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Immunology and Infection

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

Protocol

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Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Macquarie University durchgeführt und entsprach der nationalen Gesundheits-und Medical Research Council (NHMRC) Australian Verhaltenskodex. Die Arbeit wurde im Rahmen des Abkommens Ethik Kein ARA 2012/017 genehmigt und von der Tierethikkommission an der Macquarie Universität erhalten durchgeführt. Alle Experimente wurden an SJL / J-Mäusen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Mäuse und experimentelle Malariainfektion

  1. Hausmäuse bei kontrollierter Temperatur (21 ° C) mit einem 12:12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus.
  2. Tauwetter ein Aliquot von kryokonservierten P. chabaudi adami DS mit 5% parasitierten Erythrozyten (PRBCs) und injizieren 200 ul in die Bauchhöhle von C57BL / 6 Spendermaus.
  3. Überwachen Spendermaus Parasitämie alle 1 - 2 Tage mittels Durchflusszytometrie, wie in Abschnitt 3 beschrieben - 4 dieses Protokolls. Sobald Spendern erreicht 5 - 15% Parasitämie, sammeln Blut durch Herzpunktion wie folgt:
    1. Aspirat 100 ul Heparin (300 U / ml Heparin in der Maus Ringer-Lösung (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2,2 mM CaCl 2, 20 mM HEPES, 10 mM Glucose, 30 U / ml Heparin, pH 7,4, 0,22 um Filter sterilisiert)) in eine 1 ml Spritze mit einer 26 G-Nadel.
    2. Anesthetize die Maus durch Inhalation mit 5% Isofluoran bestätigte die gewünschte Tiefe der Anästhesie durch Fehlen Pedalrückzugsreaktion und Hornhautreflexe.
    3. Platzieren der Maus auf die Seite und senkrecht Einstichkanüle gerade unterhalb des Ellenbogens, durch die Rippen und in das Herz. Langsam herausziehen Spritzenkolben und drehen Nadel bis 0,5-1 ml Blut erhalten wird.
    4. Führen humane Sterbehilfe durch Genickbruch unter Narkose.
  4. Berechne die prbcS pro Volumen von Spenderblut Annahme einer Blutbild von 9 x 10 6 RBC / ul (dh, wenn der Spender mit 10% Parasitämie bei geopfert Blut 9 x 10 5 enthältpRBC / ul). Verdünne parasitierten Blut in Krebs-gepufferter Salzlösung (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 0,2% Glucose, pH 7,2, 0,22 um Filter sterilisiert) so dass die Konzentration 1 x 10 4 prbcS pro 200 & mgr; l und 200 & mgr; l Injektion in die Bauchhöhle von Mäusen für die RBC Kennzeichnung und Transfusionsexperiment erforderlich.
  5. Überwachen Parasitämie alle 1 - 2 Tage mittels Durchflusszytometrie als in den Abschnitten 3 beschrieben - 4 dieses Protokolls.

2. Markierung der Erythrozyten und Transfusions

  1. Sammeln heparinisiertem Blut von Mäusen durch Herzpunktion, wie in Schritt 1.3 beschrieben, und legen Sie auf dem Eis. Halten Blut bei 4 ° C zu allen Zeiten. Sammeln etwa 200 ul Blut pro Maus injiziert werden. Bei Bedarf aufgeteilt Blut in zwei Proben und Behandlung einer Probe, wie gewünscht.
    HINWEIS: Auf diese Weise Invasion der behandelten sample kann zu einer Kontrolle verglichen werden, unbehandelten Probe (siehe Abbildung 1 schematisch).
  2. Bereiten Sie eine 2x Lösung von jeder Leuchtstoff RBC-Label.
    1. Verdünne eine 2 mg / ml Stammlösung von Atto 633-N-Hydroxysuccinimid (Atto 633-NHS) in MTR so daß die Konzentration 20 ug / ml.
    2. Verdünne mit 25 mg / ml Vorratslösung von Biotin-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-NHS) in MTR so daß die Konzentration 250 ug / ml.
  3. Aufgeteilt Blutproben in zwei Röhrchen entnommen und das gleiche Volumen von 2x Atto 633-NHS-Lösung auf ein Rohr, und ein gleiches Volumen von 2x-Biotin-NHS zur anderen Röhre. Mischen Sie sofort. Inkubieren Blut bei 4 ° C für 1 h mit konstantem langsamem Mischen oder alternativ mischen Probe jedes 10-15 min.
  4. Blut beschriftet 3 Mal Waschen mit MTRC (MTR + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,22 um Filter sterilisiert) wie folgt:
    1. Fügen Sie mindestens 2 Volumina MTRC, Zentrifuge bei 750 xg für 5 min, entfernen Sie den Überstand und resuspend die Pellets in mindestens 2 Volumina MTRC. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
    2. Nach dem letzten Waschen, Zentrifugieren bei 750 × g für 5 min pelletiert und verbinden das Blut in verschiedenen Kombinationen (dh unbehandelten Atto 633 / Biotin behandelten, unbehandelten Biotin / behandelt Atto 633). Hinzufügen MTR bis zu einem Volumen von 200 ul pro Maus zu machen, eingespritzt werden.
  5. Injizieren beschriftet Blut intravaskulär in Nagetier Malaria infizierten Mäusen oder infizierten Kontrollen wie folgt:
    1. Führen Trans bei 2 - 15% Parasitämie am Gipfel des Parasiten Schizonten.
      HINWEIS: In diesem Fall etwa in der Mitte durch die Dunkel-Zyklus (dh zwischen 12 bis 2 Uhr morgens an einem normalen Lichtzyklus oder 12-2 Uhr an einem umgekehrten Lichtzyklus).
    2. Warm-Mäuse mit einer Wärmelampe für 5-10 Minuten, um den Blutfluss zu erhöhen, aber keine Vorkehrungen, um die Mäuse überhitzen. Zeigen Mäuse in einem Rückhalteeinrichtung und intravaskulär injizieren 200 ul markierte Blut (ca. 1 - 2 x 10 9 RBCs) über die Schwanzvene.
  6. Sammeln von Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    HINWEIS: Invasion Raten von weniger als 10 min nach der Injektion quantitativ bestimmt werden, abhängig von Parasitämie der Empfängermaus.

3. Entnahme von Blutproben und Vorbereitung für die Durchflusszytometrie

  1. Vorbereitung 50 ul Farblösung pro Probe plus zusätzliche, am Tag des Experiments wie folgt:
    1. Abtauen eines Aliquots von 6 mM JC-1 bei -20 ° C in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert.
    2. Warm 50 ul MTRC pro Probe, plus extra, auf 37 ° C.
    3. Während kontinuierlich Vortexen des vorgewärmten MTRC Fügen JC-1, so dass die Endkonzentration 12 & mgr; M. Dies wird gemacht, um die Bildung von JC-1-Aggregate zu reduzieren; wenn Sie bilden Aggregate, nicht Zentrifugenröhrchen, da dies Färbung zu verhindern.
      ANMERKUNG: Eine kleine Menge von Aggregation hat keinen Einfluss auf Ergebnisse.
    4. Anti hinzufügenCD45 APC eFluor 780 und Anti-CD71 PerCP eFluor 710, so dass die Endkonzentration 1 ug / ml. Bei Durchführung des markierten RBC Experiment hinzuzufügen Streptavidin PE-Cy7, so daß die Endkonzentration 1 ug / ml.
  2. Führen Schwanz Blutungen durch Amputation der Schwanzspitze oder Platzwunde des Blutgefäßes in den Schwanz. Geben Sie einen Tropfen Blut Schwanz auf eine kleine wiegen Boot oder Glasträger. Nach der Blutentnahme, sicherzustellen, dass die Blutung aufgehört hat. Pipette 3 ul Schwanzblut in 50 & mgr; l Färbelösung auf 37 ° C vorgewärmt und Heizen von Proben bei 37 ° C für 20 min.
  3. Abtauen eines Aliquots 4 mM Hoechst 33342 bei -20 ° C in destilliertem Wasser (bei Verwendung eines 355 nm Laser) gespeichert oder 2 mM Hoechst 34580 bei -20 ° C in destilliertem Wasser (bei Verwendung eines 405 nm Laser) gespeichert. Bereiten Sie 500 ul pro Probe, plus extra, einer 4 & mgr; M oder 2 uM Lösung von Hoechst in MTRC auf.
  4. Fügen Sie 500 ul von 4 uM Hoechst33.342 oder 2 uM Hoechst 34.580 Proben und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min.
  5. Zentrifuge Zellen bei 750 g für 3 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen, fügen 700 ul MTRC und durch Strömungs analysieren Zytometrie.

4. Durchflusszytometrie

  1. Analysieren Sie die Proben mit einem 355/488/633 nm Laser oder 405/488/633 nm Lasergerät.
  2. Filter Proben durch einen 35 um Zellsieb unmittelbar vor der Analyse. Spülen Zellsieb mit destilliertem Wasser zwischen den Proben und Wiederverwendung.
  3. Nehmen Sie genug Ereignisse, so dass die kleinste Bevölkerung mindestens 500 Ereignisse (in der Regel eine Million - 10 Millionen Gesamt Ereignisse pro Probe).
  4. Excite Hoechst 33342 mit einem 355-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch eine 460/50-Filter. Excite Hoechst 34580 mit einem 405-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch eine 460/50-Filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 und Streptavidin PE-Cy7 mit einem 488-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch ein 530/40, 692/40 und 750LP filtern jeweiligenly. Excite Atto 633 und Anti-CD45 APC eFluor 780 mit einem 633-nm-Laser und erkennt Ereignisse durch ein 670/30 oder 750LP-Filter auf.
  5. Führen Sie die Analyse und Kompensation mit geeigneten Durchflusszytometrie-Analyse-Software wie folgt:
    1. Wählen ganze Zellen und verstehen sich inklusive Lärm, Schmutz und Blutplättchen basierend auf FSC / SSC Eigenschaften (Abbildung 2A). Auswahl einzelner Zellen, die entweder auf Triggerimpulsbreite (2B) oder mit dem FSC-Peakfläche zu Höhe Verhältnis (2C).
    2. Wählen reifen Erythrozyten und schließen RBC Vorläuferzellen und Leukozyten, basierend auf negativen Fluoreszenz in den PerCP eFluor 710 und APC eFluor 780 Kanäle (2D).
    3. Beim Arbeiten mit der Bezeichnung RBC Experiment, wählen Sie die einzelnen Population markierter Erythrozyten auf Basis von PE-Cy7 und Atto 633 Fluoreszenz und analysieren diese separat (3A).
    4. Wählen Sie basierend auf positive Fluoreszenz sowohl für JC-1 und Hoechst PRBCs (

5. Berechnungen und Statistik

  1. Berechnen Parasitämie durch Dividieren der Anzahl von prbcS durch die Gesamtzahl von Erythrozyten (dh die Anzahl von Ereignissen in Gate Q2 in Gatters G4 geteilt durch die Anzahl von Ereignissen). Bei der Durchführung des Invasionsassay Parasitämie der beiden markierten Populationen, indem die Anzahl der markierten prbcS durch die Anzahl der markierten RBCs in der Population (berechnet, dh, die Anzahl der Ereignisse, die in beide Tore L1 und Q2 sind, dividiert durch die Anzahl der Ereignisse, im Tor L1).
    HINWEIS: Labeled Parasitämie variiert beträchtlich in Abhängigkeit von Faktoren wie beispielsweise die endogene Parasitämie und Anzahl zirkulierender Merozoiten. Aus diesem Grund ist es hilfreich, die Parasitämie Verhältnis, das als das Parasitämie des behandelten markierten Population in jeder einzelnen Maus, geteilt durch die Parasitämie der Steuer markierten Population berechnete melden. Um mögliche Farbeffekte zu korrigieren, führt zu einem Berichts eine durchschnittliche Parasitämie Verhältnis zwischen den beiden Farbstoffkombinationen.
  2. Bestimmen Sie eine statistische Signifikanz von Verhältnissen mit dem eine Probe t-Test mit 1 als hypothetische Mittelwert.

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Representative Results

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Die Messung der Parasitämie.

Für die Messung der Parasitämie sollte Blutkörperchen zuerst ausgewählt werden, und Lärm, Schmutz und Plättchen ausgeschlossen, bezogen auf FSC / SSC-Eigenschaften (2A). Abhängig von der Zytometer verwendet wird, sollten einzelne Zellen dann basierend auf jeder Triggerimpulsbreite (2B) oder FSC Peakhöhe auf Flächenverhältnis (2C) ausgewählt werden. Verbleibende Ereignisse sollten von Leukozyten bestehen, gebeizt positiv für APC eFluor 780, RBC Vorfahren (inklusive Retikulozyten), gebeizt positiv für PerCP eFluor 710 und reifen Erythrozyten, negativ für diese beiden Flecken (2D). Nach der Auswahl des reifen RBC Population sollte Veranstaltungen in vier Populationen zu trennen, wenn JC-1-Fluoreszenz gegen Hoechst 33342 (2E, F) oder Hoechst 34580 (2G, H) Fluoreszenz aufgetragen. Die Dual-positiven Population repräsentiert Parasiten befallenen Erythrozyten, während die remaining Bevölkerung sind entweder nicht infizierten Erythrozyten (Dual-negativ), HJ-Erythrozyten (Hoechst positiven, JC-1 negativ), oder unbekannte Zellen (JC-1-positiven, Hoechst negativ). Bemerkenswert ist, JC-1-Fluoreszenz kann von einem Maximum bei 529 nm auf eine breite Emissionsspitze am 590 nm zu verschieben, in Abhängigkeit von der mitochondrialen Membranpotential der Zelle. Unabhängig von dieser Verschiebung JC-1 wird stark in der 530/40 nm Kanal fluoreszieren, so dass dieser Kanal am besten geeignet für die Analyse. In einigen Fällen kann es sinnvoll, zusätzlich Datensatz Fluoreszenz im 585/42 nm-Kanal, der einen Hinweis auf die mitochondriale Membranpotential von Zellen bereitstellen kann. In nicht-infizierten Proben weniger als 0,007% der Ereignisse sollte Dual positiven (2E, G) sein. Dieses Ergebnis wird auf die Sauberkeit des Durchflusszytometers abhängen und können beträchtlich variieren kann umfangreiche Reinigung vor der Analyse-Ergebnisse zu verbessern. HJ-RBCs entfallen 0,3-0,9% der reifen Erythrozyten, so dass die Zugabe des JC-1 Farbstoff kritisch für die accUrat Messung niedriger Parasitämie.

Bewertung der Merozoiten Invasion.

Nach der Injektion markierter Erythrozyten in infizierten Mäusen die relativen Invasion Raten in den beiden markierten Populationen bestimmt werden. Blutproben sollten aufgenommen und hergestellt wie für den Parasitämie Messung mit der Zugabe von Streptavidin PE Cy7 beschrieben. Der Zeitpunkt, zu dem die Probe entnommen wird, hängt von den experimentellen Bedingungen und den gewünschten Ergebnissen der Analyse. In der Regel wird ein früherer Zeitpunkt am besten widerspiegeln eine Invasion Phänotyp, obwohl es kann vorteilhaft sein, mehrere Zeitpunkte, um die Genauigkeit zu erhöhen. Für die Analyse der Durchflusszytometrie Daten sollte reifen Erythrozyten, wie in Figur 2 ausgewählt werden. Aus diesen Zellen kann Atto 633 und Biotin markiert RBCs anhand von Fluoreszenz in den 670/30 und 750LP Kanälen jeweils (3A) identifiziert werden. Von hier an den drei RBC Populationen (Atto 633, Biotin und unmarkiert)separat analysiert werden. In jeder dieser Populationen Parasitämie kann basierend auf Färbung mit Hoechst und JC-1 (3B-D) bestimmt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der in vivo Parasiten Invasion Assay. Ein Beispiel, wie dieser Test kann verwendet werden, um die relative Invasion Raten in den Erythrozyten nach biologischen Frage des Benutzers zu bestimmen behandelt wird angezeigt. Blut von infizierten Mäusen gesammelt, in zwei Röhrchen aufgeteilt. Ein Rohr wird behandelt, als erwünscht ist, während die andere Probe unbehandelt gelassen (A). Die Röhrchen werden erneut mit einem mit NHS-Biotin markiert ist und die andere mit NHS-Atto 633 (B) aufgeteilt. Proben werden dann in zwei Kombinationen kombiniert; Biotin markiert behandelten Erythrozyten mit Atto 633 etikettiert unbehandelte Erythrozyten und Atto 633 beschriftet behandelten Erythrozyten mit BioZinn markierten unbehandeltem RBCs (C). 15% Parasitämie (D) - Diese beiden Kombinationen sind während Schizogonie bei 2 getrennt in zwei Lose von infizierten Mäusen injiziert. Insgesamt 6 Empfängermäusen wird empfohlen um eine statistische Signifikanz im Ergebnis zu erhalten, obwohl mehr oder weniger, falls erforderlich, verwendet werden. Von Lelliott et al. 14 angepasst, die ursprünglich von BioMed Central veröffentlicht.

Abbildung 2
Abbildung 2: Messung der Parasitämie mittels Durchflusszytometrie. Debris, Lärm und Thrombozyten werden von der Analyse entfernt basierend auf FSC / SSC Eigenschaften (A). Einzelzellen werden dann von den verbleibenden Zellen auf der Basis der beiden Trigger-Impulsbreite (B) oder FSC Peak-Flächenverhältnis (C) ausgewählt. Zelltypen können dann voneinander unterschieden basieren auf positive Färbung mit CD45 APC eFluor780 (Leukozyten), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC Progenitoren) oder Negativfärbung (reife Erythrozyten) (D). Nach der Auswahl reifen Erythrozyten, sind Zellen, die entweder: Hoechst und JC-1-positiven (parasitierten Erythrozyten), Hoechst positiven und JC-1 negativen (roten Blutkörperchen enthält Howell Jolly-Körperchen), JC-1-positiven und negativen Hoechst (unbekannte Zellen) oder mit zwei negativen (nicht infizierten Erythrozyten). Nicht infizierte und P. chabaudi infizierten Proben mit Hoechst 33342 (E, F) oder Hoechst 34580 (G, H) angefärbt, werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Bewertung der Merozoiten Invasion in zwei gekennzeichnete RBC Populationen in vivo. Grundstücke sind von reifen Erythrozyten, gatedwie in Fig. 2 Die beiden markierten RBC Populationen auf der Basis ihrer Bezeichnung (A) ausgewählt werden. Atto 633 markierte Zellen fluoreszieren in dem 670/30-Kanal (L1), Biotin-markierten Zellen binden an Streptavidin und fluoreszieren im PE-Cy7 Kanal (L3) und unmarkierten Zellen sind negativ für diese Flecken (L4). In jeden dieser Populationen parasitierten Erythrozyten können auf Basis von Hoechst und JC-1 positive Färbung (Q2) (BD) identifiziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

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Wir haben ein Verfahren für die gleichzeitige Messung von Parasitämie und Merozoiten Invasion in vivo Proben beschrieben. In Bezug auf die Parasitämie Messung bietet dieses Verfahren einen Vorteil gegenüber bisherigen Methoden 10-13 in diesem HJ-Erythrozyten aus PRBCs unterschieden werden, wodurch die Anzahl der falsch-positive Ereignisse zu reduzieren. Während HJ-RBCs sind gewöhnlich beim Menschen selten einige Studien berichten hohen Niveaus in Mäusen 15,16 die Unterscheidung zwischen diesen Zellen und prbcS wichtig für die genaue Messung von Nagetier Parasitämie. Mit dieser Methode die Nachweisgrenze für Parasitämie ist ungefähr 0,007% 14, obwohl es möglich ist, dies so günstig wie 0,0005% unter den richtigen Bedingungen zu reduzieren. Bemerkenswert ist, wird diese Begrenzung durch die Sauberkeit des Durchflusszytometer verwendet und die Fähigkeit, eine große Anzahl von Ereignissen in einer vernünftigen Zeit zu erhalten diktiert. Das häufigste Problem bei der Anwendung dieser Technik verbunden ist, ist unzureichend Färbung with JC-1. Die Fluoreszenz von JC-1 ist abhängig von der mitochondrialen Membranpotentials des Parasiten und Parasiten müssen gesund, um eine optimale Färbung erhalten. Eine längere Lagerung von Parasiten oder Fixierung sollte daher vor der Färbung zu vermeiden.

Es sollte auch darauf ausgeübt werden, wenn die Analyse Parasiten, die Gegenstand eines Arzneimittels Eingriffe werden, wie dies auch Auswirkungen auf das Ausmaß der Färbung mit JC-1. In diesen Fällen kann es hilfreich sein, die Parasitämie auf Basis Hoechst Fluoreszenz alleine, zu analysieren, verglichen mit Parasitämie mit der Zugabe des JC-1-Farbstoff. Tatsächlich kann diese ein Maß für Parasitenzahl sowie einen allgemeinen Hinweis der Parasit Gesundheit. Schließlich ist der JC-1 Farbstoff seine Fluoreszenz von einem Peak bei 529 nm und einem Maximum bei 590 nm von J-Aggregate bilden verschieben. Die Bildung dieser Aggregate abhängig von der Farbstoffkonzentration, die wiederum abhängig von der mitochondrialen Membranpotential der Zelle. Der Verlust des mitochondrialen Membran potential bewirkt eine Verschiebung in der Fluoreszenz gegenüber 529 nm, die unter Umständen auf Zellen apoptotisch sind. Nach unserer Erfahrung PRBCs mit JC-1 gefärbt immer zeigte eine ähnliche Fluoreszenzmuster, die von etwa gleicher Intensität in beiden 530/40 nm-Kanal und der Kanal 585/42 nm war. In einigen Studien wie jene, die Arzneimittel Eingriffen kann es lohnend sein, Änderungen in der Fluoreszenzverhältnisses zwischen 530/40 nm-Kanal und der 585/42 nm-Kanal für irgendwelche Anzeichen für den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zu überwachen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass JC-1 ist besonders anfällig für einen Abbau und sollte frisch aus einem gefrorenen Aliquot wie beschrieben vorbereitet werden, während Gefrier / Auftau-Zyklen zu vermeiden. Nach dem Färben wird JC-1-Fluoreszenz mit wenig oder keiner Reduktion der Fluoreszenz, zumindest über mehrere Stunden relativ konstant.

Für die in vivo-Invasionstest, sind die zwei wichtigsten Faktoren der Konsistenz bei der RBC Kennzeichnung process und der Zeitpunkt der Injektion des markierten Blut. RBC Kennzeichnungen, sollte die minimale Menge an Farbstoff verwendet werden, um eine Beeinträchtigung der Fähigkeit des Parasiten, die RBC, die als eine Möglichkeit bei der Verwendung von Oberflächen Etiketten 7 angehoben wurde einzudringen verhindern. Unter den hier beschriebenen Bedingungen Kennzeichnung Invasion nicht gehemmt wird 14, jedoch sollte besonderes Augenmerk auf die Aufrechterhaltung konsistenter Label Konzentrationen gegeben werden, und Farbstoffe sollten eingeschaltet werden, um etwaige Ungenauigkeiten durch Invasion Hemmung durch die RBC-Label zu verhindern. Als Parasiten laufen eine synchronisierte Invasion Zyklus, ist es wichtig, dass markierten Zellen werden zum richtigen Zeitpunkt in der Parasiten-Lebenszyklus injiziert. Diese sollten, um die Anzahl der Fälle: und damit die Genauigkeit des Assays zu maximieren, erfolgen. Nach unserer Erfahrung kommt der Höhepunkt der Invasion in etwa der Hälfte der Dunkel-Zyklus, so dass für diesen Test ein Reverse-Lichtzyklus Raum vorteilhaft.

Die tWO Etikett Invasionstest bietet ein genaues Verfahren zur Invasion der Merozoiten Effizienz in verschiedene Arten von RBC in vivo zu bestimmen. Dieser Ansatz bietet daher einen Vergleich zwischen behandelte RBCs, dh trypsinisiert, und die Kontrollzellen. Alternativ könnte Erythrozyten aus genetisch veränderten Mäusen mit denen von Kontrollmäusen oder Erythrozyten von verschiedenen physiologischen Parametern oder unterschiedlichen Alters verglichen werden konnten verglichen werden. Während ein ähnlicher Test wurde für die Messung der Invasion in vitro 9 beschrieben worden ist, hier stellt der Assay das Potenzial, für Effekte nur in vivo vorhanden sind, einschließlich der Wirkung des Immunsystems, die Parasiteninvasion Mechanismen 17-19 möglicherweise ändern kann entfallen. Schließlich weist dieser Assay auch das Potenzial, Einblicke in Krankheiten bereitzustellen, wie die Immun Clearance prbcS und Parasitenwachstum, wenn die prbcS innerhalb der markierten Populationen über einen längeren Zeitraum überwacht.

Über Einell, ein detailliertes Protokoll für die genaue Messung der Parasitämie in in vivo Proben wird beschrieben, was ein Vorteil gegenüber früheren Assays in diesem HJ-RBCs aus prbcS unterscheiden. Weiterhin kann ein Assay für die Quantifizierung der Invasion Effizienz in verschiedene RBC Typen in vivo beschrieben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir erkennen die Finanzierung der Unterstützung des National Health und Medical Research Council (gewähren APP605524, 490.037 und 1.047.082), der Australian Research Council (gewähren DP12010061), der National Collaborative Research Infrastructure Strategy of Australia und der Bildung Investmentfonds von der Abteilung Innovation, Industrie , Wissenschaft und Forschung. PML ist ein Empfänger einer australischen Postgraduate Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

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References

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Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

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