Summary
פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.
Protocol
כל הנהלים בוצעו בהתאם למדיניות של אוניברסיטת Macquarie והותאמו למועצה הלאומית לבריאות והמחקר רפואי (NHMRC) הקוד אוסטרלי של תרגול. העבודה בוצעה תחת האתיקה הסכם לא ARA 2012/017 אושר והתקבל מוועדת האתיקה בבעלי חיים באוניברסיטת Macquarie. כל הניסויים בוצעו על עכברי SJL / J אלא אם צוין אחרת.
1. עכברים וזיהום ניסיון מלריה
- עכברי בית תחת טמפרטורה מבוקרת (21 מעלות צלזיוס) עם מחזור אור-חושך 00:12 שעות.
- להפשיר aliquot של פ cryopreserved DS Adami chabaudi עם 5% RBCs parasitized (pRBCs) ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של C57BL / 6 עכבר תורם.
- צג parasitemia עכבר תורם כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בסעיף 3 - 4 לפרוטוקול זה. ברגע שמגיעים לתורמים 5 - parasitemia 15%, לאסוף דם על ידי לנקב לב כדלקמן:
- לשאוב מפתרון הפרין (300 U הפרין / מיליליטר בפתרון העכבר Ringer (MTR) (154 מ"מ NaCl, 5.6 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 2.2 מ"מ CaCl 2, 20 מ"מ HEPES 100 μl, 10 גלוקוז מ"מ, 30 U / ml הפרין, pH 7.4, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר)) לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 26 G.
- להרדים את העכבר על ידי שאיפה עם isofluorane 5%, המאשר את העומק הרצוי של הרדמה על ידי היעדר תגובת נסיגת דוושה ורפלקסים של קרנית.
- הנח את העכבר על צידו ומחט להכניס ניצב ממש מתחת למרפק, דרך הצלעות, ואל תוך הלב. משוך את בוכנת מזרק באיטיות ובלסובב מחט עד 0.5-1 מיליליטר של דם מתקבל.
- לבצע המתת חסד הומנית נקע בצוואר רחם בהרדמה.
- לחשב את pRBCs לכל נפח של דם תורם בהנחת ספירה של 9 x 10 6 RBC / μl (דם כלומר, אם התורם היה ב 10% parasitemia כאשר הקריבו, דם יכיל 9 x 10 5pRBC / μl). לדלל דם parasitized בקרבס נאגר מלוח (126 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaHCO 3, 1.2 מ"מ לאא 2 PO 4, 1.2 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ CaCl 2, גלוקוז 0.2%, pH 7.2, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כך שהריכוז הוא 1 x 10 4 pRBCs ל-200 μl ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של עכברים הנדרשים לתיוג RBC וניסוי עירוי.
- צג parasitemia כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כמתואר בסעיפים 3-4 לפרוטוקול זה.
2. תיוג של RBCs ועירוי
- איסוף דם heparinized מעכברים ידי לנקב לב כמתואר בשלב 1.3, ומניח על קרח. לשמור על דם על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. לאסוף כ -200 דם μl לכל עכבר להיות מוזרק. במידת צורך, לפצל דם לשתי דגימות ולטפל דגימה אחת כרצוי.
הערה: בדרך זו, פלישה של samp טופלניתן להשוות le לשליטה, לדוגמא מטופל (ראה איור 1 עבור סכמטית). - הכן פתרון 2x של כל תווית RBC ניאון.
- לדלל 2 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 20 מיקרוגרם / מיליליטר.
- לדלל 25 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של ביוטין-N-Hydroxysuccinimide (ביוטין-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 250 מיקרוגרם / מיליליטר.
- פיצול דגימות דם לשני צינורות ולהוסיף נפח שווה של פתרון 633-NHS 2x Atto לצינור אחד, ונפח שווה של 2x יוטין-NHS לצינור האחר. מערבבים מייד. דגירה דם על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב איטי קבוע, או לחלופין, לערבב מדגם כל 10 - 15 דקות.
- לשטוף 3 פעמים שכותרתו דם עם MTRC (MTR 0.5% אלבומין + סרום שור (BSA), 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כדלקמן:
- הוסף לפחות 2 כרכים של MTRC, צנטריפוגות ב 750 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, וresuspenד גלולה בלפחות 2 כרכים של MTRC. חזור על פי 2 יותר.
- לאחר לשטוף הסופיים, צנטריפוגות ב 750 XG דקות ו -5 לשלב דם pelleted בשילובים שונים (כלומר, שלא טופל Atto 633 / ביוטין טופל, ביוטין שלא טופל / טופל Atto 633). להוסיף MTR לעשות עד נפח של 200 μl לכל עכבר להיות מוזרקות.
- הזרק דם שכותרתו intravascularly לעכברים נגועים במלריה מכרסם או בקרות נגוע כדלקמן:
- לבצע עירוי של 2 - parasitemia 15% בשיאו של רְבִיַת שֶׁסַע הטפיל.
הערה: זה קורה בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה (כלומר, בין 12-2 בבוקר במחזור אור רגיל, או 12-2 בערב במחזור אור הפוך). - עכברים חמים באמצעות מנורת חום למשך 5-10 דקות כדי להגביר את זרימת דם, אך לנקוט באמצעי זהירות שלא לחמם יותר מדי את העכברים. מניחים עכברים במכשיר הרחקה וintravascularly להזריק 200 μl דם שכותרתו (כ 1 - 2 x 10 RB 9Cs) דרך וריד הזנב.
- לבצע עירוי של 2 - parasitemia 15% בשיאו של רְבִיַת שֶׁסַע הטפיל.
- לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה כפי שתואר בסעיף 3.
ניתן לכמת שיעורי פלישה פחות מ -10 דקות לאחר הזרקה, בהתאם לparasitemia של עכבר הנמען: הערה.
3. איסוף דגימות דם והכנה לcytometry הזרימה
- הכן 50 μl של פתרון מכתים לדגימה, בתוספת נוספת, ביום של הניסוי כדלקמן:
- להפשיר aliquot של 6 מ"מ JC-1 המאוחסן ב -20 ° C בsulfoxide דימתיל (DMSO).
- 50 μl החם של MTRC לדגימה, בתוספת נוספת, עד 37 מעלות צלזיוס.
- בעוד ברציפות vortexing MTRC מראש חימם, להוסיף JC-1, כך שהריכוז הסופי הוא 12 מיקרומטר. הדבר נעשה כדי להפחית את היווצרות JC-1 אגרגטים; אם מצרפים אין טופס, לעשות צינור לא צנטריפוגות כמו זה יהיה למנוע הכתמה.
הערה: כמות קטנה של צבירה לא תשפיע על תוצאות. - להוסיף אנטיCD45 APC eFluor 780 ואנטי-CD71 PerCP eFluor 710, כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. אם ביצוע ניסוי RBC שכותרתו, להוסיף streptavidin PE-Cy7 כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1.
- בצע דימום זנב על ידי קטיעה של קצה הזנב או קריעה של כלי הדם בתוך הזנב. מניחים ירידה של דם זנב על שקופית לשקול סירה או זכוכית קטנה. לאחר איסוף דם, לוודא שדימום הפסק. פיפטה 3 μl דם זנב לתוך 50 μl של פתרון מכתים מראש לחמם 37 ° C ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- להפשיר aliquot של 4 מ"מ Hoechst 33342 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 355 ננומטר) או 2 מ"מ Hoechst 34580 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 405 ננומטר). הכן 500 μl לדגימה, בתוספת נוספת, של פתרון 4 מיקרומטר או 2 מיקרומטר של Hoechst בMTRC, בהתאמה.
- הוסף 500 μl של 4 מיקרומטר Hoechst33342 או 2 מיקרומטר Hoechst 34580 לדגימות לדגור על RT במשך 20 דקות.
- תאי צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס, supernatant קלפים שנזרקו, להוסיף 700 μl MTRC ולנתח ידי cytometry זרימה.
4. cytometry הזרימה
- ניתוח דגימות באמצעות לייזר 355/488/633 ננומטר או 405/488/633 מכשיר לייזר ננומטר.
- דגימות מסנן דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מייד לפני הניתוח. יש לשטוף את מסננת תא במים מזוקקים בין דגימות ושימוש חוזר.
- להקליט מספיק אירועים, כך שהאוכלוסייה הקטנה ביותר מכילה לפחות 500 אירועים (בדרך כלל 1,000,000 - 10,000,000 אירועים הכולל לדוגמה).
- Excite Hoechst 33342 באמצעות לייזר 355 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite Hoechst 34580 באמצעות לייזר 405 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite JC-1, אנטי-CD71 PerCP eFluor 710 וstreptavidin PE-Cy7 באמצעות לייזר 488 ננומטר ולזהות אירועים דרך 530/40, 692/40, ו750LP לסנן בהתאמהly. Excite Atto 633 ואנטי-CD45 APC eFluor 780 באמצעות לייזר 633 ננומטר ולזהות אירועים דרך מסנן 670/30 או 750LP בהתאמה.
- ביצוע ניתוח ופיצוי באמצעות זרימה מתאימה cytometry תוכנת ניתוח כדלקמן:
- בחר תאים שלמים ולא לכלול רעש, פסולת, וטסיות דם המבוססת על FSC מאפיינים / SSC (איור 2 א). בחר תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2) או על ידי שימוש באזור שיא FSC יחס גובה (איור 2 ג).
- בחר RBCs הבוגר, ולא לכלול אבות RBC וכדוריות דם לבנות, המבוסס על הקרינה שלילית בPerCP eFluor 710 וAPC eFluor 780 הערוצים (איור 2 ד).
- אם ביצוע ניסוי RBC המסומן, בחר כל אוכלוסייה של RBCs שכותרתו מבוסס על PE-Cy7 וAtto 633 הקרינה ולנתח בנפרד (איור 3 א) אלה.
- בחר pRBCs המבוסס על הקרינה חיובית עבור שני JC-1 וHoechst (
5. חישובים וסטטיסטיקות
- לחשב parasitemia על ידי חלוקת מספר pRBCs במספר הכולל של תאי דם אדומים (כלומר, מספר האירועים בQ2 שער מחולק במספר האירועים בG4 שער). בעת ביצוע parasitemia assay הפלישה של שתי האוכלוסיות שכותרתו יכולה להיות מחושב על ידי חלוקת מספר pRBCs שכותרתו במספר RBCs שכותרתו באוכלוסייה ש( כלומר, מספר האירועים שנמצאים בשני L1 השערים וQ2, מחולק במספר האירועים בשער L1).
הערה: parasitemia תווית משתנה במידה ניכרת בהתאם לגורמים כגון parasitemia ומספר merozoites במחזור אנדוגני. מסיבה זו, כדאי לדווח על יחס parasitemia, המחושב כparasitemia של המטופלים האוכלוסייה שהכותרת מחולקת בparasitemia של אוכלוסיית השליטה שכותרתו בכל עכבר בודד. כדי לתקן את השפעות צבע אפשריות, דו"ח תוצאותזה יחס parasitemia ממוצע על פני שני שילובי הצבע. - לקבוע מובהקות סטטיסטיות של יחסים באמצעות דגימה אחת -test t עם 1 כממוצע היפותטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדידה של parasitemia.
למדידה parasitemia, צריכים להיות ראשון שנבחרו תאי דם, ורעש, פסולת וטסיות דם נשללו, המבוססים על מאפייני FSC / SSC (איור 2 א). בהתאם לcytometer משמש, אז צריכים להיות נבחרו תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2), או גובה שיא FSC ליחס שטח (איור 2 ג). נותר אירועים צריכים להיות מורכבים של לויקוציטים, מוכתם חיובי לAPC eFluor 780, אבות RBC (כולל reticulocytes), מוכתמים חיובי לPerCP eFluor 710, וRBCs הבוגר, שלילי עבור שני כתמים אלה (איור 2 ד). לאחר בחירת אוכלוסיית RBC הבוגרת, אירועים צריכים להפריד לארבע אוכלוסיות כאשר הקרינה JC-1 זממה נגד Hoechst 33342 (איור 2E, F) או Hoechst 34580 הקרינה (איור 2G, ח). האוכלוסייה החיובית הכפולה מייצגת RBCs parasitized, בעוד rאוכלוסיות emaining הם או RBCs נגוע (שלילי כפול), HJ-RBCs (Hoechst חיובי, שלילי JC-1), או תאים לא ידועים (JC-1 חיובי, Hoechst שלילי). יש לציין, הקרינה JC-1 יכולה לעבור ממקסימום ב529 nm לשיא פליטה רחב ב590 ננומטר, בהתאם לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של התא. ללא קשר לשינוי זה JC-1 יהיה לזרוח בעוצמה ב530 / 40 ננומטר הערוץ, מה שהופך את הערוץ הזה מתאים ביותר לניתוח. עם זאת, במקרים מסוימים זה עשוי להיות כדאי בנוסף שיא הקרינה ב585 / 42 ננומטר הערוץ, אשר עשוי לספק אינדיקציה לפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של תאים. בדגימות נגוע פחות מ 0.007% מאירועים צריכים להיות חיוביים כפול (איור 2E, G). תוצאה זו תהיה תלויה בניקיון של cytometer את הזרימה ועלולה להשתנות במידה ניכרת, ניקוי מקיף לפני הניתוח עשוי לשפר את התוצאות. HJ-RBCs הדין וחשבון על 0.3-0.9% מRBCs הבוגר, מה שהופך את התוספת של הצבע JC-1 קריטית לaccמדידת urate של parasitemia הנמוך.
הערכה של פלישת merozoite.
לאחר שהזריק לעכברים שכותרתו RBCs נגועים ניתן לקבוע שיעורי הפלישה ביחס לשתי האוכלוסיות שכותרתו. יש לנקוט דגימות דם ומוכנות כפי שתוארו למדידת parasitemia עם התוספת של streptavidin PE Cy7. הזמן שבו המדגם נלקח תלוי בתנאי הניסוי והתוצאות רצויות של הניתוח. באופן כללי, נקודת זמן מוקדמת יותר תהיה הטוב ביותר משקפת פנוטיפ פלישה, למרות שזה עשוי להיות מועיל כדי לאסוף נקודות זמן מרובות כדי להגדיל את הדיוק. לניתוח הזרימה cytometry נתונים, יש לבחור RBCs הבוגר כמו באיור 2. מהתאים אלה, ניתן לזהות Atto 633 וRBCs ביוטין שכותרתו מבוססים על הקרינה בערוצי 670/30 ו750LP בהתאמה (איור 3 א). מכאן ואילך שלוש אוכלוסיות RBC (633 Atto, ביוטין, וללא תווית)יש לנתח בנפרד. בכל אחד מparasitemia האוכלוסיות אלה יכול להיקבע על בסיס צביעה עם Hoechst וJC-1 (איור 3-D).
איור 1. סכמטי של assay הפלישה טפילה in vivo. דוגמא לאופן שassay זה יכול לשמש כדי לקבוע שיעורי פלישה יחסי בRBCs יטופלו בהתאם לשאלה הביולוגית של המשתמש מוצג. דם שנאסף מעכברים נגוע מחולק לשני צינורות. מטופל צינור אחד כרצוי תוך המדגם האחר אינה מטופלת כראוי (). צינורות מתחלקים שוב עם אחד שכותרתו עם NHS-ביוטין והשני עם NHS-Atto 633 (ב). דוגמאות משולבות לאחר מכן בשני שילובים; ביוטין שכותרתו RBCs טופל בAtto 633 RBCs שלא טופל שכותרת וכותרתו טופל Atto 633 RBCs עם יוRBCs פח שכותרתו שלא טופל (C). שני שילובים הללו מוזרקים בנפרד לשני המון עכברים נגועים ברְבִיַת שֶׁסַע ב2-15 parasitemia% (D). סכום כולל של 6 עכברי נמען מומלץ כדי להשיג מובהקות סטטיסטיות בתוצאה, אם כי פחות או יותר ניתן להשתמש במידת הצורך. מעובד מתוך Lelliott et al. 14, שפורסם במקור על ידי ביומד המרכזי.
איור 2. מדידה של parasitemia ידי cytometry זרימה. רסיסים, רעש, וטסיות דם יוסרו מניתוח המבוססים על מאפייני FSC / SSC (). לאחר מכן תאים בודדים שנבחרו מהתאים הנותרים המבוססים על או רוחב דופק הדק (B), או שיא FSC ליחס שטח (C). סוגי תאים אז יכולים להיות מכובד על בסיס צביעה חיובית עם eFluor CD45 APC780 (לויקוציטים), CD71 PerCP eFluor 710 (אבות RBC), או מכתים שלילי (להבשיל RBCs) (D). לאחר בחירת RBCs הבוגר, תאים הם או:, JC-1 שלילי Hoechst וJC-1 (RBCs parasitized) החיובי Hoechst חיובי ושלילי JC-1 (RBCs מכיל גופי Howell Jolly), חיובי ושלילי Hoechst (תאים לא ידועים), או כפול (RBCs נגוע). נגוע וP. chabaudi דגימות נגועות מוכתמות Hoechst 33342 (E, F), או Hoechst 34580 (G, H), מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הערכה של פלישת merozoite לשתי אוכלוסיות RBC שכותרת in vivo. מגרשים של RBCs הבוגר, מגודרכמו באיור 2. ניתן לבחור שתי אוכלוסיות RBC שכותרתו מבוססת על התווית שלהם (). Atto 633 תאים שכותרתו לזרוח בערוץ 670/30 (L1), תאי ביוטין שכותרתו להיקשר לstreptavidin ולזרוח בערוץ PE-Cy7 (L3), ותאים ללא תווית שליליים לכתמים אלה (L4). בכל אחד מאוכלוסיות אלה ניתן לזהות RBCs parasitized מבוסס על Hoechst וJC-1 מכתים חיובי (Q2) (BD). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תיארתי שיטה למדידה של שתי פלישת parasitemia וmerozoite של דגימות in vivo. במונחים של מדידת parasitemia, שיטה זו מציעה יתרון על פני שיטות קודמות 10-13 שבHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs, ובכך להפחית את מספר האירועים חיוביים כוזבים. בעוד HJ-RBCs הוא בדרך כלל נדיר בבני אדם, כמה מחקרים מדווחים על רמות גבוהות בעכברים 15,16 עושים ההבחנה בין תאים אלה וpRBCs החשובים למדידה מדויקת של parasitemia מכרסמים. באמצעות שיטה זו המגבלה של זיהוי לparasitemia הוא כ 0.007% 14, למרות שזה אפשרי כדי להפחית נמוך כמו זה 0.0005% בתנאים המתאימים. יש לציין, מגבלה זו מוכתבת על ידי הניקיון של cytometer את הזרימה משמש והיכולת להשיג מספר גדול של אירועים בזמן סביר. הבעיה הנפוצה ביותר הקשורים לשימוש בטכניקה זו היא שנינות צביעה מספיקהh JC-1. הקרינה של JC-1 תלויה בפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של הטפיל, וטפילים חייבים להיות בריאים על מנת לקבל מכתים אופטימלי. אחסון ממושך של טפילים או קיבעון לכן יש להימנע לפני הצביעה.
גם טיפול צריך להיות למימוש בעת ניתוח טפילים אשר היו כפוף לטיפול תרופתי, כפי שזה עשוי להשפיע גם על המידה של מכתים עם JC-1. במקרים אלה עשויים להיות מועילים כדי לנתח parasitemia המבוסס על הקרינה Hoechst לבד, בהשוואה לparasitemia עם התוספת של הצבע JC-1. ואכן, זו עשויה לספק מידה של ספירה טפילה, כמו גם אינדיקציה כוללת של בריאות טפיל. לבסוף, הצבע JC-1 יכול להעביר הקרינה שלה משיא ב529 nm לשיא ב590 ננומטר על ידי יצירת J-אגרגטים. ההיווצרות של אגרגטים אלה תלויה בריכוז צבע, אשר בתורו תלוי בפוטנציאל קרום המיטוכונדריה של התא. אובדן potenti קרום המיטוכונדריהאל גורם לשינוי בקרינה לכיוון 529 ננומטר, אשר עשוי להצביע על תאים אפופטוטיים. בpRBCs הניסיון שלנו מוכתם בJC-1 תמיד הציג דפוס הקרינה דומה שהיה בעוצמה שווה בערך בשני 530/40 ננומטר הערוץ והערוץ 585/42 ננומטר. עם זאת, בחלק מהמחקרים, כדוגמת אלה המעסיקים התערבויות סמים, זה עשוי להיות כדאי לעקוב אחר שינויים ביחס בין הקרינה 530/40 ננומטר הערוץ וערוץ 585/42 ננומטר לכל אינדיקציות של אובדן פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כמו כן, חשוב לציין כי JC-1 הוא רגיש במיוחד לשפלה וצריכה להיות מוכן טרי מaliquot קפוא כפי שתואר, בזמן שיש להימנע מחזורי הקפאה / הפשרה. לאחר צביעה, הקרינה JC-1 היא יציבה יחסית עם ירידה קטנה או לא בקרינה, לפחות במשך כמה שעות.
עבור assay פלישת in vivo, הגורמים הקריטיים ביותר הם שני עקביות ביחסי ציבור תיוג RBCocess וזמן הזרקה של דם שכותרתו. לתיוג RBC, יש להשתמש בכמות המינימלית של צבע כדי למנוע כל הפרעה ליכולת של הטפיל לפלוש RBC, שהועלה כאפשרות בעת שימוש בתוויות משטח 7. בתנאי התיוג המתוארים כאן פלישה לא עכבה 14, אולם תשומת לב קפדן צריכה להינתן לשמירה על ריכוזי תווית עקביים, וצבעים צריכים להיות מופעל, כדי למנוע כל אי דיוקים בשל עיכוב פלישה על ידי תווית RBC. כטפילים לעבור מחזור פלישה מסונכרן, חשוב שתאי שכותרתו מוזרקים בזמן הנכון בכל מחזור החיים של טפילים. זה צריך להיעשות על מנת למקסם את מספר אירועי פלישה, ולכן הדיוק של assay. מניסיוננו השיא של פלישה מתרחש בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה, מה שהופך את חדר מחזור אור הפוך יתרון עבור assay זה.
Tוו assay פלישת תווית מציע שיטה מדויקת כדי לקבוע את יעילות פלישת merozoite לסוגים שונים של RBC in vivo. גישה זו לכן מאפשרת השוואה בין RBCs טופל, כלומר, trypsinized, וRBCs שליטה. לחלופין, RBCs מעכברים מהונדסים גנטי יכול להיות בהשוואה לאלו של עכברי שליטה, או RBCs של פרמטרים פיסיולוגיים שונים או גיל שונה ניתן להשוות. בעוד assay דומה תואר למדידת פלישה במבחנה 9, assay כאן מספק פוטנציאל לדין וחשבון על השפעות הנוכחיות רק in vivo, כוללים ההשפעה של המערכת החיסונית, אשר יכול לשנות את מנגנוני פלישה טפילה 17-19. לבסוף, assay זה גם יש את הפוטנציאל לספק תובנות פתולוגיות כגון אישור חיסוני של pRBCs, וצמיחה טפילה, אם pRBCs בתוך האוכלוסיות שכותרתו מנוטר על פני תקופה ממושכת.
Overall, פרוטוקול מפורט למדידה מדויקת של parasitemia בin vivo דגימות מתואר, שבו יש יתרון על פני מבחני קודמים בכך שHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs. יתר על כן, assay מתואר לכימות של יעילות פלישה לסוגים שונים RBC in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים במימון התמיכה מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומי (להעניק APP605524, 490,037 ו1,047,082), המועצה האוסטרלית למחקר (להעניק DP12010061), האסטרטגיה המחקר המשותפת התשתיות הלאומיות של אוסטרליה ושל קרן החינוך להשקעה מהמחלקה לחדשנות, תעשייה , מדע ומחקר. PML הוא נמען של הפרס שלאחר התואר הראשון באוסטרליה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| JC-1 Dye | Life Technologies | T-3168 | Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO |
| Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0451-80 | Clone 30-F11 |
| Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0711-80 | Clone R17217 |
| Atto 633 NHS ester | Sigma-Aldrich | 1464 | Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21335 | Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | Streptavidin PE-Cy7 |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H478 | |
| 35 µM filter cap tubes | Becton Dickinson | 352235 | |
| Flow cytometer: BD LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD FACSAria II | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD Influx | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter |
References
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).
- Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).
- Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).
- Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).
- Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9 (7), e101041 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1 (118), (2011).
- Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).
- Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).
- Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).
- Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13 (1), 100 (2014).
- Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).
- Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).
- Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).
- Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).
- Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).
