Summary
マラリア原虫が侵入し、赤血球内で複製する。メロゾイトの侵入および寄生虫の正確な評価は、マラリア感染の経過を評価するので、非常に重要です。ここでは、マラリアのマウスモデルにおいて、これらのパラメータを測定するためのフローサイトメトリーベースのプロトコルを説明する。
Protocol
すべての手順は、マッコーリー大学の方針に従って行われ、国立保健医療研究評議会（NHMRC）練習のオーストラリアのコードに適合した。仕事はなしARAが2012/017承認されておらず、マッコーリー大学の動物倫理委員会から得た同意の倫理で行った。特に明記しない限り、全ての実験は、SJL / Jマウスで行った。
1.マウスおよび実験マラリア感染
- 12：12時間の明暗サイクルで制御された温度（21℃）下でのハウスマウス。
- 凍結保存したPのアリコートを解凍5％の寄生赤血球（PRBCを）およびC57BL / 6ドナーマウスの腹腔内腔に200μlのを注入するとchabaudiアダミの DS。
- このプロトコルの4 - 第3節で説明したように、フローサイトメトリーを用いて2日 - ごとに1ドナーマウスの寄生虫血を監視します。ドナーが5に達すると - 15％の寄生虫血を次のように、心臓穿刺により血液を収集してください。
- ヘパリン溶液を吸引し、100μlのマウスリンゲル液（MTR）で（300 U / mlのヘパリン（154ミリモルのNaCl、5.6のKCl、1mMのMgCl 2、2.2のCaCl 2、20mMのHEPES、10mMのグルコース、30 U / mlの26 G針を有する1ミリリットル注射器にヘパリン、pHが7.4、0.22μmのフィルター滅菌））。
- ペダル引っ込め反応および角膜反射の欠如によって麻酔の所望の深さを確認し、5％イソフルオラン吸入によりマウスを麻酔。
- その側にマウスを置き、垂直にちょうど肘下に、リブを通して、心臓に針を挿入します。ゆっくりとシリンジプランジャーを引き出し、0.5まで針を回転させる - 血液1mlのが得られる。
- 麻酔下で頸椎脱臼により人道的安楽死を実行します。
- 犠牲にするときドナーが10％の寄生虫血であった場合（ すなわち、血液が9×10 5を含むことになる9×10 6 RBC /μLの血球数を想定したドナー血液の体積あたりのPRBCをを計算PRBC /μL）。クレブスで寄生虫を血液を希釈食塩水（126 mMの塩化ナトリウム、2.5mMのKCl、25mMのNaHCO 3水溶液、1.2ミリモルのNaH 2 PO 4、1.2のMgCl 2、2.5mMのCaCl 2、0.2％グルコース、pH7.2の、滅菌し、0.22μMフィルター）をバッファリング濃度が200μLあたり1×10 4 PRBCをされ、RBC標識および輸血実験に必要なマウスの腹腔内腔に200μlのを注入するようにします。
- このプロトコルの4 - セクション3に記載したように、フローサイトメトリーを用いて2日 - ごとに1寄生虫血を監視します。
RBCおよび輸血の2ラベル
- ステップ1.3で説明したように心臓穿刺によりマウスからヘパリン化血液を収集し、氷上に置きます。すべての回で、4℃で血を保管してください。注射されるマウスあたり約200μlの血液を収集する。必要に応じて、2つのサンプルに血液を分割し、必要に応じて一つのサンプルを扱う。
注：治療SAMPのこのようにして、侵略ルは、対照、未処理のサンプル（概略については図1を参照）と比較することができる。 - 各蛍光RBCラベルの2倍溶液を調製する。
- 濃度が20μg/ mlのあるようにMTRにアトー633-N-ヒドロキシ（アトー633-NHS）の2mg / mlのストック溶液を希釈する。
- 濃度を250μg/ mlとなるようにMTRにおけるビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHSビオチン）の25 mg / mlのストック溶液を希釈する。
- つのチューブに血液サンプルを分割し、一本のチューブ、および他のチューブに2×ビオチンNHSの等量に2倍アトー633-NHS溶液の等量を加える。すぐに混ぜる。一定のゆっくり混合しながら1時間4℃で血液をインキュベートするか、あるいは、すべての10のサンプルをミックス - 15分。
- 次のようにMTRC（MTR + 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、滅菌し、0.22μMフィルター）で標識された血液を3回洗浄する。
- 、MTRCの少なくとも2ボリュームを追加し、5分間750×gで遠心、上清を除去し、resuspenMTRCの少なくとも2倍量のペレットはd。 2回以上繰り返します。
- 最終洗浄、5分間750×gで遠心分離し、異なる組み合わせでペレット化した血液を組み合わせた後（ すなわち、未処理アトー633 /ビオチン治療、未処理ビオチン/はアトー633処置）。注射されるマウスあたり200μlの容量を最大にするMTRを追加します。
- 次のように血管内ネズミマラリアに感染したマウスまたは未感染のコントロールにラベル血液を注入：
- 寄生虫の増員生殖のピーク時には15％の寄生虫血 - 2での輸血を行います。
注：これは暗サイクルを通してほぼ中間に発生（ すなわち、12〜 -リバースライトサイクルで午後2時-通常の光サイクルで午前2時、または12）。 - 5-10分間加熱ランプを使用して暖かいマウスは、血流を増加させるが、マウスを過熱しないように予防措置を取る。拘束装置にマウスを置き、血管内の血液（約1ラベル200μL注入する- 2×10 9 RBを尾静脈を介してCS）。
- 寄生虫の増員生殖のピーク時には15％の寄生虫血 - 2での輸血を行います。
- セクション3で説明したように、注射後の異なる時点で血液サンプルを収集する。
注：侵入率はレシピエントマウスの寄生虫血に応じて、注射後10分未満を定量することができる。
フローサイトメトリーのための血液試料と準備の3コレクション
- 次のように実験の日に、染色サンプルあたりのソリューションに加え、余分な50μlのを準備します。
- ジメチルスルホキシド中で、-20℃（DMSO）で保存6mMのJC-1のアリコートを解凍。
- ウォーム50サンプルあたりMTRCのμL、プラス37℃、余分な。
- 最終濃度が12μMになるように継続的に予め温めMTRCにボルテックスしながら、JC-1を追加します。これは、JC-1の凝集体の形成を減少させるために行われる。凝集体は、フォームをすれば、このような遠心分離管は染色を防ぐことができますしないでください。
注：集計少量の結果には影響しません。 - 抗追加CD45 APC eFluor 780及び抗CD71 PerCPをeFluor 710最終濃度を1μg/ mlとなるように。ラベルRBC実験を実施した場合、最終濃度が1μg/ mlのであるように、ストレプトアビジンPE-Cy7はを追加します。
- テール内の血管の尾や裂傷の先端の切断によりテール出血を実行します。小さな量るボートやスライドガラス上にテール一滴の血液を置きます。採血後、出血が停止したことを確認してください。染色溶液50μlに尾血液のピペット3μlを37℃に予め加温し、20分間37℃でサンプルをインキュベートする。
- （355 nmのレーザーを使用する場合）を蒸留水中で-20℃で保存し、4mMのヘキスト33342または（405 nmのレーザーを使用する場合）を蒸留水中で-20℃で保存し2mMのヘキスト34580のアリコートを解凍。それぞれ、サンプルあたり500μLを準備し、プラス余分な、MTRCでヘキストの4μMまたは2μMソリューションの。
- 4μMヘキスト500μlのを追加します。サンプル33342または2μMのヘキスト34580と室温で20分間インキュベートする。
- 4℃で3分間750×gで遠心細胞、上清を捨てるには、フローサイトメトリーで700μlのMTRCを追加し、分析する。
4.フローサイトメトリー
- 355/488/633 nmレーザーまたは405/488/633 nmのレーザー機器を使用してサンプルを分析する。
- 分析の前にすぐに35μMのセルストレーナーを通してフィルター試料。サンプルと再使用との間に蒸留水でセルストレーナーをすすぐ。
- （ - サンプルあたり千万総イベント通常百万）最小の人口は、少なくとも500のイベントが含まれているように、十分なイベントを記録します。
- 355 nmのレーザーを使用してヘキスト33342エキサイトと50分の460フィルタを通してイベントを検出。 405 nmのレーザーを使用してヘキスト34580エキサイトと50分の460フィルタを通してイベントを検出。エキサイトJC-1、抗CD71 PerCPをeFluor 710とストレプトアビジンPE-Cy7は488 nmのレーザーを使用し、40分の530を介してイベントを検出し、40分の692、および750LP各フィルタLY。 633nmのレーザーを用いアトー633及び抗CD45 APC eFluor 780を励起し、それぞれ30分の670または750LPフィルターを通してイベントを検出。
- 次のように適当なフローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて解析し、補正を行う。
- 全細胞を選択し、ノイズを排除し、破片、およびFSC / SSCの特性（ 図2A）に基づく血小板。いずれかのトリガーパルス幅（ 図2B）または高さの比（ 図2C）にFSCピーク面積を使用してベース単一細胞を選択する。
- 成熟した赤血球を選択し、PerCPをeFluor 710とAPC eFluor 780チャンネル（ 図2D）における負の蛍光に基づいて、赤血球前駆細胞および白血球を除外する。
- ラベルRBC実験を実施する場合は、PE-Cy7はとアトー633蛍光に基づいてラベルRBCの各集団を選択し、これらを別々に（ 図3A）を分析。
- JC-1とヘキスト（両方に陽性蛍光に基づいてPRBCをを選択
5.計算と統計
- RBCの総数でPRBCを数で割ることによって寄生虫血症を計算する（ すなわち、ゲートG4内のイベントの数で割ったゲートQ2のイベント数）。 2標識された集団の浸潤アッセイの寄生虫を行う場合（すなわち、集団における標識されたRBCの数により標識PRBCを数で割ることによって計算することができる、すなわち、ゲートL1及びQ2の両方にあるイベントの数、イベントの数で割ったものゲートL1で）。
NOTE：寄生虫がかなり内因性寄生虫循環メロゾイトの数などの要因に応じて変化する標識。このため、個々のマウスにおける制御標識集団の寄生虫で除算処理した標識された集団の寄生虫のように計算される寄生虫比を報告することが有用である。可能な色素の影響を補正するために、レポートの結果2染料の組み合わせ全体の平均寄生虫比だ。 - 仮定の平均として1で1 標本t -testを使用して比率の統計的有意性を決定します。
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Representative Results
寄生虫の測定。
寄生虫血の測定のために、血液細胞が最初に選択されるべきであり、ノイズ、破片および血小板は、FSC / SSCの特性（ 図2A）に基づいて、除外した。使用するフローサイトメーターに応じて、単一の細胞を、次いで、面積比（ 図2C）のいずれかでトリガーパルス幅（ 図2B）、またはFSCピーク高さに基づいて選択されるべきである。残りのイベントは、APC eFluor 780について陽性に染色、白血球からなるべき、（網状赤血球を含む）のRBC前駆細胞は、これらの汚れ（ 図2D）の両方の負の、PerCPをeFluor 710、および成熟赤血球について陽性に染色。 JC-1蛍光はヘキスト33342（ 図2E、F）またはヘキスト34580（ 図2G、H）蛍光に対してプロットされたときに成熟したRBC集団を選択した後、イベントは4集団に分離する必要があります。デュアル陽性集団は、rながら、被寄生赤血球を表し、emaining集団が感染していないのRBC（デュアルネガティブ）、HJ-赤血球（ヘキスト正、JC-1陰性）、または未知の細胞（負のJC-1陽性、ヘキスト）のいずれかである。特に、JC-1蛍光は、細胞のミトコンドリア膜電位に依存して、590nmのブロードな発光ピークを529 nmでの最大値からずれること。かかわらず、このシフトのJC-1は、分析のために、このチャネルが最も適して、40分の530 nmのチャネルに強く蛍光を発する。しかし、いくつかの例では、細胞のミトコンドリア膜電位の指標を提供することができる585/42 nmのチャネルに加えて、レコード蛍光に価値があるかもしれません。感染していない試料ではイベント未満の0.007％は、デュアル正（ 図2E、G）である必要があります。この結果は、分析の前に大規模な洗浄結果を向上させることが、フローサイトメーターの清浄度に依存し、かなり変化し得る。 accのための重要なJC-1色素の添加を行う、成熟赤血球の0.9％ - HJ-RBCを0.3占め低寄生虫血の尿酸の測定。
メロゾイト侵略の評価。
感染マウスへの標識赤血球を注入した後、2標識の集団への相対的な侵入率を決定することができる。血液サンプルを採取し、ストレプトアビジンPE Cy7は添加して寄生虫血症の測定のために記載したように調製されるべきである。サンプルが取得された時刻は、実験条件および分析の所望の結果に依存する。それは精度を高めるために、複数の時点で収集することが有益であり得るが、一般に、より早い時点で最高の浸潤表現型を反映する。フローサイトメトリーデータの分析のために、成熟した赤血球は、 図2のように選択されるべきである。これらの細胞から、アト633及びビオチン標識された赤血球は、それぞれ、30分の670及び750LPチャネル蛍光（ 図3A）に基づいて同定することができる。ここで3 RBC集団（アトー633、ビオチン、および標識されていない）上から、別々に分析する必要があります。これらの集団の寄生虫のそれぞれにヘキストおよびJC-1（ 図3B-D）での染色に基づいて決定することができる。
インビボでの寄生虫浸潤アッセイの図1.。このアッセイは、ユーザの生物学的問題に応じて処理された赤血球の相対的な侵入率を決定するために使用できる方法の例が示されている。非感染マウスから採取した血液は、2つのチューブに分けられる。一方のチューブは、他のサンプルは、未処理（A）を残したまま所望のように扱われる。チューブを再びNHS-ビオチンで標識された1とNHS-アトー633（B）と相互に分割されている。次に、試料を2つの組み合わせで組み合わされる。ビオチンは、アトー633ラベル未処理RBCおよびバイオとアトー633ラベル扱わ赤血球で処理されたRBCをラベル錫ラベル未処理のRBC（C）。 15％の寄生虫血症（D） -これらの2つの組み合わせは、2での増員生殖の間に感染したマウスの2ロットに別々に注入されている。必要に応じて、多かれ少なかれが使用されてもよい6レシピエントマウスの合計は、結果の統計的有意性を得るために推奨される。 Lelliott ら 14から適応、もともとBioMed Central社から出版。
フローサイトメトリーによる寄生虫の図2の測定。デブリ、ノイズ、および血小板をFSC / SSCの特性（A）に基づいて分析から除外されている。単一細胞を、次いで面積比（C）のいずれかのトリガーパルス幅（B）、またはFSCピークに基づいて、残りの細胞から選択される。細胞型は、その後CD45 APC eFluor正の染色に基づいて区別することができる780（白血球）、CD71 PerCPをeFluor 710（RBC前駆細胞）、またはネガティブ染色（RBCを成熟）（D）。成熟した赤血球を選択した後、細胞を、以下のとおりです。ヘキストとJC-1陽性（寄生赤血球）、正のヘキストとJC-1陰性（ハウエルジョリー小体を含むのRBC）、JC-1陽性とヘキスト負（未知の細胞）、またはデュアル負（非感染赤血球）。非感染とP.ヘキスト33342（E、F）、またはヘキスト34580（G、H）で染色感染したサンプルをchabaudi、示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生体内で 2ラベルのRBC集団にメロゾイト侵入3.アセスメント図 。プロットは、成熟したRBCのゲートされ、図2のように二つの標識されたRBC集団は、それらのラベル（A）に基づいて選択することができる。アトー633標識された細胞は、30分の670チャネル（L1）で蛍光を発する、ビオチン標識された細胞は、ストレプトアビジンに結合し、PE-Cy7のチャネル（L3）で蛍光を発する、および非標識細胞は、これらの汚れ（L4）に陰性である。これらの集団のそれぞれにおいて、赤血球は、ヘキストとJC-1陽性染色（Q2）（BD）に基づいて特定することができる寄生さ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は、in vivoでのサンプルの両方寄生虫およびメロゾイトの侵入を測定するための方法を記載している。寄生虫血の測定に関しては、この方法は、それによって偽陽性事象の数を減少させる、PRBCを区別することができるHJ-赤血球における以前の方法10-13に優る利点を提供する。 HJ-RBCは、ヒトでは通常まれですが、いくつかの研究では、これらの細胞とげっ歯類寄生虫の正確な測定のための重要なPRBCを区別をするマウス15,16で高いレベルを報告します。それは適切な条件の下で0.0005％と低いこれを低減することが可能であるが、この方法の寄生虫の検出限界を使用して、約0.007％14である。注目すべきことに、この制限は、使用されるフローサイトメーターの清浄度および妥当な時間で多数のイベントを得る能力によって決定される。この技術の使用に関連する最も一般的な問題は、不十分な染色ウィットある時間JC-1。 JC-1の蛍光は寄生虫のミトコンドリア膜電位に依存し、寄生虫は、最適な染色を得るために健康でなければなりません。寄生虫や固定物の長期保管のため、染色の前に避けるべきである。
薬物介入の対象となっている寄生虫を分析する際に、これはまた、JC-1での染色の度合いに影響を与える可能性があるケアも、行使されるべきである。これらのケースでは、JC-1染料を添加した寄生虫血と比較して、単独で、ヘキスト蛍光に基づいて寄生虫血を分析することが有益であり得る。実際、これは寄生虫数の尺度、ならびに寄生虫の健康の全体的な表示を提供することができる。最後に、JC-1染料は、J会合体を形成することにより、590nmでピークに529 nmでのピークからの蛍光をシフトすることができる。これらの凝集体の形成は、次に、細胞のミトコンドリア膜電位に依存する色素濃度に依存する。ミトコンドリア膜potentiの損失らは、細胞がアポトーシスであることを示すことができる529ナノメートルに向かって蛍光のシフトを引き起こす。我々の経験では、JC-1で染色したPRBCを、常に40分の530 nmのチャネルと585/42 nmのチャネルの両方でほぼ等しい強度であった類似の蛍光パターンを示した。しかし、いくつかの研究では、そのような薬物介入を用いるものとしては、40分の530 nmのチャネルとミトコンドリア膜電位の損失の兆候のための585/42 nmのチャネルとの間の蛍光比の変化を監視するために価値があるかもしれません。これは、JC-1は、分解に対して特に感受性であると説明されているように凍結/融解サイクルを避けるべきであるながら新たに凍結アリコートから調製されるべきであることに留意することも重要である。染色後、JC-1蛍光は少なくとも数時間にわたる蛍光のほとんど又は全く減少、比較的安定している。
インビボでの浸潤アッセイのために、二つの最も重要な要因は、RBC標識広報の一貫性であるocessおよび標識された血液の注入時間。 RBC標識のために、染料の最小量は、表面ラベル7を使用するときに可能性として提起されたRBCを、侵入する寄生虫の能力との干渉を防止するために使用されるべきである。ここに記載の標識条件下で浸潤が細心の注意を一貫ラベル濃度を維持するために与えられるべきである、14に阻害されず、染料がRBCラベルの侵入阻害に起因する不正確さを防ぐために、切り替えられるべきである。寄生虫が同期侵略サイクルを受けるように、標識された細胞は、寄生虫のライフサイクルの適切なタイミングで注入されることが重要である。これは、侵入イベントの数、したがって、アッセイの精度を最大化するために行われるべきである。我々の経験では侵略のピークは、このアッセイのための有利なリバースライトサイクルの部屋を作り、およそ中間暗サイクルを介して行われます。
トンラベル浸潤アッセイは、in vivoでの RBCの異なるタイプにメロゾイト侵入効率を決定するための正確な方法を提供ヲ。このアプローチは、したがって、処理された赤血球、 すなわち、トリプシン処理し、そしてコントロール赤血球との間の比較を可能にする。代替的に、遺伝的に改変されたマウスからのRBCは、対照マウスのものと比較することができ、または異なる生理学的パラメータまたは異なる年齢のRBCを比較することができる。同様のアッセイが、インビトロ 9 に侵入測定のために説明してきたが、ここでアッセイは、潜在的に、寄生虫の侵入メカニズム17-19を変えることができる免疫系の影響を含む、インビボでのみ存在する効果を考慮する可能性を提供する。標識された集団内のPRBCを長期間にわたって監視されている場合、最終的に、このアッセイはまた、免疫PRBCを、クリアランス、および寄生虫の成長としての病態への洞察を提供する可能性がある。
Overaのllは、 インビボでのサンプル中の寄生虫血を正確に測定するための詳細なプロトコルは、そのHJ-赤血球内の前のアッセイよりも利点を有する、記載されているがPRBCを区別することができる。さらに、アッセイは、インビボで異なるRBCタイプに侵入効率を定量するために記載されている。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは、国立保健医療研究評議会（APP605524、490037と1047082を付与）、オーストラリア研究会議（DP12010061を付与）、オーストラリア国立共同研究インフラ戦略とイノベーション省から教育投資ファンド、産業界からの支援に資金を提供しアクノリッジ、科学·研究。 PMLは、オーストラリアの大学院賞を受賞です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| JC-1 Dye | Life Technologies | T-3168 | Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO |
| Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0451-80 | Clone 30-F11 |
| Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0711-80 | Clone R17217 |
| Atto 633 NHS ester | Sigma-Aldrich | 1464 | Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21335 | Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | Streptavidin PE-Cy7 |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H478 | |
| 35 µM filter cap tubes | Becton Dickinson | 352235 | |
| Flow cytometer: BD LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD FACSAria II | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD Influx | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter |
References
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