Summary
Malariaparasitten invaderer og replikater innenfor røde blodceller. Den nøyaktig vurdering av merozoit invasjon og parasitemia er derfor avgjørende i vurderingen løpet av malaria-smitte. Her beskriver vi en strømningscytometri basert protokoll for måling av disse parametre i en musemodell av malaria.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med politikken til Macquarie University og dannet til National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australian anbefalingen. Arbeidet ble utført i henhold til avtalen Etikk Ingen ARA 2012/017 godkjent og hentet fra dyreetikk Utvalget ved Macquarie University. Alle eksperimenter ble utført på SJL / J mus, med mindre annet er angitt.
1. Mus og Experimental Malaria Infeksjon
- Hus mus under kontrollerte temperatur (21 ° C) med en 12:12 hr lys-mørke-syklusen.
- Tine en delmengde av kryopreservert P. chabaudi Adami DS med 5% parasitized RBC (pRBCs) og injisere 200 mL inn i intraperitoneal hulrom av C57BL / 6 donor mus.
- Overvåke donor mus parasitemia hver 1 - 2 dager ved hjelp av flowcytometri som nevnt i § 3 - 4 av denne protokollen. Når donorer når 5 - 15% parasittemi, samle blod ved hjertepunktur som følger:
- Aspirer 100 ul heparinløsning (300 U / ml heparin i mus Ringer-oppløsning (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 10 mM glukose, 30 U / ml heparin, pH 7,4, 0,22 mM filtersterilisert)) i en 1 ml sprøyte med en 26 G nål.
- Bedøve musen ved innånding med 5% isofluorane, bekrefter den ønskede dybden av anestesi ved fravær av pedal tilbaketrekking respons og hornhinne reflekser.
- Plasser musen på siden og vinkelinnsats nål like nedenfor albuen, gjennom ribbeina, og inn i hjertet. Trekk ut sprøytestempelet langsomt og rotere nål inntil 0,5 til 1 ml blod oppnås.
- Utføre human avlivning ved halshugging under narkose.
- Beregn pRBCs per volum av donor blod forutsatt en telling av 9 x 10 6 RBC / mikroliter (blod dvs. hvis donor var på 10% parasitemia når ofret, vil blodet inneholde 9 x 10 5PRBC / mikroliter). Fortynn parasitized blod i Krebs-bufret saltløsning (126 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,2% glukose, pH 7,2, 0,22 mM filtersterilisert) slik at konsentrasjonen er 1 x 10 4 pRBCs pr 200 ul og injisere 200 ul i det intraperitoneale hulrom hos mus som kreves for RBC-merking og transfusjonseksperiment.
- Overvåke parasitemia hver 1 - 2 dager ved hjelp av flowcytometri som beskrevet i §§ 3-4 i denne protokollen.
2. Merking av RBC og transfusjons
- Samle heparinisert blod fra mus ved hjertestans punktering som beskrevet i trinn 1.3, og legg på is. Holde blodet ved 4 ° C til enhver tid. Samle omtrent 200 ul blod per mus som skal injiseres. Hvis det er nødvendig, delt blod inn to prøver og behandle én prøve som ønsket.
MERK: På denne måten, invasjon av den behandlede sample kan bli sammenlignet med en kontroll, ubehandlet prøve (se figur 1 for skjematisk). - Forberede en 2x løsning av hver fluorescerende RBC etikett.
- Fortynn en 2 mg / ml stamløsning av Atto 633-N-hydroksysuksinimid (Atto 633-NHS) i MTR slik at konsentrasjonen er 20 ug / ml.
- Fortynn en 25 mg / ml stamløsning av Biotin-N-hydroksysuksinimid (biotin-NHS) i MTR slik at konsentrasjonen er 250 ug / ml.
- Delt blodprøver i to rør og tilsett et likt volum av 2x Atto 633-NHS løsning på ett rør, og et likt volum av 2x biotin-NHS til det andre røret. Bland umiddelbart. Inkuber blod ved 4 ° C i 1 time med konstant langsom blanding, eller alternativt å blande prøven hver 10 - 15 min.
- Vask merkede blod tre ganger med MTRC (MTR + 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 0,22 pM filter sterilisert) som følger:
- Tilsett minst 2 volumdeler MTRC, sentrifuger ved 750 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspend pelleten i minst 2 volumdeler MTRC. Gjenta to ganger til.
- Etter den siste vask, sentrifuger ved 750 xg i 5 minutter og kombinere den pelleterte blod i forskjellige kombinasjoner (dvs. ubehandlet Atto 633 / behandlet Biotin, ubehandlet Biotin / behandlet Atto 633). Legg MTR å gjøre opp til et volum på 200 ul pr mus som skal injiseres.
- Injisere merket blod intravaskulært inn gnager malaria infiserte mus eller friske kontroller på følgende måte:
- Utføre transfusjon ved 2 - 15% parasitemia på toppen av parasitten schizogoni.
MERK: dette skjer omtrent halvveis gjennom den mørke syklus (dvs. mellom 12-2 am på en normal lys syklus, eller 12-2 pm på en omvendt lys syklus). - Varme mus ved hjelp av en varmelampe i 5-10 minutter for å øke blodgjennomstrømningen, men ta forholdsregler for ikke å overopphetes musene. Plasser mus i en holdeanordning og intravaskulært injisere 200 mL merket blod (ca. 1 - 2 x 10 9 RBCs) via halevenen.
- Utføre transfusjon ved 2 - 15% parasitemia på toppen av parasitten schizogoni.
- Samle blodprøver på ulike tidspunkter etter injeksjon som beskrevet i kapittel 3.
MERK: invasjons prisene kan kvantifiseres mindre enn 10 minutter etter injeksjonen, avhengig parasitemia til mottakeren mus.
3. Innsamling av blodprøver og klargjøring for flowcytometrisystemer
- Forbered 50 pl fargeløsning per prøve, pluss ekstra, på dagen for eksperimentet som følger:
- Tine en delmengde av 6 mM JC-1 lagret ved -20 ° C i dimetylsulfoksyd (DMSO).
- Varm 50 ul av MTRC per prøve, pluss ekstra, til 37 ° C.
- Mens kontinuerlig virvling av forvarmet MTRC, tilsett JC-1, slik at sluttkonsentrasjonen er 12 um. Dette er gjort for å redusere dannelsen av JC-1 aggregater; hvis aggregater danner, ikke sentrifugerør da dette vil hindre misfarging.
MERK: En liten mengde av aggregering vil ikke påvirke resultatene. - Legg anti-CD45 APC eFluor 780 og anti-CD71 PerCP eFluor 710, slik at sluttkonsentrasjonen er 1 mikrogram / ml. Ved å utføre den merkede RBC eksperimentet, tilsett streptavidin-PE Cy7 slik at sluttkonsentrasjonen er 1 mikrogram / ml.
- Utføre halen blødning etter amputasjon av halespissen eller sårskader av blodkaret i løpet av halen. Plasser en dråpe hale blod på en liten veie båt eller glass lysbilde. Etter blodprøvetaking, sikre at blødningen har stoppet. Pipetter 3 ul av haleblod i 50 pl fargeløsning som på forhånd oppvarmet til 37 ° C og inkubere prøvene ved 37 ° C i 20 min.
- Tine en delmengde av 4 mM Hoechst 33342 lagret ved -20 ° C i destillert vann (ved bruk av en 355 nm laser) eller 2 mM Hoechst 34580 lagret ved -20 ° C i destillert vann (ved bruk av en 405 nm laser). Forbered 500 mL per prøve, pluss ekstra, av en fire mikrometer eller to mikrometer løsning av Hoechst i MTRC, henholdsvis.
- Legg til 500 mL av 4 mikrometer Hoechst33.342 eller 2 uM Hoechst 34580 til prøvene og inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Sentrifuger cellene ved 750 xg for 3 min ved 4 ° C, kast supernatanten, tilsett 700 mL MTRC og analysere ved flowcytometri.
4. flowcytometrisystemer
- Analysere prøver ved hjelp av en 355/488/633 nm laser eller 405/488/633 nm laser instrument.
- Filterprøver gjennom en 35 mikrometer celle sil umiddelbart før analyse. Skyll celle sil med destillert vann mellom prøver og gjenbruk.
- Spill nok hendelser slik at den minste befolkningen inneholder minst 500 hendelser (vanligvis millioner - 10 millioner Antall hendelser per prøve).
- Excite Hoechst 33342 ved hjelp av en 355 nm laser og oppdage hendelser gjennom en 460/50 filter. Excite Hoechst 34580 ved hjelp av en 405 nm laser og oppdage hendelser gjennom en 460/50 filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 og streptavidin PE-Cy7 ved hjelp av en 488 nm laser og oppdage hendelser gjennom en 530/40, 692/40, og 750LP filtrere respektively. Excite Atto 633 og anti-CD45 APC eFluor 780 ved hjelp av en 633 nm laser og oppdage hendelser gjennom en 670/30 eller 750LP filter hhv.
- Utføre analyser og kompensasjon ved hjelp av egnet flowcytometri analyse programvaren som følger:
- Velg hele celler og inkluderer støy, rusk og blodplater basert på FSC / SSC egenskaper (Figur 2A). Velge enkeltceller basert på enten triggerpulsbredde (figur 2B) eller ved hjelp av FSC toppareal og høyde (figur 2C).
- Velg modne RBC, og inkluderer RBC stamfedre og leukocytter, basert på negative fluorescens i de PerCP eFluor 710 og APC eFluor 780 kanaler (figur 2D).
- Hvis du utfører den merkede RBC eksperiment, velger hver populasjon av merket RBC basert på PE-Cy7 og Atto 633 fluorescens og analysere disse separat (figur 3A).
- Velg pRBCs basert på positiv fluorescens for både JC-1 og Hoechst (
5. Beregninger og statistikk
- Beregne parasitemia ved å dele antall pRBCs av det totale antall RBC (dvs. antall hendelser i gate Q2 dividert på antall hendelser i gate G4). Ved gjennomføring av invasjonen assay parasittemi av de to merkede populasjoner kan beregnes ved å dele antall av merkede pRBCs med antall merkede RBCs ved at populasjonen (dvs. antall hendelser som er i begge portene L1 og Q2, dividert med antallet hendelser i gate L1).
MERK: Merket parasitemia varierer betydelig avhengig av faktorer som endogen parasitemia og antall sirkulerende merozoites. Av denne grunn er det nyttig å rapportere parasittemi grad, som er beregnet som parasittemi av den behandlede populasjonen merket dividert med parasittemi av styre merket populasjonen i hver enkelt mus. For å korrigere for mulige fargeeffekter, resulterer rapport ener en gjennomsnittlig parasitemia forhold på tvers av de to fargekombinasjoner. - Bestemme statistisk signifikans av forholdstall ved hjelp av én prøve t-test med en som hypotetisk gjennomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling av parasitemia.
For måling av parasittemi, bør blodlegemer først bli valgt, og støy, rusk og blodplater utelukket, basert på FSC / SSC egenskaper (figur 2A). Avhengig av cytometer brukes, bør enkeltceller deretter velges basert på enten triggerpulsbredde (figur 2B), eller FSC topphøyde til arealforholdet (figur 2C). Resterende hendelser bør bestå av leukocytter, farget positivt for APC eFluor 780, RBC stamfedre (inkludert retikulocytter), farget positivt for PerCP eFluor 710, og modne RBC, negative for begge disse flekker (figur 2D). Når du har valgt den modne RBC befolkningen, bør hendelser skilles i fire populasjoner når JC-en fluorescens er plottet mot Hoechst 33342 (2E F) eller Hoechst 34580 (figur 2G, H) fluorescens. Den doble positive populasjon parasitized representerer RBC-er, mens remaining bestandene er enten ikke-infiserte RBC (dual negativ), HJ-RBC (Hoechst positiv, JC-1 negative), eller ukjente celler (JC-1 positive, Hoechst negativ). Spesielt, kan JC-1 fluorescens skifte fra et maksimum ved 529 nm i et bredt emisjons topp på 590 nm, avhengig av mitokondriemembranpotensialet av cellen. Uavhengig av dette skiftet JC-1 vil fluorescere sterkt på 530/40 nm kanal, noe som gjør denne kanalen mest egnet for analyse. Men i noen tilfeller kan det være verdt å i tillegg ta opp fluorescens i det 585/42 nm kanalen, noe som kan gi en indikasjon på mitokondriemembranpotensialet av celler. I ikke-infiserte prøvene mindre enn 0,007% av hendelser bør være dual positive (2E G). Dette resultatet vil avhenge av renheten på strømningscytometer og kan variere betydelig, kan omfattende rengjøring før analysen bedre resultater. HJ-RBCs utgjøre 0,3 til 0,9% av modne RBC-er, noe som gjør tilsetningen av JC-1 fargestoff kritisk for accurat måling av lav parasitemia.
Vurdering av merozoit invasjon.
Etter injeksjon av merket RBC i infiserte mus de relative invasjonsfrekvenser til de to merkede populasjoner kan bestemmes. Blodprøver bør tas og forberedt som beskrevet for parasittemi måling med tillegg av streptavidin PE Cy7. Den tid ved hvilken prøven er tatt, avhenger av forsøksbetingelsene og ønskede resultatet av analysen. Generelt vil et tidligere tidspunkt best reflekterer en invasjon fenotype, selv om det kan være fordelaktig å samle flere tidspunkter for å øke nøyaktigheten. For analyse av flowcytometri data, bør modne RBC-er velges så i figur 2. Fra disse cellene, kan Atto 633 og biotin-merket RBCs bli identifisert basert på fluorescens i de 670/30 og 750LP kanaler henholdsvis (figur 3A). Herfra på de tre RBC populasjoner (Atto 633, biotin, og umerket)skal analyseres separat. I hver av disse bestandene parasitemia kan bestemmes på grunnlag av farging med Hoechst og JC-1 (figur 3B-D).
Figur 1. Skjematisk av in vivo parasitt invasjon assay. Et eksempel på hvordan denne analysen kan brukes til å bestemme relative invasjonsrater i RBC-er behandlet i henhold til brukerens biologiske spørsmålet er vist. Blod oppsamlet fra ikke-infiserte mus er delt inn i to rør. Ett rør behandles som ønsket, mens den andre prøven er ubehandlet (A). Rør er igjen delt med en merket med NHS-biotin, og den andre med NHS-Atto 633 (B). Prøvene blir deretter kombinert i to kombinasjoner; Biotinmerkede behandlet RBC med Atto 633 merkede ubehandlede RBC og Atto 633 merket behandlet RBC med Biotinn merket ubehandlede RBC (C). Disse to kombinasjoner blir injisert separat inn i to masse infiserte mus under schizogoni ved 2 - 15% parasittemi (D). Totalt 6 resipientmus anbefales for å oppnå statistisk signifikans i produktet, men mer eller mindre kan anvendes hvis nødvendig. Tilpasset fra Lelliott 14 et al., Opprinnelig utgitt av BioMed Central.
Figur 2. Måling av parasitemia ved strømningscytometri. Rusk, støy og blodplater fjernes fra analyse basert på FSC / SSC egenskaper (A). Enkeltceller blir deretter valgt fra de gjenværende celler basert på enten triggerpulsbredde (B) eller FSC topp til arealforholdet (C). Celletyper kan da skilles basert på positiv farging med CD45 APC eFluor780 (leukocytter), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC stamfedre), eller negativ farging (modne RBC) (D). Når du har valgt modne RBC, cellene er enten: Hoechst og JC-1 positive (parasitized RBC), Hoechst positive og JC-en negativ (RBC inneholder Howell Jolly organer), JC-1 positiv og Hoechst negativ (ukjent celler), eller dobbel negativ (uinfiserte RBC). Infisert og P. chabaudi infiserte prøver farget med Hoechst 33342 (E, F), eller Hoechst 34580 (G, H), vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Vurdering av merozoit invasjon i to merket RBC populasjoner i vivo. Tomter er av modne RBC, gatedsom i figur 2. De to merkede RBC populasjoner kan velges basert på deres etikett (A). Atto 633 merkede celler fluorescerer i kanalen 670/30 (L1), biotin merkede celler bindes til streptavidin og fluorescerer i PE-Cy7 kanal (L3), og umerkede celler er negative for disse flekker (L4). I hver av disse populasjonene parasitized RBC kan identifiseres basert på Hoechst og JC-1 positiv farging (Q2) (BD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode for måling av både parasittemi og merozoitt invasjon av in vivo-prøver. I form av parasitemia måling, denne metoden gir en fordel i forhold til tidligere metoder 10-13 i at HJ-RBC kan skilles fra pRBCs, og dermed redusere antall falske positive hendelser. Mens HJ-RBC er vanligvis sjelden hos mennesker, noen studier rapporterer høye nivåer i mus 15,16 gjør skillet mellom disse cellene og pRBCs viktige for nøyaktig måling av gnager parasitemia. Ved hjelp av denne fremgangsmåte påvisningsgrensen for parasitemia er omtrent 0,007% 14, selv om det er mulig å redusere denne så lav som 0,0005% under de riktige betingelser. Spesielt er denne grense diktert av renheten på strømningscytometer brukt og evnen til å oppnå et stort antall hendelser i en rimelig tidsperiode. Det vanligste problem i forbindelse med bruken av denne teknikken er tilstrekkelig farging with JC-en. Fluorescensen av JC-1 avhengig av mitokondriemembranpotensialet av parasitten og parasitter må være sunt for å oppnå optimal farging. Langvarig lagring av parasitter eller fiksering bør derfor unngås før farging.
Forsiktighet bør også utvises ved å analysere parasitter som har vært gjenstand for medikamentell behandling, da dette kan også påvirke omfanget av farging med JC-1. I disse tilfeller kan det være nyttig å analysere parasitemia basert på Hoechst fluorescens alene, sammenlignet med parasitemia med tillegg av JC-1-fargestoff. Faktisk kan dette gi et mål på parasitt teller, så vel som en totalindikasjon av parasitt helse. Endelig kan JC-1 fargestoff skifte dens fluorescens fra en topp ved 529 nm mot en topp ved 590 nm ved å danne J-aggregater. Dannelsen av disse aggregater er avhengig av fargestoffkonsentrasjonen, som i sin tur avhenger av mitokondriemembranpotensialet av cellen. Tapet av mitokondrie membran potential forårsaker et skifte i fluorescens mot 529 nm, noe som kan tyde på cellene er apoptotiske. I vår erfaring pRBCs farget med JC-1 alltid viste en lignende fluorescens mønster som var på omtrent samme intensitet i både 530/40 nm kanal og 585/42 nm kanal. Men i noen studier, slik som de ansette medikamentell behandling, kan det være verdt å overvåke endringer i fluorescens forholdet mellom 530/40 nm kanal og 585/42 nm kanal for noen indikasjoner på tap av mitokondriemembranpotensialet. Det er også viktig å merke seg at JC-1 er særlig utsatt for nedbrytning, og bør være ferskt fremstilt fra en frossen porsjon som beskrevet, mens fryse / tine sykluser bør unngås. Etter farging, JC-1 fluorescens relativt stabilt med liten eller ingen reduksjon i fluorescens, i det minste i løpet av flere timer.
For in vivo invasjon analysen, de to mest kritiske faktorene er konsistens i RBC merking process og tidspunktet for injeksjon av merket blod. For RBC merking, bør den minimale mengden av farvestoff anvendes for å forhindre interferens med evne til parasitten å invadere RBC, som har blitt hevet som en mulighet ved bruk av overflate etiketter 7. Under merkingsbetingelsene som beskrives her invasjon ikke inhiberes 14, men nøye oppmerksomhet bør gis til å opprettholde ensartede konsentrasjoner etikett, og fargestoffer bør være slått, for å hindre at eventuelle unøyaktigheter på grunn av invasjon inhibering av RBC etiketten. Som parasitter gjennomgå en synkronisert invasjon syklus, er det viktig at merkede celler injiseres på riktig tidspunkt i parasitter livssyklus. Dette må gjøres for å maksimalisere antallet av invasjons hendelser, og dermed nøyaktigheten av analysen. I vår erfaring toppen av invasjonen skjer omtrent halvveis gjennom den mørke syklusen, noe som gjør en omvendt lys syklus rom fordelaktig for denne analysen.
Den two etikett invasjon analysen gir en nøyaktig metode for å bestemme merozoit invasjon effektivitet inn i ulike typer RBC in vivo. Denne tilnærmingen gjør derfor en sammenligning mellom behandlede RBC, dvs. trypsinert og kontroll RBC. Alternativt kan RBC fra genetisk modifiserte mus sammenlignes med de av kontrollmusene, eller RBC av forskjellige fysiologiske parametre eller forskjellig alder kunne sammenlignes. Mens en tilsvarende analyse er blitt beskrevet for måling av invasjonen in vitro 9, her gir analysen potensial til å gjøre rede for virkninger bare er tilstede in vivo, inkludert påvirkning av immunsystemet, noe som kan endre parasitt invasjonsmekanismer 17-19. Endelig har denne analysen også potensiale til å gi innsikt i patologier så som immun clearance av pRBCs, og parasittvekst, hvis pRBCs innenfor de merkede populasjoner blir overvåket over en lengre periode.
Overall, er en detaljert protokoll for nøyaktig måling av parasittemi i in vivo-prøver som er beskrevet, som har en fordel i forhold til tidligere assays ved at HJ-RBCs kan skilles fra pRBCs. Videre er en analyse beskrevet for kvantifisering av invasjonen effektivitet i forskjellige typer RBC in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner finansiering støtte fra National Health and Medical Research Council (gi APP605524, 490037 og 1047082), den australske Research Council (gi DP12010061), National Collaborative forskningsinfrastruktur Strategy of Australia og Utdannings investeringsfond fra Institutt for innovasjon, Industri , vitenskap og forskning. PML er en mottaker av en australsk Postgraduate award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| JC-1 Dye | Life Technologies | T-3168 | Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO |
| Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0451-80 | Clone 30-F11 |
| Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0711-80 | Clone R17217 |
| Atto 633 NHS ester | Sigma-Aldrich | 1464 | Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21335 | Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | Streptavidin PE-Cy7 |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H478 | |
| 35 µM filter cap tubes | Becton Dickinson | 352235 | |
| Flow cytometer: BD LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD FACSAria II | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD Influx | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter |
References
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).
- Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).
- Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).
- Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).
- Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1 (118), (2011).
- Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).
- Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).
- Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).
- Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13 (1), 100 (2014).
- Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).
- Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).
- Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).
- Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).
- Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).
