Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Vivo оценки грызунов Plasmodium паразитемия и мерозоитам вторжения с помощью проточной цитометрии

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Паразита, вызывающего малярию вторгается и повторов в пределах красных кровяных клеток. Точная оценка мерозоитам вторжения и паразитемией Поэтому очень важно при оценке течение заболевания малярией. Здесь мы опишем проточной цитометрии протокол, основанный на измерении этих параметров в модели мыши малярии.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры были проведены в соответствии с политикой университета Маккуори и соответствует данным Национального научно-исследовательского совета по вопросам здравоохранения и медицинской (NHMRC) Австралийский кодекса практики. Работа выполнена в рамках этике соглашение № ARA 2012/017 не утвержденных и полученных от Комитета по Животное этики в Macquarie University. Все эксперименты были проведены на SJL / J мышей если не указано иное.

1. Мыши и экспериментальной малярии инфекции

  1. Домовых мышей при контролируемой температуре (21 ° C) с 12:12 ч свет-темнота цикла.
  2. Оттепель аликвоту криоконсервированного P. chabaudi Adami DS с 5% зараженных эритроцитов (pRBCs) и вводят 200 мкл в внутрибрюшинного полости C57BL / 6 мыши-донора,.
  3. Монитор мыши-донора, паразитемии каждые 1 - 2 дня с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе 3 - 4 настоящего Протокола. После того, как доноры достигает 5 - 15% паразитемии, собирать кровь путем сердечной пункции следующим образом:
    1. Аспирируйте 100 мкл раствора гепарина (300 Е / мл гепарина в растворе Рингера мыши (ССО) (154 мМ NaCl, 5,6 мМ КСl, 1 мМ MgCl 2, 2,2 мМ CaCl 2, 20 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 30 ед / мл гепарин, рН 7,4, 0,22 мкМ фильтр стерилизуют)) в 1 мл шприц с иглой 26 G.
    2. Обезболить мыши при вдыхании с 5% изофлуораном, подтверждающие требуемую глубину анестезии при отсутствии ответа педаль отмены и роговицы рефлексы.
    3. Поместите курсор на его стороне и перпендикулярно Вставьте иглу чуть ниже локтя, через ребра, и в сердце. Вытяните поршень шприца медленно и поверните иглу до 0,5 - 1 мл крови не получается.
    4. Выполните гуманного эвтаназии путем смещения шейных позвонков под наркозом.
  4. Рассчитать pRBCs на объем донорской крови, предполагая анализ крови на 9 х 10 6 РБК / мкл (то есть, если донор был на 10% паразитемии, когда в жертву, кровь будет содержать 9 х 10 5PRBC / мкл). Развести зараженных кровь в Кребс-солевой буферный раствор (126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 25 мМ NaHCO 3, 1,2 мМ NaH 2 PO 4, 1,2 мМ MgCl 2, 2,5 мМ CaCl 2, 0,2% глюкозы, рН 7,2, 0,22 мкМ фильтр стерилизуют) таким образом, что концентрация 1 × 10 4 pRBCs в 200 мкл и вводят 200 мкл в внутрибрюшинного полости мышей, необходимых для маркировки эритроцитов и переливание эксперимента.
  5. Монитор паразитемии каждые 1 - 2 дня с помощью проточной цитометрии, как описано в разделах 3 - 4 настоящего Протокола.

2. Маркировка эритроцитов и переливания

  1. Сбор гепаринизированной крови от мышей путем сердечной пункции, как описано в стадии 1,3, и помещают на лед. Хранить крови при 4 ° С в любое время. Соберите примерно 200 мкл крови на мышь для инъекций. При необходимости, разделить кровь в двух образцах и лечения один образец по своему усмотрению.
    Примечание: В этом случае, вторжение в обработанной SAMPле может быть по сравнению с контролем, лечить образец (рис 1 для схемы).
  2. Подготовьте 2x решение каждого флуоресцентной меткой РБК.
    1. Развести 2 мг / мл исходного раствора Atto 633-N-гидроксисукцинимида (633 Атто-NHS) в ССО таким образом, что концентрация 20 мкг / мл.
    2. Развести 25 мг / мл стоковый раствор биотин-N-гидроксисукцинимида (NHS-биотин) в ССО таким образом, что концентрация 250 мкг / мл.
  3. Разделение пробы крови на две пробирки и добавляют равный объем раствора 2x Atto 633-NHS с одной трубкой, и равного объема в 2 раза биотин-NHS к другой трубке. Немедленно перемешать. Инкубируйте кровь при 4 ° С в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании, или альтернативно, смешать образец каждые 10 - 15 мин.
  4. Промыть меченых крови 3 раза MTRC (ССО + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,22 мкм фильтр стерилизуют) следующим образом:
    1. Добавить по крайней мере, 2 тома MTRC, центрифуги при 750 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант, и resuspenD осадок в по крайней мере 2 объемами MTRC. Повторите еще 2 раза.
    2. После последней промывки, центрифуге при 750 мкг в течение 5 мин и объединить гранулированный крови в различных комбинациях (например, неочищенные Атто 633 / обрабатывают биотином, лечить биотин / обрабатывают Атто 633). Добавить ССО сделать до объема 200 мкл на мышь для инъекций.
  5. Подайте с надписью кровь внутривенно в грызун малярии инфицированных мышей или у неинфицированных лиц контрольной следующим образом:
    1. Выполните переливание на 2 - 15% паразитемией на пике паразита шизогонии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: это происходит примерно на полпути через темный цикла (т.е. между 12 - 2 часов ночи нормального цикла света, или 12 - 2 вечера на обратном световом цикле).
    2. Теплые мышей с использованием тепла лампы в течение 5-10 минут, чтобы увеличить приток крови, но принять меры предосторожности, чтобы не перегреть мышей. Место мышей в запретительного устройства и внутривенно вводят 200 мкл меченого кровь (примерно 1 - 2 х 10 9 RBCs) через хвостовую вену.
  6. Соберите образцы крови в различные моменты времени после инъекции, как описано в разделе 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие вторжения могут быть количественно меньше, чем 10 минут после инъекции, в зависимости от паразитемией мыши-реципиента.

3. Сбор образцов крови и подготовка к проточной цитометрии

  1. Подготовка 50 мкл окрашивающего раствора на образце, а также дополнительные, в день эксперимента следующим образом:
    1. Размораживание аликвоту 6 мм JC-1 хранили при -20 ° С в диметилсульфоксиде (ДМСО).
    2. Теплый 50 мкл каждого образца MTRC, плюс дополнительный, до 37 ° С.
    3. В то время как постоянно встряхивая предварительно нагревают MTRC, добавить JC-1, так что конечная концентрация составляет 12 мкМ. Это сделано, чтобы уменьшить образование JC-1 агрегатов; Если агрегаты же форме, не центрифужную пробирку, так как это позволит предотвратить окрашивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: небольшое количество агрегации не повлияет на результаты.
    4. Добавить анти-CD45 APC eFluor 780 и анти-CD71 PerCP eFluor 710 таким образом, чтобы конечная концентрация 1 мкг / мл. При выполнении меченого эксперимент RBC, добавить стрептавидин PE-Cy7 таким образом, чтобы конечная концентрация 1 мкг / мл.
  2. Выполнение хвостовой кровоточащих ампутации кончика хвоста или рваной раны кровеносного сосуда в хвосте. Поместите каплю хвоста крови на небольшой взвешивания лодки или стекло. После сбора крови, убедитесь, что кровотечение остановилось. Пипетка 3 мкл хвостовой крови в 50 мкл окрашивающего раствора предварительно нагревают до 37 ° С и инкубируют образцы при 37 ° С в течение 20 мин.
  3. Размораживание аликвоту 4 мМ Hoechst 33342 хранили при -20 ° С в дистиллированной воде (при использовании 355 нм лазера) или 2 мМ Hoechst 34580 хранили при -20 ° С в дистиллированной воде (при использовании 405 нм лазера). Подготовка 500 мкл каждого образца, плюс дополнительный, из 4 мкМ или 2 мкМ раствора Hoechst в MTRC, соответственно.
  4. Добавить 500 мкл 4 мкМ Hoechst33342 или 2 мкМ Hoechst 34580 образцам и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  5. Центрифуга клетки при 750 мкг в течение 3 мин при 4 ° С, отбросить супернатант, добавить 700 мкл MTRC и анализировать с помощью проточной цитометрии.

4. проточной цитометрии

  1. Анализ образцов с использованием лазера 355/488/633 нм или 405/488/633 нм лазерный инструмент.
  2. Образцы фильтруют через сито клеток 35 мкМ непосредственно перед анализом. Промыть фильтр клеток дистиллированной воды между образцами и повторного использования.
  3. Запишите достаточно события так, что маленький популяция содержит по меньшей мере 500 события (как правило, 1000000 - 10000000 Всего событий по образцу).
  4. Excite Hoechst 33342 с использованием 355 нм лазер и обнаруживать события через 460/50 фильтра. Excite Hoechst 34580 с использованием 405 нм лазер и обнаруживать события через 460/50 фильтра. Excite JC-1, анти-CD71 PerCP eFluor 710 и Стрептавидин PE-Cy7 использованием 488 нм лазер и обнаруживать события через 530/40, 692/40, а 750LP фильтровать соответствующиеLY. Excite ATTO 633 и анти-CD45 APC eFluor 780 с помощью 633 нм лазер и обнаруживать события через 670/30 или 750LP фильтра соответственно.
  5. Выполнить анализ и компенсацию используя соответствующий поток цитометрии программного обеспечения для анализа следующим образом:
    1. Выберите целые клетки и исключить шума, мусора и тромбоциты, основанные на FSC / SSC свойства (рис 2а). Выбор отдельных клеток на основе либо ширины импульса запуска (фиг.2В) или с помощью площадь пика FSC, чтобы соотношение высота (фиг.2с).
    2. Выберите зрелые эритроциты, а также исключить РБК-предшественники и лейкоциты, основанные на отрицательной флуоресценции в каналах PerCP eFluor 710 и APC eFluor 780 (рис 2D).
    3. При выполнении меченого эксперимент РБК, выберите каждый население меченых эритроцитов на основе PE-Cy7 и Атто 633 флуоресценции и анализировать их отдельно (рис 3а).
    4. Выберите pRBCs на основании положительного флуоресценции как для JC-1 и Hoechst (

5. Расчеты и статистика

  1. Рассчитать паразитемии путем деления количества pRBCs от общего количества эритроцитов (т.е. число событий в затворе Q2, деленное на число событий в затворе G4). При проведении анализа вторжения паразитемии из двух меченых популяциях может быть рассчитана путем деления количества меченых pRBCs от числа меченых эритроцитов в этой популяции (т.е. число событий, которые находятся в обоих вентилей L1 и Q2, деленное на количество событий в ворота L1).
    Примечание: Маркированный паразитемия значительно варьируется в зависимости от таких факторов, как эндогенного паразитемии и количества циркулирующих мерозоитов. По этой причине, было бы полезно, чтобы сообщить о степени паразитемии, который рассчитывается как паразитемии обработанной меченого населения, деленное на паразитемии управляющего помечены населения в каждой отдельной мыши. Для коррекции возможных последствий красителей, приводит отчетš среднее соотношение паразитемия по комбинации красителей двух.
  2. Определить статистическую значимость коэффициентов с использованием одного образца Т Испытайте с 1 как гипотетический среднего.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Измерение паразитемией.

Для измерения паразитемии, клетки крови первого должен быть выбран, и шум, мусор и тромбоциты исключены на основании FSC / SSC свойств (2А). В зависимости от используемого цитометра, отдельные клетки, то должен быть выбран на основе любой ширины импульса запуска (фиг.2В) или ФСБ высоты пика к отношение площади (фиг.2с). Оставшееся события должны состоять из лейкоцитов, окрашенных положительно для APC eFluor 780, РБК предшественники (в том числе ретикулоцитов), окрашенные положительными для PerCP eFluor 710, и зрелые эритроциты, негативных для обеих этих пятен (рис 2D). После выбора зрелый населения РБК, события должны разделиться на четыре группы населения в JC-1 флуоресценции заговор против Hoechst 33342 (рис 2Е, F) или Hoechst 34580 (рис 2G, H) флуоресценции. Двойной положительный населения представляет паразитами эритроцитов, в то время как гemaining населения либо неинфицированных эритроцитов (два отрицательное), HJ-БС (Hoechst положительным, JC-1 отрицательное), или неизвестные клетки (JC-1 положительным, Hoechst отрицательный). Следует отметить, что х-1 флуоресценции может перейти от максимумом при 529 нм к широкому пика эмиссии при 590 нм, в зависимости от митохондриального мембранного потенциала клетки. Независимо от этого сдвига JC-1 будут светиться сильно в 530/40 нм канала, что делает этот канал наиболее подходящий для анализа. Тем не менее, в некоторых случаях может быть полезным, чтобы дополнительная запись флуоресценции в 585/42 нм канала, который может обеспечить индикацию митохондриальной мембранного потенциала клетки. В неинфицированных пробах меньше, чем 0,007% событий должны быть двойной плюсовой (рис 2E, G). Этот результат будет зависеть от чистоты проточного цитометра, и может значительно изменяться, обширные очистки перед анализом может улучшить результаты. HJ-эритроциты составляют 0,3 - 0,9% от зрелых эритроцитов, что делает добавление JC-1 красителя важное значение для соотвуратов измерения малых паразитемией.

Оценка мерозоитам вторжения.

После инъекции меченых эритроцитов в инфицированных мышей относительные скорости вторжения в двух меченых популяций может быть определена. Образцы крови должны быть приняты, и полученный, как описано для измерения паразитемии с добавлением стрептавидина PE Cy7. Время, в которое отбирается проба зависит от условий эксперимента и желаемого результата анализа. В общем, более ранний момент времени будет лучше отражать фенотип вторжения, хотя это может быть полезным для сбора различные моменты времени для повышения точности. Для анализа данных проточной цитометрии, зрелые эритроциты должны быть выбраны, как на фиг.2. Из этих клеток, Атто 633 и биотин помечены эритроциты могут быть определены на основе флуоресценции в 670/30 и 750LP каналов соответственно (фиг.3А). Отсюда на трех популяций РБК (Атто 633, биотин, и немеченый)должны быть проанализированы отдельно. В каждом из этих популяций паразитемией может быть определена на основе окрашивания Hoechst и JC-1 (рис 3B-D).

Фигура 1
Рисунок 1. Схема в естественных условиях паразит вторжения анализа. Пример того, как этот анализ может быть использован для определения относительных скоростей вторжения в эритроцитах, обработанных в соответствии с биологическим вопрос пользователя будет показано на рисунке. Кровь собирали из неинфицированных мышей разделена на две трубки. Одна пробирка обрабатывают по желанию, а другой образец не лечить (A). Пробирки снова разделить друг с меченым с NHS-биотин, а другой с NHS-Atto 633 (B). Образцы затем объединяются в двух комбинациях; Биотин помечены обработанные эритроциты с Атто 633 меченых необработанные эритроциты и Atto 633 меченых лечение БС с Bioолова помечены необработанные эритроциты (C). Эти две комбинации вводят раздельно в двух большим количеством инфицированных мышей при шизогонии на 2 - 15% паразитемии (D). В общей сложности шесть мышей-реципиентов рекомендуется, чтобы получить статистической значимости в результате, хотя более или менее могут быть использованы, если это необходимо. Взято из Lelliott и др. 14, первоначально опубликованной БМЦ.

Фиг.2
Рисунок 2. Измерение паразитемией с помощью проточной цитометрии. Мусора, шума, и тромбоциты удаляются из анализа, основанного на FSC / SSC свойствами (A). Отдельные клетки затем выбирают из оставшихся элементов на основе любой ширины импульса запуска (B), или пика FSC соотношением области (С). Типы клеток могут быть определяют на основе положительного окрашивания CD45 APC eFluor780 (лейкоциты), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC предшественники), или отрицательное окрашивание (зрелые эритроциты) (D). После выбора зрелые эритроциты, клетки могут быть: Hoechst и JC-1 положительные (зараженных эритроцитов), Hoechst положительные и JC-1 отрицательный (эритроцитов, содержащих Howell Веселые органы), JC-1 положительные и Hoechst отрицательный (неизвестные клетки), или двойной отрицательный (неинфицированных эритроцитов). Неинфицированные и П. chabaudi инфицированных образцов, окрашенных Hoechst 33342 (E, F), или Hoechst 34580 (G, H), показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оценка мерозоитам вторжения в двух маркированных популяций РБК в естественных условиях. Земельные участки зрелых эритроцитов, закрытыйкак показано на рисунке 2. Два меченые популяции RBC могут быть выбраны на основе их этикетке (A). Atto 633 меченые клетки светиться в 670/30 канала (L1), биотин меченых клеток связывать со стрептавидином и светиться в канале PE-Cy7 (L3), а немаркированные клетки являются негативными для этих пятен (L4). В каждом из этих популяций зараженных эритроцитов могут быть идентифицированы на основе Hoechst и JC-1 положительное окрашивание (Q2) (BD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы описали метод для измерения как паразитемия и мерозоитам вторжения образцов в естественных условиях. С точки зрения измерения паразитемии, этот метод имеет преимущество по сравнению с предыдущими методами 10-13 в этом HJ-БС можно отличить от pRBCs, тем самым снижая количество ложных положительных событий. В то время как HJ-эритроциты, как правило, редко у людей, некоторые исследования показывают высокий уровень у мышей 15,16 делая различие между этими клетками и pRBCs важных для точного измерения грызунов паразитемией. Используя этот метод, предел обнаружения для паразитемией примерно 0,007% 14, хотя можно уменьшить это, как низко как 0,0005% при правильных условиях. Примечательно, что этот предел диктуется чистоты проточной цитометрии используется и возможностью получения большого числа событий в течение разумного периода времени. Наиболее распространенным из проблем, связанных с использованием этой техники недостаточно окрашивание умч JC-1. Флуоресценция JC-1 зависит от митохондриальной мембраны потенциала паразита и паразиты должны быть здоровыми, чтобы получить оптимальное окрашивание. Поэтому Длительное хранение паразитами или фиксации следует избегать до окрашивания.

Необходимо также соблюдать осторожность при анализе паразитов, которые были предметом лекарственных вмешательств, так как это также может повлиять на степень окрашивания JC-1. В этих случаях может быть полезно для анализа, основанного на паразитемии флуоресценции Hoechst один, по сравнению с паразитемии с добавлением JC-1 красителя. В самом деле, это может обеспечить измерение подсчета паразитов, а также общее представление о здоровье паразита. И, наконец, JC-1 краситель может сместить его флуоресценции с пиком при 529 нм с пиком при 590 нм путем формирования J-агрегатов. Формирование этих агрегатов зависит от концентрации красителя, который, в свою очередь, зависит от митохондриальной мембранного потенциала клетки. Потеря митохондриальной мембраны Potentiаль вызывает сдвиг флуоресценции к 529 нм, что может свидетельствовать клетки апоптическая. По нашему опыту pRBCs окрашенных JC-1 всегда проявляли подобную картину флуоресценции, которая была примерно равной интенсивности в обоих 530/40 нм канала и 585/42 нм канала. Тем не менее, в некоторых исследованиях, таких как те, которые используют лекарственные вмешательства, это может оказаться полезным для мониторинга изменений в соотношении флуоресценции между 530/40 нм канала и 585/42 нм канала на предмет наличия признаков потери митохондрий мембранного потенциала. Важно также отметить, что х-1 особенно подвержены деградации и должны быть свежеприготовленный из замороженного аликвоты, как описано, в то время как следует избегать циклов замораживания / оттаивания. После окрашивания, JC-1 флуоресценции является относительно стабильным с незначительным или без снижения флуоресценции, по меньшей мере, в течение нескольких часов.

Для в естественных условиях вторжения анализа, два наиболее важных фактора последовательность в маркировке пр РБКocess и время инъекции меченого крови. РБК маркировки, минимальное количество красителя должны быть использованы для предотвращения какого-либо вмешательства со способностью паразита, чтобы вторгнуться РБК, который был поднят в качестве возможности при использовании поверхностных этикетки 7. В условиях маркировки, описанных здесь, вторжение не ингибируется 14, однако особое внимание должно быть уделено поддержанию концентрации последовательные метки и красители должны быть включены, чтобы предотвратить любые неточности в результате вторжения ингибированию этикетке RBC. Как паразиты проходят синхронизированный цикл вторжения, важно, чтобы меченые клетки инъецируют в нужное время в жизненном цикле паразитов. Это должно быть сделано для того, чтобы максимально увеличить количество вторжения событий, и поэтому точность анализа. По нашему опыту пик вторжения происходит примерно на полпути через темный цикла, в обратном комната световой цикл выгодно для этого анализа.

ТWO вторжение этикетки анализ предлагает точный метод для определения мерозоитов эффективность вторжения в разных типах РБК в естественных условиях. Поэтому данный подход позволяет сравнение между обработанных эритроцитов, т.е. трипсином и управления эритроцитов. Кроме того, эритроциты из генетически модифицированных мышей можно сравнить с тем, контрольных мышей, или эритроцитов различных физиологических параметров или разного возраста можно сравнить. В то время как аналогичный анализ был описан для измерения вторжения в пробирке 9, анализ здесь обеспечивает потенциал для учета эффектов, присутствующих только в естественных условиях, в том числе действием иммунной системы, которые потенциально могут изменить паразита вторжения механизмы 17-19. И, наконец, этот анализ также имеет потенциал, чтобы обеспечить понимание патологий, таких как иммунный клиренс pRBCs и роста паразита, если pRBCs пределах меченых популяций контролируется в течение длительного периода.

ЧерезLL, Подробный протокол для точного измерения паразитемией в естественных условиях образцов в описано, которая имеет преимущество по сравнению с предыдущими анализами в этом HJ-БС можно отличить от pRBCs. Кроме того, анализ описан для количественной оценки эффективности вторжения в различные типы RBC в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем, финансовой поддержки из Национального научно-исследовательского совета по вопросам здравоохранения и медицинской (грант APP605524, 490037 и 1047082), Австралийский исследовательский совет (грант DP12010061), Инфраструктура Национальная стратегия Совместные исследования Австралии и инвестиционный фонд образования из отдела инноваций, промышленности Наука и исследования. PML является получателем австралийской последипломного награды.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>В Vivo</em> оценки грызунов <em>Plasmodium</em> паразитемия и мерозоитам вторжения с помощью проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter