能是有益的,收集多个时间点,以增加精确度。用于流式细胞术数据的分析,成熟的红细胞应该被选择为在图2中,从这些细胞中,阿托633和生物素标记的RBCs可以基于分别荧光在三十○分之六百七十和750LP通道( 图3A)来鉴定。从这里的三个红细胞种群(阿托633,生物素,以及未标记的)应分别进行分析。在每个这些种群原虫可以基于染色用Hoechst和JC-1( 图3B-D)来确定。

图1
图1示意图的体内寄生虫侵袭测定的。如何使用此测定法可用于确定相对侵袭率红细胞根据用户的生物处理过的质询的一个例子。血液从感染小鼠收集被分成两管。一个管被视为所希望的,而其他的样品放未处理的(A)中。管被再次分割与一个标记的NHS-生物素和其他与NHS-阿托633(B)中 。然后样品被结合在两个组合;生物素标记处理的红细胞与阿托633标记未经处理的红细胞和阿托633标记的处理的红细胞与生物锡标记未处理的RBC(℃)。 15%原虫(D) -这两个组合在裂殖2中分别注入两批感染小鼠。总共6受体小鼠建议以获得统计意义的结果,虽然或多或少如果需要的话也可以使用。从Lelliott 14改编,最初是由生物医学中心出版。

图2
图通过流式细胞2.测量寄生物血症的流式细胞仪。基于FSC / SSC特性(A) 碎片,噪声和血小板从分析中删除。单个细胞,然后从基于任一触发脉冲宽度(B)或FSC峰面积比(C)中剩余的细胞中选择。细胞类型然后可以基于正染色的CD45 APC eFluor尊贵780(白细胞),CD71 PerCP eFluor 710(红细胞祖细胞),或负染色(成熟红细胞)(D)中 。选择成熟红细胞之后,将细胞或者是:Hoechst公司和JC-1阳性(寄生的红细胞),Hoechst的正和JC-1阴性(含有霍维尔Jolly小体的红细胞),JC-1阳性和阴性赫斯特(未知的细胞),或双阴性(未感染RBC)。未感染和P. chabaudi用Hoechst 33342(E,F),或赫斯特34580(G,H)感染的样本,显示, 请点击这里查看此图的放大版本。

图3
图裂殖子入侵3.评估分为两个标记RBC人群体内 。情节是成熟红细胞,门控如在图2中。可以根据它们的标签(A)中来选择这两个标记的RBC群体。阿托633标记细胞荧光在三十分之六百七十信道(L1)中,生物素标记的细胞结合的链霉亲和荧光中的PE-Cy7的通道(L3),和未标记的细胞是阴性的这些污渍(L4)。在这些人群红细胞寄生可以根据赫斯特和JC-1阳性(Q2)(BD)来识别的。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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我们已经描述了两种原虫和裂殖子侵入体内的样品的测定的方法。在寄生虫血症的测量而言,这种方法提供了比以前的方法10-13在于HJ-红细胞的优点可以从pRBCs区分,从而降低假阳性事件的数目。而HJ-红细胞通常在人类中很少见,一些研究报告高水平小鼠15,16使这些细胞和pRBCs为啮齿动物寄生虫血症的精确测量重要的区别。采用这种方法检测原虫的极限是约0.007%14,虽然这是可能的,以减少在适当的条件下,本低至0.0005%。值得注意的是,此限制是由流式细胞仪中使用,并取得了大量的事件在一个合理的时间量的能力的清洁度决定。与使用这种技术的相关的最常见的问题是染色机智不足ħJC-1。 JC-1的荧光取决于该寄生虫的线粒体膜电位,和寄生虫必须是健康,以获得最佳的染色。应该染色前因此,必须避免寄生虫或固定长时间存放。

分析寄生虫已受到药物干预时还应注意行使,因为这也可能影响与JC-1染色的程度。在这些情况下,相比寄生虫血症在添加的JC-1染料可能是分析的基础上的Hoechst荧光单独,原虫很有帮助。实际上,这可以提供的量度寄生虫计数,以及寄生虫健康的整体指示。最后,将JC-1染料可以从一个峰在529纳米的在590nm处通过形成J-聚集改变其荧光的峰。这些聚集体的形成取决于染料的浓度,而这又取决于细胞的线粒体膜电位。线粒体膜势的损失人引起荧光的移位朝529纳米,其可以指示细胞凋亡。在我们沾有JC-1的经验pRBCs总是表现出这是在两个四十分之五百三十〇纳米通道和四十二分之五百八十五纳米通道约等于强度类似的荧光图案。然而,在一些研究中,如那些使用药物干预,它可能是值得监测变化四十分之五百三纳米通道和四十二分之五百八十五纳米通道的线粒体膜电位丧失的任何指示之间的荧光比。同样重要的是要注意,JC-1特别容易分解,应该从所述冷冻等分新鲜配制,同时应避免冷冻/解冻循环。染色后,JC-1荧光是具有很少或没有减少在荧光,至少在几个小时的相对稳定。

用于体内侵袭测定中,两个最重要的因素是在无线闭塞中心标记PR一致性ocess和注射标记的血液的时间。为红细胞标记,染料的最小量应使用,以防止与寄生虫侵入RBC,已用表面标签7时提出这样一种可能性的能力的任何干扰。根据这里所描述的标记条件的入侵不抑制14,但是仔细注意应给予维持一致的标签的浓度,和染料应被切换,以防止由于侵入抑制由红细胞标签的任何不精确性。作为寄生虫经历一个同步周期的入侵,这是非常重要的标记的细胞在适当的时间,在寄生虫生命周期的注入。这应该以最大限度的入侵事件的数量,因此,测定的精确度来实现。根据我们的经验入侵的峰值大约一半是通过黑暗的周期,使得反向光周期室有利的这个实验。

经tWO标签侵袭实验提供了一个准确的方法,以确定裂殖子侵入效率成不同类型的红细胞在体内,这种方法因此允许处理的红细胞, 胰蛋白酶处理,并控制红细胞之间的比较。或者,从转基因小鼠中的红细胞可以比那些对照小鼠,或不同的生理参数或不同年龄红细胞不能比拟的。而类似的测定法已在体外 9被描述为侵袭的测定,该测定在此提供了只占本体内作用,包括免疫系统,这可能改变寄生虫入侵机制17-19的影响的可能性。最后,该测定也有可能提供深入了解疾病,如pRBCs的免疫清除,和寄生虫的生长,如果被标记的种群内的pRBCs监测在延长的时期。

OveraLL,对于寄生虫血症的体内样本中的精确测量的详细协议被描述,它具有比以前的试验在于HJ-红细胞的优点可以从pRBCs区别开来。此外,一个测定在体内描述的侵入效率量化成不同的RBC类型。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们承认,从国家健康与医学研究委员会的资金支持(授予APP605524,490037和1047082),澳大利亚研究理事会(批DP12010061),澳大利亚从创新系国家合作研究基础设施战略和教育投资基金,产业,科学和研究。 PML是澳大利亚研究生奖的获得者。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

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References

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<em>在</em>啮齿动物<em>疟原虫</em>原虫的<em>体内</em>评估和裂殖子入侵流式细胞仪
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Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

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