Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo Bedömning av gnagare Plasmodium parasitemia och Merozoite Invasion av flödescytometri

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

Malariaparasiten invaderar och replikat inom röda blodkroppar. Den korrekt bedömning av merozoite invasion och parasitemi är därför avgörande för bedömningen loppet av malariainfektion. Här beskriver vi en flödescytometri baserat protokoll för mätning av dessa parametrar i en musmodell av malaria.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med den politik som Macquarie University och formas efter National Health och medicinska forskningsrådet (NHMRC) svenska uppförandekod. Arbetet utfördes under avtals Etik Ingen ARA 2012/017 godkända och som erhålls från Animal etikkommitté vid Macquarie University. Alla experiment utfördes på SJL / J-möss om inget annat anges.

1. Möss och experimentell malariainfektion

  1. Hus möss under kontrollerad temperatur (21 ° C) med en 12:12 timmar ljus-mörker-cykel.
  2. Tina en alikvot av kryokonserverad P. chabaudi adami DS med 5% parasite RBK (pRBCs) och injicera 200 l in i intraperitoneal hålighet C57BL / 6 donator mus.
  3. Övervaka donator mus parasitemi varje 1 - 2 dygn med hjälp av flödescytometri som beskrivs i Avsnitt 3 - 4 i detta protokoll. När givare når 5-15% parasitemia, samla blod från hjärtat på följande sätt:
    1. Aspirera 100 | il heparinlösning (300 U / ml heparin i mus Ringer-lösning (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 10 mM glukos, 30 U / ml heparin, pH 7,4, 0,22 pM filtersteriliserad)) i en 1 ml spruta med en 26 G nål.
    2. Bedöva musen genom inhalation med 5% isofluoran, vilket bekräftar den önskade anestesidjup genom frånvaron av pedaltillbakadragande respons och hornhinnan reflexer.
    3. Placera musen på dess sida och vinkelrätt skär nålen strax nedanför armbågen, genom revbenen och in i hjärtat. Dra ut kolven långsamt och rotera nålen tills 0,5-1 ml blod erhålls.
    4. Utför human dödshjälp genom halsdislokation under narkos.
  4. Beräkna pRBCs per volym givarblod antagande en blodstatus på 9 x 10 6 RBC / l (dvs om givaren var 10% parasitemi när offras, kommer blod att innehålla 9 x 10 5pRBC / il). Späd parasite blod i Krebs salin (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCOs 3, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,2% glukos, pH 7,2, 0,22 pM filtersteriliserad) så att koncentrationen är 1 x 10 4 pRBCs per 200 l och injicera 200 l in i intraperitoneal hålighet hos möss som krävs för RBC märkning och transfusions experiment.
  5. Övervaka parasitemi varje 1 - 2 dygn med hjälp av flödescytometri som beskrivs i avsnitten 3-4 i detta protokoll.

2. Märkning av RBC och transfusions

  1. Samla hepariniserat blod från möss genom hjärtpunktur som beskrivs i steg 1.3, och placera på is. Håll blod vid 4 ° C vid alla tidpunkter. Samla ca 200 l blod per mus som ska injiceras. Om det behövs, dela blod i två prover och behandla ett prov som önskat.
    OBS: I detta sätt, invasion av den behandlade SAMPle kan jämföras med en kontroll, obehandlade provet (se figur 1 för schematisk).
  2. Bered en 2x lösning av varje fluorescerande RBC etikett.
    1. Späd en 2 mg / ml stamlösning av Atto 633-N-hydroxisuccinimid (Atto 633-NHS) i MTR så att koncentrationen är 20 pg / ml.
    2. Späd en 25 mg / ml stamlösning av biotin-N-hydroxisuccinimid (Biotin-NHS) i MTR så att koncentrationen är 250 ^ g / ml.
  3. Split blodprov i två rör och tillsätt en lika volym av 2x Atto 633-NHS-lösning till ett rör, och en lika stor volym av 2x Biotin-NHS till det andra röret. Blanda omedelbart. Inkubera blod vid 4 ° C under 1 h med konstant långsam blandning, eller alternativt, blanda provet varje 10-15 min.
  4. Tvätta märkta blodet tre gånger med MTRC (MTR + 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 0,22 pM filtersteriliserad) enligt följande:
    1. Lägg minst två volymer av MTRC, centrifugera vid 750 xg under 5 minuter, avlägsna supernatanten och resuspend pelleten i åtminstone två volymer av MTRC. Upprepa två gånger.
    2. Efter den slutliga tvätten, centrifugera vid 750 xg under 5 min och kombinera det pelleterade blod i olika kombinationer (dvs obehandlade Atto 633 / behandlad biotin, obehandlat Biotin / behandlad Atto 633). Lägg MTR att göra upp till en volym på 200 l per mus som ska injiceras.
  5. Injicera märkt blod intravaskulärt in gnagare malaria infekterade möss eller oinfekterade kontroller enligt följande:
    1. Utför transfusion vid 2 - 15% parasitemi på toppen av parasiten schizogoni.
      OBS: detta sker ungefär halvvägs genom den mörka cykeln (dvs, mellan 12-2 am på en normal ljuscykel, eller 12-2 pm på en omvänd ljus cykel).
    2. Varma möss med en värmelampa i 5-10 minuter för att öka blodflödet, men vidta försiktighetsåtgärder inte överhettas mössen. Placera möss i en återhållande anordning och intravaskulärt injicera 200 l märkt blod (ca 1 - 2 x 10 9 RBCs) via svansvenen.
  6. Samla blodprov vid olika tidpunkter efter injektion som beskrivs i avsnitt 3.
    OBS: invasion hastigheter kan kvantifieras mindre än 10 min efter injektionen, beroende på parasitemi hos mottagaren mus.

3. Insamling av blodprov och förberedelser för flödescytometri

  1. Förbered 50 pl färgningslösning per prov, plus extra, på dagen för experimentet enligt följande:
    1. Upptining en alikvot av 6 mM JC-1 lagrades vid -20 ° C i dimetylsulfoxid (DMSO).
    2. Varm 50 | il av MTRC per prov, plus extra, till 37 ° C.
    3. Medan kontinuerligt vortexa den förvärmda MTRC, lägga JC-1 så att den slutliga koncentrationen är 12 ^ M. Detta görs för att minska bildningen av JC-1 aggregat; om aggregat bildar, inte centrifugrör eftersom detta kommer att förhindra missfärgning.
      OBS: En liten mängd aggregation kommer inte att påverka resultatet.
    4. Lägg anti-CD45 APC eFluor 780 och anti-CD71 PerCP eFluor 710 så att den slutliga koncentrationen är 1 | ig / ml. Om du utför den märkta RBC experimentet, till streptavidin PE-Cy7 så att den slutliga koncentrationen är 1 mikrogram / ml.
  2. Utför tail blödning genom amputation av svanstippen eller laceration av blodkärl i svansen. Placera en droppe svans blod på en liten väger båt eller glasskiva. Efter blod, se till att blödningen har slutat. Pipettera tre il av svansen blod i 50 pl färgningslösning förvärmas till 37 ° C och inkubera proverna vid 37 ° C under 20 min.
  3. Upptining en alikvot av 4 mM Hoechst 33342 lagrades vid -20 ° C i destillerat vatten (om användning av en 355 nm laser) eller 2 mM Hoechst 34580 lagrades vid -20 ° C i destillerat vatten (om användning av en 405 nm laser). Förbered 500 l per prov, plus extra, en 4 iM eller 2 ^ M lösning av Hoechst i MTRC, respektive.
  4. Lägg 500 l av 4 iM Hoechst33342 eller 2 | iM Hoechst 34580 till prover och inkubera vid RT i 20 min.
  5. Centrifugera cellerna vid 750 xg under 3 min vid 4 ° C, kassera supernatanten, till 700 l MTRC och analysera med flödescytometri.

4. Flödescytometri

  1. Analysera prover med hjälp av en 355/488/633 nm laser eller 405/488/633 nm laserinstrument.
  2. Filterprov genom en 35 ^ M cell sil omedelbart före analys. Skölj cell sil med destillerat vatten mellan prover och återanvändning.
  3. Spela tillräckligt händelser så att den minsta befolkningen innehåller minst 500 händelser (vanligtvis miljoner - 10 miljoner totalt händelser per prov).
  4. Excite Hoechst 33342 med hjälp av en 355 nm laser och upptäcka händelser genom ett 460/50 filter. Excite Hoechst 34.580 med hjälp av en 405 nm laser och upptäcka händelser genom ett 460/50 filter. Excite JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 och Streptavidin PE-Cy7 med hjälp av en 488 nm laser och upptäcka händelser genom ett 530/40, 692/40, och 750LP filtrera respektively. Excite Atto 633 och anti-CD45 APC eFluor 780 med hjälp av en 633 nm laser och upptäcka händelser genom ett 670/30 eller 750LP filtret respektive.
  5. Utför analyser och kompensation med lämplig flödescytometri analysprogram enligt följande:
    1. Välj hela celler och omfattar buller, skräp och trombocyter från FSC / SSC egenskaper (Figur 2A). Välj enstaka celler baserat på endera triggerpulsbredd (fig 2B) eller genom att använda FSC topparean till höjdförhållande (figur 2C).
    2. Välj mogna röda blodkropparna, och omfattar RBC progenitorceller och leukocyter, baserade på negativ fluorescens i PerCP eFluor 710 och APC eFluor 780 kanaler (figur 2D).
    3. Om du utför den märkta RBC experimentet väljer varje population av märkta RBC baserade på PE-Cy7 och Atto 633 fluorescens och analysera dessa separat (Figur 3A).
    4. Välj pRBCs grundas på faktiska fluorescens för både JC-1 och Hoechst (

5. Beräkningar och statistik

  1. Beräkna parasitemi genom att dividera antalet pRBCs med det totala antalet röda blodkroppar (dvs. antal händelser i grind Q2 dividerat med antal händelser i grinden G4). Vid genomförande invasionen analys parasitemi av de två märkta populationer kan beräknas genom att dividera antalet märkta pRBCs med antalet märkta RBC i den population (dvs antal händelser som finns i både grindar L1 och Q2, dividerat med antal händelser i grind L1).
    OBS: Märkt parasitemi varierar betydligt beroende på faktorer som endogen parasitemi och antalet cirkulerande merozoiter. Därför är det bra att rapportera parasitemi förhållandet, vilket beräknas som parasitemia av den behandlade märkta befolkningen dividerat med parasitemia av kontrollmärkta befolkningen i varje enskild mus. För att korrigera för eventuella färgämneseffekter resulterar rapporten ens en genomsnittlig parasitemi förhållande mellan de två färgämneskombinationer.
  2. Bestäm statistisk signifikans av nyckeltal som använder ett prov t-test med 1 som den hypotetiska medelvärde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mätning av parasitemi.

För mätning av parasitemia ska blodkroppar först väljas, och buller, skräp och trombocyter uteslutas, baserat på FSC / SSC egenskaper (Figur 2A). Beroende på cytometern används bör enskilda celler sedan väljas baserat på antingen triggpulsbredd (Figur 2B), eller FSC topphöjd areaförhållandet (figur 2C) till. Återstående händelser bör bestå av leukocyter, färgas positivt för APC eFluor 780, RBC stamceller (inklusive retikulocyter), färgade positivt för PerCP eFluor 710, och mogna RBC, negativa för båda dessa fläckar (Figur 2D). När du har valt den mogna RBC befolkningen, bör händelser separera i fyra populationer när JC-1 fluorescens plottas mot Hoechst 33342 (Figur 2E, F) eller Hoechst 34.580 (figur 2G, H) fluorescens. Den dubbla positiva befolkningen representerar parasite RBC, medan remaining populationer är antingen oinfekterade RBC (dubbla negativ), HJ-RBK (Hoechst positiv, JC-1 negativt) eller okända celler (JC-1 positiva, Hoechst negativ). Anmärkningsvärt, kan JC-1 fluorescens skifta från ett maximum vid 529 nm till en bred emissions topp vid 590 nm, beroende på mitokondriell membranpotential i cellen. Oavsett detta skifte JC-1 kommer fluorescerar starkt på 530/40 nm kanalen, vilket gör denna kanal mest lämpade för analys. Men i vissa fall kan det vara värt att dessutom rekord fluorescens i 585/42 nm kanalen, vilket kan ge en indikation på mitokondriell membranpotential av celler. I oinfekterade prover mindre än 0,007% av händelser bör vara dubbla positiva (Figur 2E, G). Detta resultat beror på hur ren flödescytometerns och kan variera avsevärt, får omfattande rengöring före analys förbättra resultaten. HJ-RBCs står för 0,3-0,9% av mogna RBC, gör tillsatsen av JC-1 dye kritisk för accurat mätning av låga parasitemi.

Bedömning av merozoite invasion.

Efter injektion märkta RBC i infekterade möss de relativa invasionshastigheter i de två märkta populationer kan fastställas. Blodprov bör tas och beredas som beskrivits för parasitemia mätning med tillägg av Streptavidin PE Cy7. Den tidpunkt vid vilken provet tas beror på försöksbetingelserna och önskade resultatet av analysen. I allmänhet kommer en tidigare tidpunkt bäst speglar en invasion fenotyp, även om det kan vara fördelaktigt att samla flera tidpunkter för att öka noggrannheten. För analys av flödescytometri uppgifter, bör mogna RBC väljas som i figur 2. Från dessa celler, kan Atto 633 och biotin märkta RBC identifieras utifrån fluorescens i 670/30 och 750LP kanaler respektive (Figur 3A). Härifrån på de tre RBC populationer (Atto 633, biotin, och omärkt)bör analyseras för sig. I var och en av dessa populationer parasitemi kan bestämmas utifrån färgning med Hoechst och JC-1 (Figur 3B-D).

Figur 1
Figur 1. Schematisk ritning av in vivo-parasiten invasionsanalys. Ett exempel på hur denna analys kan användas för att bestämma relativa invasions betala i RBCs behandlade enligt användarens biologiska fråga visas. Blod samlas in från oinfekterade möss är uppdelat i två rör. Ett rör behandlas såsom önskas medan den andra Provet lämnas obehandlade (A). Rör återigen delats med ett märkt med NHS-Biotin och den andra med NHS-Atto 633 (B). Prover kombineras sedan i två kombinationer; Biotin märkt behandlade RBC med Atto 633 märkta obehandlade RBC och Atto 633 märkt behandlade RBC med Biotenn märkta obehandlade röda blodkropparna (C). Dessa två kombinationer injiceras separat i två massor av infekterade möss under schizogoni vid 2-15% parasitemi (D). Totalt sex mottagarmöss rekommenderas att få statistisk signifikans i resultatet, även om mer eller mindre kan användas om det behövs. Anpassad från et al. Lelliott 14, ursprungligen publicerad av BioMed Central.

Figur 2
Figur 2. Mätning av parasitemi med flödescytometri. Skräp, buller och trombocyter avlägsnas från analys baserad på FSC / SSC egenskaper (A). Enstaka celler selekteras sedan från de återstående cellerna baserade på endera triggerpulsbredd (B), eller FSC toppareaförhållande (C) till. Celltyper kan sedan särskiljas utifrån positiv färgning med CD45 APC eFluor780 (leukocyter), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC progenitorer), eller negativ infärgning (mogna RBC) (D). När du har valt mogna RBC, cellerna är antingen: Hoechst och JC-1 positiva (parasite RBC), Hoechst positiv och JC-1 negativa (RBC innehåller Howell Jolly kroppar), JC-1 positiva och Hoechst negativ (okända celler), eller dubbel negativ (oinfekterade RBCs). Uninfected och P. chabaudi infekterade prover färgade med Hoechst 33342 (E, F), eller Hoechst 34.580 (G, H), visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Bedömning av merozoite invasion i två märkta RBC populationer in vivo. Tomter finns mogna RBC, gatedsom i figur 2. kan de två märkta RBC populationer väljas baserat på deras etikett (A). Atto 633 märkta celler fluorescerar i 670/30 kanalen (L1), biotin märkta celler binder till streptavidin och fluorescerar i PE-Cy7 kanal (L3), och omärkta celler är negativa för dessa fläckar (L4). I var och en av dessa populationer parasite RBC kan identifieras utifrån Hoechst och JC-1 positiv färgning (Q2) (BD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har beskrivit en metod för mätning av både parasitemia och merozoite invasion av in vivo prover. När det gäller parasitemi mätning, erbjuder denna metod en fördel jämfört med tidigare metoder 10-13 i den HJ-röda blodkropparna kan skiljas från pRBCs och därigenom minska antalet falska positiva händelser. Medan HJ-RBC är oftast sällsynt hos människor, vissa studier rapporterar höga nivåer i möss 15,16 gör skillnaden mellan dessa celler och pRBCs viktiga för korrekt mätning av gnagare parasitemi. Med denna metod detektionsgränsen för parasitemi är cirka 0,007% 14, även om det är möjligt att minska detta så lågt som 0,0005% under rätt förhållanden. Noterbart är denna gräns dikt av hygienen flödescytometerns används och möjligheten att få ett stort antal evenemang i en rimlig tid. Det vanligaste problemet i samband med användning av denna teknik är otillräcklig färgning with JC-1. Fluorescensen av JC-1 beror på mitokondriell membranpotential av parasiten, och parasiter måste vara frisk, för att erhålla optimal färgning. Långvarig förvaring av parasiter eller fixering bör därför undvikas före färgning.

Försiktighet bör också iakttas när man analyserar parasiter som har varit föremål för drog interventioner, eftersom detta också kan påverka omfattningen av färgning med JC-1. I dessa fall kan det vara till hjälp att analysera parasitemi baserad på Hoechst fluorescens ensam, jämfört med parasitemi med tillägg av JC-1 färgämne. I själva verket kan detta ge ett mått på parasitantal, liksom en övergripande indikation på parasit hälsa. Slutligen kan JC-1 färgämne flytta sin fluorescens från en topp på 529 nm till en topp vid 590 nm genom att bilda J-aggregat. Bildningen av dessa aggregat beror på färgkoncentration, som i sin tur beror på den mitokondriella membranpotentialen hos cellen. Förlusten av mitokondriemembran potential orsakar en förskjutning i fluorescens mot 529 nm, vilket kan tyda på celler är apoptotiska. I vår erfarenhet pRBCs färgade med JC-1 alltid uppvisade en liknande fluorescens mönster som var av ungefär samma intensitet i både 530/40 nm kanalen och 585/42 nm kanalen. Men i vissa studier, till exempel de som använder narkotika interventioner, kan det vara värt att följa förändringar i fluorescens förhållandet mellan 530/40 nm kanalen och 585/42 nm kanalen för eventuella indikationer på förlusten av mitokondriell membranpotential. Det är också viktigt att notera att JC-1 är särskilt känsliga för nedbrytning och bör beredas från en fryst alikvot som beskrivs, medan frys / upptiningscykler bör undvikas. Efter färgning är JC-1-fluorescens relativt stabil med liten eller ingen minskning i fluorescens, åtminstone under flera timmar.

För invasionen analysen in vivo, de två mest kritiska faktorerna är konsekvens i RBC märknings process och tidpunkten för injektion av märkt blod. För RBC märkning, bör den minsta färgämne användas för att förhindra eventuella störningar med förmågan av parasiten att invadera RBC, som har tagits upp som en möjlighet när du använder ytan etiketter 7. Under de märknings villkor som beskrivs här invasionen inte hämmas 14, dock noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt att upprätthålla konsekventa etikettkoncentrationer, och bör stängas färgämnen, för att förhindra eventuella felaktigheter på grund av invasion hämning av RBC etiketten. Som parasiter genomgå en synkroniserad invasion cykel, är det viktigt att märkta celler injiceras vid rätt tidpunkt i parasiter livscykel. Detta bör göras för att maximera antalet invasion händelser, och därför noggrannheten av analysen. I vår erfarenhet toppen av invasionen sker ungefär halvvägs genom den mörka cykeln, gör en omvänd ljus cykel rum fördelaktigt för denna analys.

Ett two etikett invasion analys erbjuder en noggrann metod för att bestämma merozoite invasion effektiviteten i olika typer av RBC in vivo. Detta tillvägagångssätt gör därför en jämförelse mellan behandlade RBC, dvs trypsin och kontroll RBC. Alternativt RBC från genetiskt modifierade möss kunde jämföras med dem i kontrollmöss, eller RBK av olika fysiologiska parametrar eller olika ålder kunde jämföras. Medan en liknande analys har beskrivits för mätning av invasionen in vitro 9, här ger analysen potential att redovisa effekterna endast är närvarande in vivo, inklusive påverkan av immunsystemet, vilket potentiellt kan förändra parasit invasion mekanismer 17-19. Slutligen har denna analys också potential att ge insikter i patologier såsom immun clearance av pRBCs, och parasittillväxt, om pRBCs inom de märkta populationerna övervakas under en längre tid.

Overall, ett detaljerat protokoll för korrekt mätning av parasitemi i in vivo prover beskrivs, som har en fördel jämfört med tidigare analyser i den HJ-röda blodkropparna kan skiljas från pRBCs. Dessutom görs en analys som beskrivs för kvantifiering av invasion effektiviteten i olika RBC typer in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Vi erkänner finansiering stöd från National Health och medicinska forskningsrådet (bevilja APP605524, 490.037 och 1.047.082), den svenska forskningsrådet (bevilja DP12010061), National Collaborative Research Infrastructure Strategy i Australien och utbildning investeringsfond från Institutionen för Innovation, industri , vetenskap och forskning. PML är en mottagare av en australisk Forskarutbildning utmärkelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>In vivo</em> Bedömning av gnagare <em>Plasmodium</em> parasitemia och Merozoite Invasion av flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter