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Immunology and Infection

फ्लो द्वारा कृंतक प्लाज्मोडियम पेरासाइटिमिया के vivo आकलन और Merozoite आक्रमण में

Published: April 5, 2015 doi: 10.3791/52736
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

लाल रक्त कोशिकाओं के भीतर मलेरिया परजीवी आक्रमण और प्रतिकृति। merozoite आक्रमण और पेरासाइटिमिया का सही आकलन मलेरिया संक्रमण के पाठ्यक्रम का आकलन करने में इसलिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम मलेरिया की एक माउस मॉडल में इन मानकों की माप के लिए आधारित प्रोटोकॉल cytometry के एक प्रवाह का वर्णन है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं मैक्वेरी विश्वविद्यालय की नीतियों के अनुसार आयोजित की और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई कोड के लिए पुष्टि कर रहे थे। काम नहीं ए आर ए 2012/017 मंजूरी दे दी है और मैक्वेरी विश्वविद्यालय में पशु आचार समिति से प्राप्त समझौते नीतिशास्त्र के तहत किया गया था। जब तक अन्यथा कहा सभी प्रयोगों SJL / जम्मू चूहों पर प्रदर्शन किया गया।

1. चूहे और प्रायोगिक मलेरिया संक्रमण

  1. एक 12:12 घंटा प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ नियंत्रित तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) के तहत सदन चूहों।
  2. Cryopreserved पी के एक विभाज्य पिघलना 5% parasitized लाल रक्त कोशिकाओं (pRBCs) और C57BL 6 / दाता माउस की intraperitoneal गुहा में 200 μl इंजेक्षन साथ chabaudi Adami डी एस।
  3. इस प्रोटोकॉल के 4 - धारा 3 में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग 2 दिन - हर 1 दाता माउस पेरासाइटिमिया मॉनिटर। दाताओं 5 पहुँचता है - 15% पेरासाइटिमिया रूप में इस प्रकार, हृदय पंचर द्वारा रक्त एकत्र:
    1. महाप्राण हेपरिन समाधान (माउस घंटी समाधान में 300 यू / एमएल हेपरिन (एमटीआर) (154 मिमी NaCl, 5.6 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 2.2 मिमी 2 CaCl, 20 मिमी HEPES के 100 μl, 10 मिमी ग्लूकोज, 30 यू / मिलीलीटर हेपरिन, पीएच 7.4, 0.22 माइक्रोन फिल्टर एक 26 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में)) निष्फल।
    2. पेडल वापसी प्रतिक्रिया और corneal सजगता के अभाव से संज्ञाहरण की वांछित गहराई की पुष्टि, 5% isofluorane साथ साँस लेना द्वारा माउस anesthetize।
    3. पसलियों के माध्यम से, बस कोहनी से नीचे अपने पक्ष पर माउस और लंबरूप डालने सुई प्लेस, और दिल में। धीरे धीरे सिरिंज सवार बाहर खींचने के लिए और 0.5 जब तक सुई बारी बारी से - रक्त के 1 मिलीलीटर प्राप्त की है।
    4. संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मानवीय इच्छामृत्यु प्रदर्शन करते हैं।
  4. बलिदान किया जब दाता 10% पेरासाइटिमिया पर था, तो रक्त 9 एक्स 10 5 में शामिल होंगे यानी 9 एक्स 10 6 आरबीसी / μl (के रक्त गणना मानते हुए दाता रक्त की मात्रा प्रति pRBCs की गणनाpRBC / μl)। क्रेब्स में parasitized खून पतला (25 मिमी 3 NaHCO, 1.2 मिमी नाह 2 पीओ 4, 1.2 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 0.2% ग्लूकोज, पीएच 7.2, निष्फल 0.22 माइक्रोन फिल्टर 126 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl) खारा बफर एकाग्रता 200 μl प्रति एक 10 x 4 pRBCs है और आरबीसी लेबलिंग और आधान प्रयोग के लिए आवश्यक चूहों की intraperitoneal गुहा में 200 μl इंजेक्षन सकें।
  5. इस प्रोटोकॉल के 4 - धारा 3 में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry का उपयोग 2 दिन - हर 1 पेरासाइटिमिया मॉनिटर।

लाल रक्त कोशिकाओं और रक्ताधान के 2. लेबल

  1. 1.3 चरण में वर्णित के रूप में कार्डियक पंचर द्वारा चूहों से heparinized रक्त एकत्र, और बर्फ पर जगह है। सभी समय पर 4 डिग्री सेल्सियस पर खून रखें। माउस के अनुसार लगभग 200 μl रक्त एकत्र इंजेक्शन जा। यदि आवश्यक हो, दो नमूनों में रक्त विभाजित है और वांछित के रूप में एक नमूना इलाज करते हैं।
    नोट: इलाज किया samp के इस रास्ते में, आक्रमणLe एक नियंत्रण की तुलना में किया जा सकता है, इलाज नमूना (योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें)।
  2. प्रत्येक फ्लोरोसेंट आरबीसी लेबल की एक 2x समाधान तैयार है।
    1. एकाग्रता 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इतना है कि एमटीआर में हैं ATTO 633-एन-Hydroxysuccinimide (हैं ATTO 633 एनएचएस) के एक दो मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान पतला।
    2. एकाग्रता 250 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इतना है कि एमटीआर में बायोटिन-एन-Hydroxysuccinimide (बायोटिन एनएचएस) की एक 25 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान पतला।
  3. दो नलियों में रक्त के नमूनों को विभाजित है और एक ट्यूब, और अन्य ट्यूब 2x बायोटिन एनएचएस के एक बराबर मात्रा को 2x हैं ATTO 633 एनएचएस समाधान के एक बराबर मात्रा में जोड़ें। तुरंत मिलाएं। लगातार धीमी मिश्रण के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर खून सेते हैं, या वैकल्पिक रूप से, हर 10 नमूना मिश्रण - 15 मिनट।
  4. इस प्रकार के रूप MTRC (एमटीआर + 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), निष्फल 0.22 माइक्रोन फिल्टर) के साथ रक्त में लेबल तीन बार धोएं:
    1. , 5 मिनट के लिए 750 XG पर MTRC के कम से कम दो संस्करणों, अपकेंद्रित्र जोड़ें सतह पर तैरनेवाला हटाने, और resuspenMTRC के कम से कम दो संस्करणों में गोली घ। दो से अधिक बार दोहराएँ।
    2. 5 मिनट के लिए 750 XG पर अंतिम धोने, सेंट्रीफ्यूज के बाद विभिन्न संयोजनों में pelleted रक्त गठबंधन (यानी, अनुपचारित हैं ATTO 633 / इलाज किया बायोटिन, इलाज बायोटिन / हैं ATTO 633 का इलाज)। इंजेक्शन जा माउस प्रति 200 μl की एक मात्रा अप करने के लिए बनाने के लिए एमटीआर जोड़ें।
  5. इस प्रकार के रूप intravascularly कृंतक मलेरिया संक्रमित चूहों या असंक्रमित नियंत्रण में लेबल वाले रक्त इंजेक्षन:
    1. परजीवी schizogony के चरम पर 15% पेरासाइटिमिया - 2 पर आधान प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: इस अंधेरे चक्र के माध्यम से लगभग आधे रास्ते से होता है (यानी, 12 के बीच - एक रिवर्स प्रकाश चक्र पर 14:00 - एक सामान्य प्रकाश चक्र पर 02:00, या 12)।
    2. 5-10 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक का उपयोग कर गर्म चूहों रक्त का प्रवाह बढ़ाने के लिए, लेकिन चूहों ज़रूरत से ज़्यादा गरम नहीं सावधानी बरतने के लिए। एक निरोधक डिवाइस में चूहों प्लेस और intravascularly 200 μl में लेबल रक्त इंजेक्षन (लगभग 1 - 2 एक्स 10 9 आरबीपूंछ नस के माध्यम से सीएस)।
  6. धारा 3 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर रक्त के नमूने ले लीजिए।
    नोट: आक्रमण दरों प्राप्तकर्ता माउस के पेरासाइटिमिया पर निर्भर करता है, इंजेक्शन के बाद कम से कम 10 मिनट मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

फ्लो के लिए रक्त के नमूने और तैयारी की 3. संग्रह

  1. के रूप में निम्नानुसार प्रयोग के दिन पर, धुंधला नमूना प्रति समाधान, प्लस अतिरिक्त 50 μl तैयार करें:
    1. डाइमिथाइल sulfoxide में -20 डिग्री सेल्सियस (DMSO) पर संग्रहीत 6 मिमी जे.सी.-1 के एक विभाज्य Defrost।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 50 नमूना प्रति MTRC की μl, प्लस अतिरिक्त,।
    3. अंतिम एकाग्रता 12 माइक्रोन इतना है कि लगातार पूर्व गर्म MTRC vortexing whilst, जे.सी.-एक जोड़ें। इस जे.सी.-एक समुच्चय के गठन को कम करने के लिए किया जाता है; समुच्चय फार्म करते हैं, तो यह धुंधला नहीं कर पाएगा रूप में नहीं अपकेंद्रित्र ट्यूब करते हैं।
      नोट: एकत्रीकरण की एक छोटी राशि के परिणाम को प्रभावित नहीं करेगा।
    4. विरोधी जोड़ेंCD45 एपीसी eFluor 780 और विरोधी CD71 PerCP eFluor 710 अंतिम एकाग्रता एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / इतना है कि। लेबल वाले आरबीसी प्रयोग का प्रदर्शन यदि अंतिम एकाग्रता एक माइक्रोग्राम प्रति / एमएल है, इसलिए है कि streptavidin पीई Cy7 जोड़ें।
  2. पूंछ के भीतर रक्त वाहिनियों की पूंछ या पंगु बनाना की नोक के विच्छेदन द्वारा पूंछ से खून बह रहा प्रदर्शन करते हैं। एक छोटे से तौलना नाव या गिलास स्लाइड पर पूंछ रक्त की एक बूंद रखें। रक्त संग्रह करने के बाद रक्तस्राव बंद कर दिया गया है कि सुनिश्चित करते हैं। धुंधला समाधान के 50 μl में पूंछ रक्त की पिपेट 3 μl 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  3. (एक 355 एनएम लेजर अगर) का उपयोग आसुत जल में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 4 मिमी Hoechst 33342 या (एक 405 एनएम लेजर अगर) का उपयोग आसुत जल में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 2 मिमी Hoechst 34,580 के एक विभाज्य Defrost। क्रमश: MTRC में हेक्स्ट के चार माइक्रोन या 2 माइक्रोन समाधान की, नमूना प्रति 500 ​​μl तैयार करें, प्लस अतिरिक्त।
  4. चार माइक्रोन हेक्स्ट के 500 μl जोड़ें33342 या नमूने के दो माइक्रोन Hoechst के 34,580 और 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 750 XG, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 700 μl MTRC जोड़ने और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण।

4. फ्लो

  1. एक 355/488/633 एनएम लेजर या 405/488/633 एनएम लेजर उपकरण का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें।
  2. विश्लेषण से ठीक पहले एक 35 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर नमूने हैं। नमूने और फिर से उपयोग के बीच आसुत जल के साथ सेल झरनी कुल्ला।
  3. (- नमूना प्रति करोड़ की कुल घटनाओं में आम तौर पर दस लाख) सबसे छोटी आबादी कम से कम 500 घटनाओं में शामिल है कि इतनी पर्याप्त घटनाओं रिकॉर्ड।
  4. एक 355 एनएम लेजर का उपयोग Hoechst 33342 उत्तेजित और एक 460/50 फिल्टर के माध्यम से घटनाओं का पता लगाने। एक 405 एनएम लेजर का उपयोग Hoechst 34,580 उत्तेजित और एक 460/50 फिल्टर के माध्यम से घटनाओं का पता लगाने। उत्तेजित जे.सी.-1, विरोधी CD71 PerCP eFluor 710 और Streptavidin पीई Cy7 एक 488 एनएम लेजर का उपयोग कर और एक 530/40 के माध्यम से घटनाओं का पता लगाने, 692/40, और 750LP संबंधित को फ़िल्टरly है। एक 633 एनएम लेजर का उपयोग हैं ATTO 633 और विरोधी CD45 एपीसी eFluor 780 उत्तेजित और क्रमश: एक 670/30 या 750LP फिल्टर के माध्यम से घटनाओं का पता लगाने।
  5. इस प्रकार के रूप विश्लेषण सॉफ्टवेयर cytometry के उचित प्रवाह का उपयोग कर विश्लेषण और मुआवजा प्रदर्शन:
    1. पूरे कोशिकाओं का चयन करें और FSC / एसएससी गुण (2A चित्रा) के आधार पर शोर, मलबे, और प्लेटलेट्स बाहर। या तो ट्रिगर पल्स चौड़ाई (चित्रा 2B) पर या ऊंचाई अनुपात (चित्रा -2) के लिए FSC के शिखर क्षेत्र का उपयोग करके आधारित एकल कक्षों का चयन करें।
    2. परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं का चयन करें, और PerCP eFluor 710 और एपीसी eFluor 780 चैनल (चित्रा 2 डी) में नकारात्मक प्रतिदीप्ति पर आधारित आरबीसी progenitors और ल्यूकोसाइट्स, बाहर।
    3. लेबल वाले आरबीसी प्रयोग का प्रदर्शन करते हैं, तो पीई Cy7 और ATTO 633 प्रतिदीप्ति पर आधारित लेबल वाली लाल रक्त कोशिकाओं में से प्रत्येक की आबादी का चयन करें और इन अलग-अलग (चित्रा 3 ए) का विश्लेषण।
    4. (दोनों जे.सी.-1 और Hoechst के लिए सकारात्मक प्रतिदीप्ति पर आधारित pRBCs का चयन करें

5. गणना और सांख्यिकी

  1. लाल रक्त कोशिकाओं की कुल संख्या से pRBCs की संख्या से विभाजित करके पेरासाइटिमिया की गणना (यानी, गेट जी -4 में घटनाओं की संख्या से विभाजित गेट Q2 में घटनाओं की संख्या)। दो लेबल वाली आबादी के आक्रमण परख पेरासाइटिमिया का आयोजन करते हैं (जो कि जनसंख्या में लेबल लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या द्वारा लेबल pRBCs की संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकती है, यानी फाटकों एल 1 और Q2 दोनों में जो कर रहे हैं घटनाओं की संख्या, घटनाओं की संख्या से विभाजित गेट एल 1 में)।
    नोट: लेबल पेरासाइटिमिया काफी ऐसे अंतर्जात पेरासाइटिमिया और परिसंचारी खंडजाणु की संख्या जैसे कारकों पर निर्भर करता है। इस कारण से, यह प्रत्येक व्यक्ति के माउस में नियंत्रण में लेबल आबादी के पेरासाइटिमिया द्वारा विभाजित इलाज किया लेबल वाली आबादी की पेरासाइटिमिया के रूप में गणना की है, जो पेरासाइटिमिया अनुपात, रिपोर्ट करने के लिए उपयोगी है। संभव डाई प्रभाव के लिए ठीक करने के लिए रिपोर्ट परिणामदो डाई संयोजन भर में एक औसत पेरासाइटिमिया अनुपात है।
  2. काल्पनिक मतलब के रूप में एक साथ एक नमूना टी -test का उपयोग कर अनुपात का सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित।

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Representative Results

पेरासाइटिमिया के मापन।

पेरासाइटिमिया की माप के लिए, रक्त कोशिकाओं पहले चयनित किया जाना चाहिए, और शोर, मलबे और प्लेटलेट्स FSC / एसएससी गुण (2A चित्रा) पर आधारित है, बाहर रखा गया है। इस्तेमाल किया कोशिकामापी पर निर्भर करता है, एकल कक्षों तो क्षेत्र अनुपात (चित्रा -2) के लिए या तो ट्रिगर पल्स चौड़ाई (चित्रा 2B), या FSC के शिखर ऊंचाई के आधार पर चयन किया जाना चाहिए। घटनाओं ल्यूकोसाइट्स से मिलकर चाहिए शेष, एपीसी eFluor 780 के लिए सकारात्मक दाग, PerCP eFluor 710, और ये दाग (चित्रा 2 डी) दोनों के लिए नकारात्मक परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं, के लिए सकारात्मक दाग (reticulocytes सहित) आरबीसी पूर्वज,। जे.सी.-एक प्रतिदीप्ति Hoechst 33342 (चित्रा 2 ई, एफ) या Hoechst 34,580 (चित्रा 2 जी, एच) प्रतिदीप्ति के खिलाफ साजिश रची है जब परिपक्व आरबीसी आबादी चयन करने के बाद, घटनाओं चार आबादी में अलग होना चाहिए। दोहरी सकारात्मक जनसंख्या, parasitized लाल रक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है आर जबकिemaining आबादी या तो असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं (दोहरी नकारात्मक) कर रहे हैं, HJ-लाल रक्त कोशिकाओं (हेक्स्ट सकारात्मक, नकारात्मक जे.सी.-1), या अज्ञात कोशिकाओं (जे.सी.-एक सकारात्मक, हेक्स्ट नकारात्मक)। विशेष रूप से, जे.सी.-एक प्रतिदीप्ति सेल की mitochondrial झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है, 590 एनएम पर एक व्यापक उत्सर्जन बढ़ता जा करने के लिए 529 एनएम पर एक अधिकतम से बदलाव हो सकता है। भले ही इस बदलाव के जे.सी.-एक विश्लेषण के लिए इस चैनल को सबसे अधिक उपयुक्त बनाने, 530/40 एनएम चैनल में जोरदार प्रतिदीप्ति जाएगा। हालांकि, कुछ मामलों में यह कोशिकाओं के mitochondrial झिल्ली क्षमता का एक संकेत प्रदान कर सकता है जो 585/42 एनएम चैनल में अतिरिक्त रिकार्ड प्रतिदीप्ति करने के लिए सार्थक हो सकता है। असंक्रमित नमूनों में घटनाओं के लिए कम से कम 0,007% दोहरी सकारात्मक (चित्रा 2 ई, जी) होना चाहिए। इस परिणाम का प्रवाह की सफाई पर निर्भर करेगा और काफी, विश्लेषण करने से पहले व्यापक सफाई परिणामों में सुधार कर सकते हैं भिन्न हो सकते हैं। एसीसी के लिए जे.सी.-एक डाई के अलावा महत्वपूर्ण है, जिससे परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं के 0.9% - HJ-लाल रक्त कोशिकाओं 0.3 के लिए खातेकम पेरासाइटिमिया की यूरेट माप।

Merozoite आक्रमण का आकलन।

संक्रमित चूहों में से लेबल लाल रक्त कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के बाद दो से लेबल आबादी में रिश्तेदार आक्रमण दरों निर्धारित किया जा सकता है। रक्त के नमूने ले लिया है और Streptavidin पीई Cy7 के अलावा के साथ पेरासाइटिमिया माप के लिए वर्णित के रूप में तैयार किया जाना चाहिए। नमूना लिया जाता है, जिस पर समय प्रयोगात्मक शर्तों और विश्लेषण के वांछित परिणाम पर निर्भर करता है। यह शुद्धता को बढ़ाने के लिए कई बार अंक लेने के लिए फायदेमंद हो सकता है, हालांकि आम तौर पर, एक पहले के समय बिंदु सबसे अच्छा, एक आक्रमण फेनोटाइप को प्रतिबिंबित करेगा। डेटा प्रवाह cytometry के विश्लेषण के लिए, परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं चित्रा 2 के रूप में चयनित किया जाना चाहिए। इन कोशिकाओं से, ATTO 633 और बायोटिन लेबल वाली लाल रक्त कोशिकाओं को क्रमश: 670/30 और 750LP चैनलों में प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 ए) के आधार पर पहचाना जा सकता है। (हैं ATTO 633, बायोटिन, और लेबल हटाया गया) यहाँ तीन आरबीसी आबादी सेअलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए। इन आबादियों पेरासाइटिमिया के प्रत्येक हेक्स्ट और जे.सी.-1 (चित्रा 3 बी-डी) के साथ धुंधला के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है।

चित्र 1
इन विवो परजीवी आक्रमण परख की चित्रा 1. योजनाबद्ध। इस परख उपयोगकर्ता की जैविक प्रश्न के अनुसार व्यवहार लाल रक्त कोशिकाओं में रिश्तेदार आक्रमण दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक उदाहरण दिखाया गया है। असंक्रमित चूहों से एकत्र रक्त दो नलियों में बांटा गया है। एक ट्यूब अन्य नमूना अनुपचारित (ए) को छोड़ दिया जाता है, जबकि वांछित के रूप में व्यवहार किया जाता है। ट्यूब फिर एनएचएस बायोटिन के साथ लेबल एक और एनएचएस हैं ATTO 633 (बी) के साथ दूसरे के साथ बांटा जाता है। नमूने तो दो संयोजन में संयुक्त रहे हैं; बायोटिन हैं ATTO के साथ 633 से लेबल अनुपचारित लाल रक्त कोशिकाओं में इलाज लाल रक्त कोशिकाओं में लेबल और ATTO 633 जैव के साथ लाल रक्त कोशिकाओं का इलाज किया लेबलटिन में लेबल अनुपचारित लाल रक्त कोशिकाओं (सी)। 15% पेरासाइटिमिया (डी) - ये दो संयोजनों 2 पर schizogony दौरान संक्रमित चूहों के दो लाट में अलग से इंजेक्ट कर रहे हैं। 6 प्राप्तकर्ता चूहों की कुल अगर जरूरत कम या ज्यादा इस्तेमाल किया जा सकता है, परिणाम में सांख्यिकीय महत्व हासिल करने के लिए सिफारिश की है। Lelliott एट अल। 14 से अनुकूलित, मूल रूप से BioMed सेंट्रल से प्रकाशित किया।

चित्र 2
चित्रा प्रवाह से पेरासाइटिमिया 2. मापन cytometry। मलबा, शोर, और प्लेटलेट्स FSC / एसएससी गुण (ए) के आधार पर विश्लेषण से हटा रहे हैं। एकल कोशिकाओं तो क्षेत्र अनुपात (सी) के लिए या तो ट्रिगर पल्स चौड़ाई (बी), या FSC के शिखर पर आधारित शेष कोशिकाओं से चुने गए हैं। सेल प्रकार तो CD45 एपीसी eFluor के साथ सकारात्मक धुंधला के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता780 (ल्यूकोसाइट्स), CD71 PerCP eFluor 710 (आरबीसी पूर्वज), या नकारात्मक धुंधला (लाल रक्त कोशिकाओं को परिपक्व) (डी)। हेक्स्ट और जे.सी.-एक सकारात्मक (parasitized लाल रक्त कोशिकाओं), Hoechst के सकारात्मक और जे.सी.-एक नकारात्मक (हॉवेल जॉली निकायों युक्त लाल रक्त कोशिकाओं), जे.सी.-एक सकारात्मक और Hoechst नकारात्मक (अज्ञात कोशिकाओं), या दोहरी नकारात्मक: परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं का चयन करने के बाद, कोशिकाओं या तो कर रहे हैं (असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं)। असंक्रमित और पी Hoechst 33342 (ई, एफ), या Hoechst 34,580 (जी, एच) के साथ दाग संक्रमित नमूने chabaudi, दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Vivo में दो से लेबल आरबीसी आबादी में merozoite आक्रमण 3. आकलन चित्रा। भूखंड, परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं की gated हैंचित्रा के रूप में दो। दो से लेबल आरबीसी आबादी उनके लेबल (ए) के आधार पर चुना जा सकता है। ATTO 633 लेबल कोशिकाओं 670/30 चैनल (एल 1) में प्रतिदीप्ति, बायोटिन लेबल कोशिकाओं streptavidin करने के लिए बाध्य है और पीई Cy7 चैनल (एल 3) में प्रतिदीप्ति, और unlabeled कोशिकाओं इन दाग (L4) के लिए नकारात्मक हैं। Parasitized लाल रक्त कोशिकाओं हेक्स्ट और जे.सी.-एक सकारात्मक धुंधला (Q2) (बी) के आधार पर पहचाना जा सकता है इन आबादियों में से प्रत्येक में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम इन विवो नमूने के दोनों पेरासाइटिमिया और merozoite आक्रमण की माप के लिए एक विधि का वर्णन किया है। पेरासाइटिमिया माप के संदर्भ में, इस विधि जिससे झूठी सकारात्मक घटनाओं की संख्या को कम करने, pRBCs से प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि HJ-लाल रक्त कोशिकाओं में पिछले विधियों 10-13 पर एक लाभ प्रदान करता है। HJ-लाल रक्त कोशिकाओं से मानव में आम तौर पर दुर्लभ हैं, वहीं कुछ अध्ययनों कृंतक पेरासाइटिमिया का सही माप के लिए महत्वपूर्ण इन कोशिकाओं और pRBCs के बीच भेद कर रही चूहों 15,16 में उच्च स्तर की रिपोर्ट। यह सही परिस्थितियों में इस रूप में कम 0.0005% के रूप में कम करने के लिए संभव है, हालांकि इस विधि पेरासाइटिमिया के लिए पता लगाने की सीमा का उपयोग करना, लगभग 0.007% 14 है। विशेष रूप से, इस सीमा का इस्तेमाल किया प्रवाह और समय का एक उचित मात्रा में घटनाओं की बड़ी संख्या को प्राप्त करने की क्षमता की सफाई से निर्धारित होता है। इस तकनीक के इस्तेमाल से जुड़े सबसे आम समस्या अपर्याप्त धुंधला बुद्धि हैएच जे सी-1। जे.सी.-1 के प्रतिदीप्ति परजीवी की mitochondrial झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है, और परजीवी इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के लिए स्वस्थ होना चाहिए। परजीवी या निर्धारण का लंबे समय तक भंडारण इसलिए धुंधला पहले से बचा जाना चाहिए।

दवा हस्तक्षेपों के अधीन कर दिया गया है जो परजीवी का विश्लेषण करते हैं तो यह भी जे.सी.-1 के साथ धुंधला की हद तक प्रभावित कर सकता है के रूप में की देखभाल भी, प्रयोग किया जाना चाहिए। इन मामलों में यह जे.सी.-एक डाई के अलावा के साथ पेरासाइटिमिया की तुलना में, अकेले हेक्स्ट प्रतिदीप्ति पर आधारित पेरासाइटिमिया का विश्लेषण करने के लिए सहायक हो सकता है। दरअसल, इस परजीवी गिनती का एक उपाय है, साथ ही परजीवी स्वास्थ्य की एक समग्र संकेत प्रदान कर सकता है। अंत में, जे.सी.-एक डाई जम्मू-समुच्चय के गठन से 590 एनएम पर एक चोटी के 529 एनएम पर एक चोटी से अपने प्रतिदीप्ति बदलाव कर सकते हैं। इन समुच्चय के गठन के बदले में सेल की mitochondrial झिल्ली क्षमता पर निर्भर करता है जो डाई एकाग्रता, पर निर्भर करता है। mitochondrial झिल्ली potenti का नुकसानअल कोशिकाओं apoptotic हैं संकेत हो सकता है, जो 529 एनएम की ओर प्रतिदीप्ति में बदलाव का कारण बनता है। जे.सी.-1 के साथ दाग हमारे अनुभव pRBCs में हमेशा 530/40 एनएम चैनल और 585/42 एनएम चैनल दोनों में लगभग बराबर तीव्रता का था जो एक समान प्रतिदीप्ति पैटर्न का प्रदर्शन किया। हालांकि, कुछ अध्ययनों में, इस तरह की दवा हस्तक्षेपों को रोजगार के रूप में उन है, यह 530/40 एनएम चैनल और mitochondrial झिल्ली क्षमता के नुकसान के किसी भी संकेत के लिए 585/42 एनएम चैनल के बीच प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए सार्थक हो सकता है। यह जे.सी.-एक क्षरण करने के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील है और फ्रीज / पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए, जबकि हौसले से, के रूप में वर्णित एक जमे हुए विभाज्य से तैयार किया जाना चाहिए कि नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। धुंधला करने के बाद, जे.सी.-एक प्रतिदीप्ति कम से कम कई घंटे से अधिक प्रतिदीप्ति में कम या कोई कमी है, साथ अपेक्षाकृत स्थिर है।

इन विवो आक्रमण परख के लिए, दो सबसे महत्वपूर्ण कारकों में आरबीसी लेबलिंग जनसंपर्क में स्थिरता रहे हैंocess और लेबल रक्त का इंजेक्शन का समय है। आरबीसी लेबलिंग के लिए, डाई की न्यूनतम राशि सतह लेबल 7 का उपयोग करते समय एक संभावना के रूप में उठाया गया है, जो आरबीसी, आक्रमण करने के लिए परजीवी की क्षमता के साथ किसी भी हस्तक्षेप को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यहाँ वर्णित लेबलिंग शर्तों के तहत आक्रमण हालांकि सावधान ध्यान लगातार लेबल सांद्रता को बनाए रखने के लिए दी जानी चाहिए, 14 हिचकते नहीं है, और रंजक आरबीसी लेबल द्वारा आक्रमण निषेध की वजह से किसी भी inaccuracies को रोकने के क्रम में, बंद किया जाना चाहिए। परजीवी एक तुल्यकालन आक्रमण चक्र से गुजरना रूप में, यह लेबल कोशिकाओं परजीवी के जीवन चक्र में सही समय पर इंजेक्ट कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। इस आक्रमण की घटनाओं की संख्या है, और इसलिए परख की सटीकता को अधिकतम करने के क्रम में किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में आक्रमण के शिखर इस परख के लिए एक रिवर्स प्रकाश चक्र कमरे लाभप्रद बनाने, अंधेरे चक्र के माध्यम से लगभग आधे रास्ते से होता है।

Tलेबल आक्रमण परख vivo में आरबीसी के विभिन्न प्रकारों में merozoite आक्रमण क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सटीक तरीका प्रदान करता है wo। यह दृष्टिकोण इसलिए इलाज किया यानी लाल रक्त कोशिकाओं, trypsinized, और नियंत्रण लाल रक्त कोशिकाओं के बीच तुलना की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से लाल रक्त कोशिकाओं की तुलना की जा सकती है नियंत्रण चूहों, या विभिन्न शारीरिक मापदंड या विभिन्न आयु की लाल रक्त कोशिकाओं के उन लोगों की तुलना में किया जा सकता है। इसी तरह की एक परख इन विट्रो 9 में आक्रमण की माप के लिए वर्णित किया गया है, वहीं परख यहां संभावित परजीवी आक्रमण तंत्र 17-19 बदल सकते हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली, के प्रभाव सहित विवो में ही मौजूद प्रभाव, के लिए खाते में क्षमता प्रदान करता है। लेबल वाली आबादी के भीतर pRBCs एक विस्तारित अवधि में निगरानी कर रहे हैं अंत में, यदि इस परख भी ऐसे प्रतिरक्षा pRBCs की निकासी, और परजीवी विकास के रूप में विकृतियों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है।

एक से अधिकडालूँगा, vivo नमूनों में पेरासाइटिमिया का सही माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि HJ-लाल रक्त कोशिकाओं में पिछले assays के ऊपर एक फायदा है, जो वर्णन किया गया है pRBCs से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसके अलावा, एक परख vivo में अलग आरबीसी प्रकार में आक्रमण दक्षता की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम (APP605524, 490,037 और 1,047,082 अनुदान) राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से समर्थन धन स्वीकार ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (DP12010061 अनुदान), अभिनव विभाग से ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय सहयोगात्मक अनुसंधान बुनियादी रणनीति और शिक्षा निवेश कोष, उद्योग , विज्ञान और अनुसंधान। पीएमएल एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

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References

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संक्रमण अंक 98 मलेरिया, प्रवाह cytometry पेरासाइटिमिया merozoite आक्रमण, जे.सी.-1
फ्लो द्वारा कृंतक <em>प्लाज्मोडियम</em> पेरासाइटिमिया <em>के</em> vivo आकलन और Merozoite आक्रमण <em>में</em>
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Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

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