Summary
Les envahit de parasites du paludisme et répétitions dans les globules rouges. L'évaluation précise de l'invasion des mérozoïtes et la parasitémie est donc crucial pour évaluer l'évolution de l'infection du paludisme. Nous décrivons ici un protocole basé sur la cytométrie en flux pour la mesure de ces paramètres dans un modèle de souris de la malaria.
Protocol
Toutes les procédures ont été menées en conformité avec les politiques de l'Université Macquarie et conformes au Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) Code australien de pratique. Le travail a été effectué en vertu de l'éthique de la convention n ° 2012/017 ARA approuvé et obtenu du comité d'éthique animale à l'Université Macquarie. Toutes les expériences ont été réalisées sur des souris SJL / J, sauf indication contraire.
1. Souris et expérimentale paludisme Infection
- Souris maison sous température contrôlée (21 ° C) avec un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
- Décongeler une aliquote de cryoconservés P. chabaudi adami DS avec 5% (globules rouges parasités culot globulaire) et injecter 200 pi dans la cavité intrapéritonéale de C57BL / 6 donateurs souris.
- Surveiller donateurs parasitémie de souris tous les 1-2 jours en utilisant la cytométrie de flux comme décrit au paragraphe 3-4 de ce protocole. Une fois que les donateurs atteint 5 à 15% de parasitémie, recueillir le sang par ponction cardiaque comme suit:
- Aspirer 100 pl de solution d'héparine (300 U / ml d'héparine dans une solution souris assortie (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6, 1 mM de MgCl2, 2,2 mM de CaCl2, 20 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 30 U / ml l'héparine, pH 7,4, 0,22 uM de filtre stérilisé)) dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 26 G.
- Anesthésier la souris par inhalation avec 5% isofluorane, confirmant la profondeur désirée de l'anesthésie par l'absence de réponse de retrait de la pédale et les réflexes de la cornée.
- Placez la souris sur le côté et l'aiguille d'insertion perpendiculairement juste en dessous du coude, à travers les côtes, et dans le cœur. Tirez piston de la seringue lentement et tourner aiguille jusqu'à 0,5 à 1 ml de sang est obtenu.
- Effectuer euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie.
- Calculer les pRBCs par volume de sang du donneur en supposant une numération formule sanguine de 9 x 10 6 RBC / pi (par exemple, si le donneur était à 10% de parasitémie lors du sacrifice, le sang contient 9 x 10 5pRBC / ul). Diluer sang parasité dans Krebs saline (NaCl 126 mM, KCl 2,5, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM de NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2% de glucose, pH 7,2, 0,22 filtre uM stérilisé) tamponnée de sorte que la concentration est de 1 x 10 4 pRBCs par 200 ul et 200 ul d'injecter dans la cavité intraperitoneale de souris nécessaires à l'étiquetage et RBC expérience de transfusion.
- Surveiller parasitémie tous les 1-2 jours en utilisant la cytométrie de flux comme décrit dans les sections 3-4 de ce protocole.
2. L'étiquetage des globules rouges et transfusion
- Prélever le sang héparine de souris par ponction cardiaque comme décrit dans l'étape 1.3, et le placer sur la glace. Gardez le sang à 4 ° C en tout temps. Recueillir environ 200 ul de sang par souris à injecter. Si nécessaire, diviser en deux échantillons de sang et traiter un échantillon comme vous le souhaitez.
NOTE: De cette façon, l'invasion de la samp traitéle peut être comparée à un contrôle, échantillon non traité (voir la figure 1 pour le schéma). - Préparer une solution 2x de chaque étiquette de RBC fluorescent.
- Diluer un ml de solution 2 mg / stock d'Atto 633-N-hydroxysuccinimide (633 Atto-NHS) MTR sorte que la concentration est de 20 ug / ml.
- Diluer un ml solution à 25 mg / ml de biotine-N-hydroxysuccinimide (biotine-NHS) MTR sorte que la concentration est de 250 pg / ml.
- Diviser les échantillons de sang en deux tubes et ajouter un volume égal de solution 633 2x Atto-NHS à un tube, et un volume égal de 2x le biotine-NHS à l'autre tube. Mélanger immédiatement. Incuber le sang à 4 ° C pendant 1 heure avec un mélange constant lente, ou encore, l'échantillon mélanger tous les 10 à 15 min.
- Laver 3 fois sang marqués avec MTRC (MTR + 0,5% albumine de sérum bovin (BSA), 0,22 uM de filtre stérilisé) comme suit:
- Ajouter au moins deux volumes de MTRC, centrifuger à 750 g pendant 5 min, retirer le surnageant, et resuspenD le culot dans au moins deux volumes de MTRC. Répétez deux fois plus.
- Après le lavage final, centrifuger à 750 g pendant 5 min et de combiner le sang granulés dans des combinaisons différentes (ce est à dire, non traitée Atto 633 / biotine traités, non traités biotine / traité Atto 633). Ajouter MTR de faire jusqu'à un volume de 200 ul par souris à injecter.
- Injecter du sang marqué par voie intravasculaire dans des souris infectées murins ou témoins non infectés comme suit:
- Effectuer une transfusion à 2-15% de parasitémie au sommet de parasite schizogonie.
REMARQUE: cela se produit à mi-chemin à travers le cycle d'obscurité (ce est à dire, entre 12 à 2 heures du matin un cycle de lumière normale, ou 12-2 h un cycle de feu de recul). - Souris chaude en utilisant une lampe chauffante pendant 5-10 minutes pour augmenter le flux sanguin, mais de prendre des précautions pour ne pas surchauffer les souris. Placez la souris dans un dispositif de retenue et injecter par voie intravasculaire 200 pi de sang marqué (environ 1-2 x 10 9 RBCs) via la veine caudale.
- Effectuer une transfusion à 2-15% de parasitémie au sommet de parasite schizogonie.
- Prélever des échantillons de sang à différents points de temps après l'injection comme décrit dans la section 3.
REMARQUE: les taux d'invasion peuvent être quantifiés moins de 10 minutes après l'injection, en fonction de la parasitémie de la souris receveuse.
3. Prélèvement des échantillons de sang et préparation pour cytométrie en flux
- Préparer 50 ul de solution de coloration par échantillon, et un peu plus, le jour de l'expérience comme suit:
- Décongeler une aliquote de 6 mM de JC-1 stockée à -20 ° C dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Chaud 50 pi de MTRC par échantillon, et un peu plus, à 37 ° C.
- Alors que le vortex continu MTRC préchauffée, ajouter JC-1 de sorte que la concentration finale est de 12 pM. Ceci est fait pour réduire la formation de JC-1 agrégats; si agrégats ne forment, faire le tube centrifugeuse pas que cela permettra d'éviter la coloration.
NOTE: Une petite quantité d'agrégation ne affectera pas les résultats. - Ajouter anti-CD45 APC eFluor 780 et anti-CD71 PerCP eFluor 710 de sorte que la concentration finale soit de 1 ug / ml. Si l'exécution de l'expérience RBC marqué, ajouter de la streptavidine PE-Cy7 de sorte que la concentration finale soit de 1 ug / ml.
- Effectuer queue saignements par l'amputation de l'extrémité de la queue ou de lacération du vaisseau sanguin dans la queue. Placez une goutte de sang de la queue sur un petit bateau ou peser lame de verre. Après la collecte de sang, se assurer que le saignement se est arrêté. Pipette 3 ul de sang de la queue dans 50 ul de solution de coloration pré-chauffé à 37 ° C et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 20 min.
- Décongeler une aliquote de 4 mM de Hoechst 33342 stocké à -20 ° C dans l'eau distillée (si l'on utilise un laser de 355 nm) ou 2 mM de Hoechst 34580 stocké à -20 ° C dans l'eau distillée (si l'on utilise un laser à 405 nm). Préparer 500 ul par échantillon, et un peu plus, d'une solution 4 uM ou 2 M de Hoechst dans MTRC, respectivement.
- Ajouter 500 ul de 4 um Hoechst33 342 2 uM ou Hoechst 34580 à échantillons et incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Centrifuger les cellules à 750 g pendant 3 min à 4 ° C, surnageant défausse, ajouter 700 ul MTRC et analysent par cytométrie de flux.
4. cytométrie en flux
- Analyser des échantillons en utilisant un laser 355/488/633 nm ou 405/488/633 instrument laser nm.
- Filtrer les échantillons à travers un tamis cellulaire immédiatement 35 uM avant l'analyse. Rincer la crépine de la cellule avec de l'eau distillée entre les échantillons et réutilisation.
- Enregistrer suffisamment d'événements de telle sorte que la plus petite population contient au moins 500 événements (généralement 1.000.000 - 10.000.000 événements totales par échantillon).
- Exciter Hoechst 33342 en utilisant un laser de 355 nm et détecter des événements par l'intermédiaire d'un filtre à 460/50. Exciter Hoechst 34580 en utilisant un laser de 405 nm et détecter des événements par l'intermédiaire d'un filtre à 460/50. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 et Streptavidin PE-Cy7 utilisant un laser de 488 nm et détecter des événements à travers un 530/40, 692/40 et 750LP filtre respectifLy. Exciter Atto 633 et anti-CD45 APC eFluor 780 en utilisant un laser de 633 nm et détecter des événements par l'intermédiaire d'un filtre à 670/30 ou 750LP respectivement.
- Effectuer l'analyse et la rémunération en utilisant la cytométrie en flux approprié logiciel d'analyse comme suit:
- Sélectionnez les cellules entières et d'exclure le bruit, les débris et les plaquettes basé sur FSC / Propriétés SSC (figure 2A). Sélectionner des cellules individuelles sur la base de chaque largeur d'impulsion de déclenchement (figure 2B) ou en utilisant la surface du pic à FSC rapport de hauteur (figure 2C).
- Sélectionnez globules rouges matures, et d'exclure les progéniteurs et les leucocytes RBC, basées sur la fluorescence négative dans les PerCP eFluor 710 et APC eFluor 780 canaux (Figure 2D).
- Si l'exécution de l'expérience RBC marqué, sélectionner chaque population de globules rouges marqués sur la base de PE-Cy7 et Atto 633 fluorescence et les analyser séparément (figure 3A).
- Sélectionnez pRBCs basée sur la fluorescence positive tant pour JC-1 et Hoechst (
5. Calculs et statistiques
- Calculer la parasitémie en divisant le nombre de culot globulaire par le nombre total de globules rouges (ce est à dire, nombre d'événements dans la porte Q2 divisé par le nombre d'événements dans la porte G4). Lors de la réalisation de la parasitémie de dosage d'invasion des deux populations marquées peut être calculé en divisant le nombre de culot globulaire marqués par le nombre de globules rouges marqués dans cette population (nombre d'événements qui sont dans les deux portes L1 et Q2, divisé par le nombre d'événements dans la porte L1).
REMARQUE: Marqué parasitémie varie considérablement en fonction de facteurs tels que la parasitémie endogène et nombre de mérozoïtes circulation. Pour cette raison, il est utile de signaler le taux de parasitémie, qui est calculé comme la parasitémie de la population marquée traité divisé par la parasitémie de la population contrôle de souris marqué à chaque individu. Pour corriger les effets possibles de colorants, rendre compte des résultats d'uns un rapport de la parasitémie moyenne dans les deux combinaisons de colorants. - Déterminer la signification statistique des ratios utilisant le t -test d'un échantillon avec une comme la moyenne hypothétique.
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Representative Results
Mesure de la parasitémie.
Pour la mesure de la parasitémie, cellules de sang doivent d'abord être sélectionnés, et le bruit, les débris et les plaquettes exclus, basée sur FSC / SSC propriétés (figure 2A). Selon le cytomètre utilisé, les cellules individuelles doivent alors être sélectionnés en fonction de chaque largeur d'impulsion de déclenchement (figure 2B), ou FSC hauteur de crête à rapport de surface (figure 2C). Parmi les épreuves devraient consister en des leucocytes, colorées positif pour APC eFluor 780, progéniteurs RBC (y compris les réticulocytes), colorées positif pour PerCP eFluor 710, et les globules rouges matures, négatives pour ces deux taches (figure 2D). Après avoir sélectionné la population RBC mature, les événements devraient se séparer en quatre populations lorsque JC-1 fluorescence est comploté contre Hoechst 33342 (Figure 2E, F) ou Hoechst 34580 (Figure 2G, H) fluorescence. La population double positive représente globules rouges parasités, tandis que le remaining populations sont soit des globules rouges non infectés (double négatif), HJ-globules rouges (Hoechst positif, JC-1 négative), ou des cellules inconnus (JC-1 positifs, Hoechst négative). Notamment, JC-1 fluorescence peut passer d'un maximum à 529 nm et un large pic d'émission à 590 nm, en fonction du potentiel de la membrane mitochondriale de la cellule. Indépendamment de ce changement JC-1 sera fluorescence fortement dans le canal 530/40 nm, ce qui rend ce canal le plus approprié pour l'analyse. Toutefois, dans certains cas, il peut être intéressant de fluorescence en outre fiche dans la chaîne 585/42 nm, ce qui peut fournir une indication du potentiel de la membrane mitochondriale des cellules. Dans les échantillons non infectés moins de 0,007% des événements devrait être double positif (Figure 2E, G). Ce résultat dépendra de la propreté de la cytomètre de flux et peut varier considérablement, un nettoyage approfondi avant l'analyse peut améliorer les résultats. HJ-globules rouges représentent 0,3 à 0,9% de globules rouges matures, ce qui rend l'addition du colorant JC-1 critique pour l'accmesure de l'urate de faible parasitémie.
Évaluation de l'invasion des mérozoïtes.
Après injection de globules rouges marqués dans des souris infectées par les taux d'invasion relatifs dans les deux populations marquées peuvent être déterminées. Des échantillons de sang doivent être prélevés et préparés comme décrit pour la mesure de la parasitémie avec l'ajout de streptavidine PE Cy7. Le moment où l'échantillon est prélevé dépend des conditions expérimentales et les résultats de l'analyse souhaitée. En général, un point de plus tôt sera le mieux refléter un phénotype d'invasion, mais il peut être bénéfique de recueillir de multiples points dans le temps pour augmenter la précision. Pour l'analyse de cytométrie de flux de données, les globules rouges matures devraient être choisis comme dans la figure 2. A partir de ces cellules, Atto 633 marqué à la biotine et les globules rouges peuvent être identifiés sur la base de fluorescence dans les canaux de 670/30 et 750LP respectivement (figure 3A). De là, sur les trois populations RBC (Atto 633, biotine, et sans étiquette)doivent être analysés séparément. Dans chacun de ces populations parasitémie peut être déterminée sur la base de la coloration avec Hoechst et JC-1 (figure 3B-D).
Figure 1. Schéma de l'essai in vivo d'invasion du parasite. Un exemple de la façon dont cet essai peut être utilisée pour déterminer les taux d'invasion relatifs dans les globules rouges traités selon question biologique de l'utilisateur se affiche. Le sang prélevé à partir de souris non infectées est divisé en deux tubes. Un tube est traité comme désiré tandis que l'autre échantillon est laissé non traité (A). Les tubes sont à nouveau divisés avec une marquée avec NHS-biotine et l'autre avec NHS-Atto 633 (B). Les échantillons sont ensuite combinés en deux combinaisons; Biotine globules rouges traités par Atto 633 globules rouges non traités étiquetés et Atto 633 étiquetée globules rouges traité avec Bioétain marqué globules rouges non traités (C). Ces deux combinaisons sont injectés séparément dans deux lots de souris infectées au cours schizogonie à 2-15% de parasitémie (D). Un total de six souris receveuses est recommandé d'acquérir une signification statistique dans le résultat, bien que plus ou moins peuvent être utilisés si nécessaire. Adapté de Lelliott et al. 14, initialement publié par BioMed Central.
Figure 2. Mesure de la parasitémie par cytométrie de flux. Débris, le bruit, et les plaquettes sont retirées de l'analyse basée sur les propriétés de la SSC FSC / (A). Les cellules individuelles sont alors choisis parmi les cellules restantes sur la base de chaque largeur d'impulsion de déclenchement (B), ou FSC pic de rapport de surface (C). Les types de cellules peuvent ensuite être différencié en fonction coloration positive avec CD45 APC eFluor780 (leucocytes), CD71 PerCP eFluor 710 (Les progéniteurs RBC), ou coloration négative (globules rouges matures) (D). Après avoir sélectionné les globules rouges matures, les cellules sont soit: Hoechst et JC-1 positifs (globules rouges parasités), Hoechst, JC-1 positif négatif et Hoechst négative (cellules inconnus), ou double positif et JC-1 négatif (globules rouges contenant des corps de Howell-Jolly) (globules rouges non infectés). Non infecté et P. chabaudi échantillons infectés colorés avec Hoechst 33342 (E, F), ou Hoechst 34580 (G, H), sont présentés. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Évaluation de l'invasion des mérozoïtes en deux populations RBC marqués in vivo. Parcelles sont des globules rouges matures, gatedcomme dans la figure 2. Les deux populations RBC marqués peuvent être sélectionnés en fonction de leur étiquette (A). Atto 633 cellules marquées fluorescentes dans le canal d'670/30 (L1), les cellules marquées à la biotine se lient à la streptavidine et une fluorescence dans le canal PE-Cy7 (L3), et les cellules non marquées sont négatifs pour ces taches (L4). Dans chacune de ces populations de globules rouges parasités peuvent être identifiés sur la base de Hoechst et JC-1 coloration positive (Q2) (BD). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons décrit un procédé pour la mesure à la fois de la parasitémie et mérozoïte invasion d'échantillons in vivo. En termes de mesure de la parasitémie, cette méthode offre un avantage par rapport aux méthodes précédentes de 10 à 13 dans ce HJ-globules rouges peut être distinguée de pRBCs, réduisant ainsi le nombre d'événements de faux positifs. Alors que HJ-globules rouges sont généralement rare chez les humains, certaines études rapportent des niveaux élevés chez les souris 15,16 faire la distinction entre ces cellules et pRBCs importants pour la mesure précise de rongeurs parasitémie. En utilisant cette méthode, la limite de détection de la parasitémie est d'environ 0,007% 14, mais il est possible de réduire ce aussi bas que 0,0005% dans de bonnes conditions. Notamment, cette limite est imposée par la propreté de la cytomètre de flux utilisé et la capacité d'obtenir un grand nombre d'événements dans un laps de temps raisonnable. Le problème le plus commun associé à l'utilisation de cette technique est insuffisante coloration esprith JC-1. La fluorescence de JC-1 dépend du potentiel de la membrane mitochondriale du parasite, et les parasites doivent être en bonne santé afin d'obtenir une coloration optimale. Un stockage prolongé des parasites ou fixation doit donc être évitée avant la coloration.
Des précautions doivent également être prises lors de l'analyse des parasites qui ont fait l'objet d'interventions de la drogue, car cela pourrait également affecter la mesure de la coloration avec JC-1. Dans ces cas, il peut être utile d'analyser sur la base de la parasitémie Hoechst fluorescence seul, par rapport à la parasitémie avec l'addition du colorant JC-1. En effet, cela peut fournir une mesure du nombre de parasites, ainsi qu'une indication globale de la santé du parasite. Enfin, le JC-1 colorant peut déplacer sa fluorescence à partir d'un pic à 529 nm à un pic à 590 nm en formant J-agrégats. La formation de ces agrégats dépend de la concentration de colorant, qui à son tour dépend du potentiel de la membrane mitochondriale de la cellule. La perte de mitochondrial potenti membraneal provoque un décalage de la fluorescence vers 529 nm, ce qui pourrait indiquer cellules sont apoptotique. Dans nos pRBCs expérience colorées avec JC-1 toujours fait preuve d'un motif de fluorescence similaire qui était d'environ égale intensité dans les deux 530/40 nm canal et le canal 585/42 nm. Cependant, dans certaines études, comme celles qui emploient interventions de drogue, il peut être intéressant de suivre l'évolution du rapport de fluorescence entre le 530/40 nm canal et le 585/42 nm canal pour toute indication de la perte du potentiel de membrane mitochondriale. Il est également important de noter que JC-1 est particulièrement sensible à la dégradation et doit être fraîchement préparée à partir d'une aliquote congelée comme décrit, tandis que les cycles de gel / dégel doivent être évités. Après coloration, JC-1 fluorescence est relativement stable avec peu ou pas de réduction de la fluorescence, au moins pendant plusieurs heures.
Pour le test in vivo de l'invasion, les deux facteurs les plus importants sont la cohérence dans le pr étiquetage RBCPROCESSUS et le moment de l'injection de sang marqué. Pour l'étiquetage RBC, le montant minimum de colorant doit être utilisé pour empêcher toute interférence avec la capacité du parasite à envahir le RBC, qui a été soulevée comme une possibilité lors de l'utilisation des étiquettes de surface 7. Dans les conditions d'étiquetage décrites ici invasion ne est pas inhibée 14, mais une attention particulière doit être accordée au maintien des concentrations d'étiquettes cohérentes et colorants doit être activée, afin d'éviter d'éventuelles inexactitudes dues à l'invasion inhibition par l'étiquette RBC. Comme parasites sont soumis à un cycle d'invasion synchronisée, il est important que les cellules marquées sont injectées au bon moment dans le cycle de vie des parasites. Ceci doit être fait de façon à maximiser le nombre d'événements d'invasion, et donc la précision du dosage. Dans notre expérience le pic de l'invasion se produit à mi-chemin à travers le cycle d'obscurité, faire une salle de cycle de lumière inverse avantageux pour cet essai.
La two dosage d'invasion de l'étiquette offre une méthode précise pour déterminer l'efficacité de l'invasion des mérozoïtes en différents types de RBC in vivo. Cette approche permet donc une comparaison entre les RBC traités, à savoir, trypsinisées, et les hématies témoins. Alternativement, les globules rouges de souris génétiquement modifiées pourraient être comparés à ceux des souris témoins, ou de globules rouges de différents paramètres physiologiques ou âge différent pourrait être comparé. Bien qu'une analyse similaire a été décrite pour la mesure de l'invasion in vitro 9, l'essai ici fournit le potentiel pour tenir compte des effets seulement présentes in vivo, y compris l'influence du système immunitaire, ce qui peut potentiellement modifier les mécanismes d'invasion des parasites 17-19. Enfin, ce dosage est également susceptible de fournir des indications sur les pathologies telles que la clairance immune de culot globulaire et la croissance du parasite, si les pRBCs dans les populations marquées sont surveillées sur une période prolongée.
Overall, un protocole détaillé pour la mesure précise de la parasitémie dans des échantillons in vivo est décrite, qui a un avantage sur les analyses précédentes en ce HJ-globules rouges peut être distinguée de pRBCs. En outre, un essai est décrit pour la quantification de l'efficacité de l'invasion en différents types de RBC in vivo.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien financier du Conseil national de recherches Santé et paramédical (accorder APP605524, 490037 et 1047082), le Conseil australien de la recherche (subvention DP12010061), la stratégie de l'infrastructure de recherche en collaboration nationale de l'Australie et le fonds d'investissement de l'éducation du ministère de l'Innovation, de l'Industrie , de la science et de la recherche. La LEMP est une récipiendaire d'un prix Postgraduate australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| JC-1 Dye | Life Technologies | T-3168 | Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO |
| Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0451-80 | Clone 30-F11 |
| Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0711-80 | Clone R17217 |
| Atto 633 NHS ester | Sigma-Aldrich | 1464 | Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21335 | Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | Streptavidin PE-Cy7 |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H478 | |
| 35 µM filter cap tubes | Becton Dickinson | 352235 | |
| Flow cytometer: BD LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD FACSAria II | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD Influx | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter |
References
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