Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm işlemler Macquarie Üniversitesi politikaları doğrultusunda yürütülen ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) uygulama Avustralya kod uyduğu bulundu. iş yok ARA 2012/017 onaylı ve Macquarie Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi'nden alınan anlaşma Etik altında yapıldı. Aksi belirtilmedikçe tüm deneyler SJL / J farelerinde gerçekleştirilmiştir.

1. Fare ve Deneysel sıtma enfeksiyonu

  1. 12:12 saat ışık-karanlık çevrimi ile kontrol edilen bir sıcaklıkta (21 ° C) altında Ev fareler.
  2. Kriyoprezerve P. bir kısım çözülme % 5 parazite eritrosit (prbcS) ve C57BL / 6 donör farenin periton boşluğuna 200 ul enjekte ile chabaudi adami DS.
  3. Bu protokolün 4 - Bölüm 3 açıklandığı gibi flow sitometri kullanılarak 2 gün - her 1 donör fare paraziteminin izleyin. Donörler 5 ulaştığında -% 15 oranında paraziteminin aşağıdaki gibi, kalp ponksiyonu ile kan toplamak:
    1. Aspire heparin çözeltisi ile (fare Ringer çözeltisi içinde, 300 U / ml heparin (MTR) (154 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2.2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 100 ul 10 mM glukoz, 30 U / ml Heparin, pH 7.4, 0.22 uM filtre 26 G iğne ile bir 1 ml şırınga içine)) sterilize edilmiştir.
    2. Pedal çekilme tepkisi ve kornea refleksleri yokluğu ile anestezi istenen derinliği teyit% 5 isofluorane ile inhalasyon yoluyla fare anestezisi.
    3. Kaburga ile, sadece dirsek altında yan fare ve dikey uç iğne yerleştirin ve kalbine. Yavaş yavaş şırınga pistonu çekin ve 0,5 kadar iğne döndürmek - 1 ml kan elde edilir.
    4. Anestezi altında servikal dislokasyon ile insani ötenazi yapın.
  4. Kurban ne zaman donör% 10 parazitemya oldu, eğer kan 9 x 10 5 içerecektir yani 9 x 10 6 RBC / ul (bir kan sayımı varsayarak donör kan hacmi başına prbcS hesaplayınpRBC / ul). Krebs parazitik kan seyreltin (25 mM NaHCO 3, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2,% 0.2 glukoz, pH 7.2, steril 0.22 mikron filtre 126 mM NaCI, 2.5 mM KCI) tamponlu tuz konsantrasyon 200 ul başına 1 x 10 4 prbcS ve RBC etiketleme ve transfüzyon deney için gerekli olan farelerin periton boşluğuna 200 ul enjekte böylece.
  5. Bu protokolün 4 - Bölüm 3 açıklandığı gibi flow sitometri kullanılarak 2 gün - her 1 paraziteminin izleyin.

Eritrosit ve Transfüzyon 2. Etiketleme

  1. Aşama 1.3 'de tarif edildiği gibi kardiyak delme ile heparinize edilmiş farelerden kan toplamak ve buz üzerine yerleştirin. Her zaman, 4 ° C'de kan tutun. Fare başına yaklaşık 200 ul kan toplayın enjekte edilecek. Gerekirse iki numune içine kan bölünmüş ve arzu edilen bir örnek ele.
    Not: tedavi SAMP Bu şekilde, istilale bir kontrole kıyasla olabilir, işlenmemiş numune (şematik için Şekil 1).
  2. Her floresan RBC etiketinin 2x çözeltisi hazırlayın.
    1. Konsantrasyon 20 ug / ml olacak şekilde MTR içinde Atto 633-N-hidroksisüksinimid (Atto 633-NHS) içindeki bir 2 mg / ml stok çözeltisi ile seyreltilir.
    2. Konsantrasyonu 250 ug / ml olacak şekilde MTR Biotin-N-hidroksisüksinimid (Biotin-NHS), bir 25 mg / ml stok çözeltisi ile seyreltilir.
  3. Iki tüp içine kan örnekleri bölme ve bir boru ve başka boru 2x Biotin-NHS, eşit hacimde 2x Atto 633-NHS çözeltisi eşit hacimde ekleyin. Hemen karıştırın. Sabit yavaş bir karıştırma ile 1 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin kan, ya da seçenek olarak, her 10 örnek karışımı - 15 dakika.
  4. Aşağıdaki gibi MTRC (MTR +% 0.5 sığır serum albümini (BSA), steril 0.22 mikron filtre) kan etiketli 3 kez yıkayın:
    1. 5 dakika boyunca 750 x g'de MTRC en az 2 hacim, santrifüj ekleme süpernatant kaldırmak ve resuspenMTRC en az 2 hacim pelet d. 2 kez daha tekrarlayın.
    2. 5 dakika ve 750 xg'de son yıkama, santrifüj sonrasında farklı kombinasyonlarda topak haline kan birleştirmek (yani, işlenmemiş Atto 633 / tedavi Biotin, işlenmemiş Biyotin / Atto 633 tedavi). Enjekte edilecek, fare başına 200 ul bir hacme kadar telafi etmek MTR ekleyin.
  5. Aşağıdaki gibi intravasküler kemirgen sıtma enfekte edilen farelerin ya da enfekte olmamış kontrollere içindeki işaretli kan enjekte:
    1. Parazit schizogony zirvesinde% 15 parazitemya - 2 de transfüzyonu gerçekleştirin.
      NOT: Bu karanlık döngüsü boyunca yaklaşık yarım meydana gelir (yani, 12 arasında - ters ışık döngüsü 14:00 - normal ışık döngüsü 02:00, veya 12).
    2. 5-10 dakika için bir ısı lambası kullanarak Sıcak fareler, kan akışını artırmak, ancak fareler yanmamasına tedbirleri almak. Frenleyici bir cihaz fareler yerleştirin ve intravasküler 200 ul etiketli kan enjekte (yaklaşık 1-2 x 10 9 RBKuyruk damarından Cs).
  6. Bölüm 3'te tarif edildiği gibi enjeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında kan örnekleri toplamak.
    Not: istila oranları alıcı farenin parazitemi bağlı olarak, enjeksiyondan sonra en az 10 dakika boyunca ölçülebilir.

Akış Cytometry Kan Örneklerinin ve Hazırlık 3. Koleksiyonu

  1. Aşağıdaki gibi deney gününde, boyama numune başına çözeltisi artı ekstra 50 ul hazırlanması:
    1. Dimetil sülfoksit içinde, -20 ° C (DMSO) saklanan 6 mM JC-1 bir kısım defrost.
    2. 37 ° C sıcak bir 50 numune başına MTRC ul, artı ilave.
    3. Nihai konsantrasyon 12 uM olacak şekilde sürekli olarak önceden ısıtılmış MTRC vorteks iken, JC-1 ekleyin. Bu JC-1 agrega oluşumunu azaltmak için yapılır; agrega formu yoksa, bu boyama önlemek gibi değil santrifüj tüp yapmak.
      NOT: toplama maddesinin küçük bir miktarı sonuçlarını etkilemez.
    4. Anti EkleCD45 APC eFluor 780 ve anti-CD71 PerCP eFluor 710 nihai konsantrasyon 1 ug / ml olacak şekilde. Etiketli eritrosit Deney durumunda nihai konsantrasyon 1 ug / ml olacak şekilde streptavidin PE-Cy7 ekleyin.
  2. Kuyruk içindeki kan damarı kuyruk veya laserasyon ucu amputasyon ile kuyruk kanama gerçekleştirin. Küçük tartmak tekne veya cam slayt üzerine kuyruk kan bir damla yerleştirin. Kan toplama sonra, kanama durduktan emin olun. Boyama çözeltisi 50 ul halinde kuyruk kan Pipet 3 ul 37 ° C'ye önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de numune inkübe edin.
  3. (355 nm lazer kullanılıyorsa) damıtılmış su içinde -20 ° C'de saklandı, 4 mM Hoechst 33342 ya da (405 nm lazer kullanılıyorsa) damıtılmış su içinde -20 ° C'de saklandı, 2 mM Hoechst 34580 bir kısım defrost. Sırasıyla MTRC içinde Hoechst bir 4 uM ya da 2 uM çözeltisi, örnek başına 500 ul hazırlanması, ayrıca ilave.
  4. 4 mcM Hoechst 500 ul ekleyin33342 veya numune 2 uM, Hoechst 34580 ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  5. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 750 xg, ıskarta süpernatant, Santrifüj hücreleri 700 ul MTRC ekleyin ve flow sitometri ile analiz.

4. Akım Sitometri

  1. Bir 355/488/633 nm lazer veya 405/488/633 nm lazer cihazı kullanarak örnekleri analiz edin.
  2. Analiz hemen önce 35 mcM hücre süzgecinden Filtre örnekleri. Örnekler ve yeniden kullanım arasında damıtılmış su ile hücre süzgecinden durulayın.
  3. (- Numune başına 10,000,000 toplam olaylar genellikle 1.000.000) küçük nüfusu en az 500 olayları içerecek şekilde yeterli olayları kaydedin.
  4. 355 nm lazer kullanarak Hoechs 33.342 Excite ve bir 460/50 filtresi aracılığıyla olayları algılar. 405 nm lazer kullanarak Hoechs 34.580 Excite ve bir 460/50 filtresi aracılığıyla olayları algılar. Excite JC-1 anti-CD71 PerCP eFluor 710 ve Streptavidin PE-Cy7 488 nm lazer kullanarak ve 530/40 ile olayları tespit, 692/40 ve 750LP ilgili filtrely. Bir 633 nm lazer kullanarak ATTO 633 ve anti-CD45 APC eFluor 780 Excite ve sırasıyla 670/30 veya 750LP filtresi aracılığıyla olayları algılar.
  5. Aşağıdaki gibi analiz yazılımı sitometri uygun akışını kullanarak analiz ve tazminat gerçekleştirin:
    1. Bütün hücreleri seçin ve FSC / SSC özellikleri (Şekil 2A) dayalı gürültü, enkaz ve trombosit dahil değildir. Her iki tetik darbe genişliği (Şekil 2B) veya yükseklik oranı (Şekil 2C) FSC pik alanı kullanılarak dayalı tek hücreleri seçin.
    2. Olgun eritrositlerde seçin ve PerCP eFluor 710 ve APC eFluor 780 kanalları (Şekil 2B) negatif floresan dayalı RBC atalarıdır ve lökositler, dışarıda.
    3. Etiketli RBC deneyi gerçekleştirmek ise, PE-Cy7 ve ATTO 633 floresan dayalı etiketli eritrosit her nüfusu seçin ve bu ayrı (Şekil 3A) analiz.
    4. (Ikisi de JC-1 ve Hoechst pozitif floresan dayalı prbcS seçin

5. Hesaplamalar ve İstatistik

  1. Eritrosit toplam sayısına göre prbcS sayısına bölünmesiyle paraziteminin hesaplayın (yani, kapı G4 olayların sayısına bölünmesiyle kapı Q2 olayların sayısı). İki etiketli nüfusun işgali tahlil paraziteminin yapılırken (bu popülasyonda etiketli eritrosit sayısına göre etiketli prbcS sayısına bölünmesiyle hesaplanır, yani kapıları L1 ve Q2 hem de olan olayların sayısı, olayların sayısına bölünmesiyle kapı L1).
    NOT: Etiketli parazitemisi ölçüde böyle endojen parazitemya ve dolaşımdaki merozoit sayısı gibi faktörlere bağlı olarak değişir. Bu nedenle, her bir fare kontrol etiketli nüfusun parazitemi bölünmesiyle tedavi etiketli nüfusun parazitemi olarak hesaplanır parazitemi oranını rapor yararlıdır. Olası boya efektleri düzeltmek için, rapor sonuçları birİki boya kombinasyonları arasında ortalama parazitemisi oranı s.
  2. Varsayımsal ortalama olarak 1 ile bir örnek t-testi kullanılarak oranlarının istatistiksel olarak anlamlı belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Parazitemya ölçümü.

Parazitemya ölçümü için kan hücreleri ilk seçilmelidir ve gürültü, enkaz ve trombositler FSC / SSC özellikleri (Şekil 2A) dayalı hariç. Kullanılan sitometresinde bağlı olarak, tek hücreler, daha sonra alan oranı (Şekil 2C) için iki pals genişliği (Şekil 2B), veya FSC pik yüksekliğine göre seçilmelidir. Etkinlik lökositlerin oluşmalıdır kalan APC eFluor 780 için pozitif boyandı, PerCP eFluor 710 ve bu lekeler (Şekil 2D), hem negatif olgun eritrositlerde, pozitif boyanmış (retikülosit dahil) RBC progenitörler. JC-1 parlaklığı Hoechst 33342 (Şekil 2E, K) ve Hoechst 34580 (Şekil 2G, H), floresan karşı çizilmiştir Olgun eritrosit nüfus seçtikten sonra, olay dört popülasyonları ayırmak gerekir. Çift pozitif nüfus, parazitik eritrositlerde temsil r iseemaining popülasyonlar ya bulaşmamış RBC (çift negatif) olan HJ-eritrosit (Hoechst pozitif, negatif JC-1), ya da bilinmeyen hücreler (JC-1 pozitif, Hoechst negatif). Özellikle, JC-1 parlaklığı bir hücrenin mitokondriyal membran potansiyeli ile ilgili olarak, 590 nm 'de geniş bir emisyon pik için 529 nm'de bir maksimum kayabilecek. Ne olursa olsun bu değişimin JC-1 analizi için bu kanal en uygun hale 530/40 nm kanalda güçlü floresan olacaktır. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bu hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelinin bir göstergesi temin edebilmektedir 585/42 nm kanal, ilave olarak kayıt floresan yararlı olabilir. Bulaşmamış örneklerde olayların daha az 0.007% çift pozitif (Şekil 2E, G) olmalıdır. Bu sonuç, akış sitometresinin temizlik bağlıdır ve oldukça, analizden önce kapsamlı temizlik sonuçları artırabilir değişebilir. Acc için JC-1 boya ilavesi kritik hale olgun eritrositlerde 0,9% - HJ-eritrosit 0.3 için hesapDüşük parazitemi ürat ölçümü.

Merozoit işgali değerlendirilmesi.

Enfekte farelere etiketli eritrositlerde enjekte ettikten sonra iki etiketli nüfus içine göreceli işgal oranları tespit edilebilir. Kan numuneleri alındı ​​ve Streptavidin PE Cy7 ilavesiyle parazitemi ölçümü için tarif edildiği gibi hazırlanır. Numune alınır hangi zaman deneysel koşullar ve analiz istenen sonucuna bağlıdır. O doğruluğunu artırmak için çoklu zaman puan toplamak için yararlı olabilir, ancak genel olarak, bir önceki zaman noktası iyi bir işgal fenotip yansıtır. Veri akış sitometrisi analizi için, olgun eritrositler, Şekil 2'de olduğu gibi seçilmiş olması gerekir. Bu hücrelerden, Atto 633 ve biyotin etiketli RBC sırasıyla 670/30 ve 750LP kanallarda floresan (Şekil 3A) göre belirlenebilir. (ATTO 633, biotin ve etiketsiz) burada üç RBC nüfus itibarenayrı ayrı analiz edilmelidir. Bu popülasyonlar parazitemi her Hoechst ve JC-1 (Şekil 3B-D) bulunan boyama göre belirlenebilir olarak.

Şekil 1,
In vivo olarak, parazit yayılması deneyinin Şekil 1. şeması. Bu deney, kullanıcının biyolojik bir soru göre muamele eritrositlerde göreli istila oranlarını belirlemek için kullanılabilir dair bir örnek gösterilmektedir. Enfekte edilmemiş farelerden toplanan kan iki boru ayrılmıştır. Bir boru diğer numune muamele edilmemiş (A), bu arada arzu edilen şekilde işleme tabi tutulur. Tüpler tekrar NHS-biotin ile etiketlenmiş bir NHS-Atto 633 (B) ile bir diğeri ile ayrılır. Numuneler daha sonra, iki kombinasyon içinde bir araya getirilmektedir; Biotin ATTO ile 633 etiketli işlenmemiş eritrositlerde tedavi eritrositlerde etiketli ve Atto 633 Bio ile eritrositlerde tedavi etiketlikalay etiketli işlenmemiş eritrositler (C). % 15 parazitemya (D) - Bu iki kombinasyonları 2'de schizogony boyunca enfekte edilmiş farelerin iki partiye ayrı ayrı enjekte edilir. 6 alıcı farelerin toplam gerekirse daha fazla veya daha az kullanılabilir olmasına rağmen, sonuç olarak anlamlı düzeye önerilir. Lelliott ark. 14 uyarlanmıştır, aslen BioMed Central tarafından yayınlandı.

Şekil 2,
Şekil akışı ile parazitemya 2. ölçümü sitometri. Enkaz, gürültü, ve trombositler FSC / SSC özellikleri (A) dayalı analizler kaldırılır. Tek hücreler daha sonra alanı oranı (C) 'ye ya da pals genişliği (B) veya FSC tepe göre kalan hücreler seçilir. Hücre tipleri sonra CD45 APC eFluor pozitif boyanma dayalı ayırt edilebilir780 (lökositler), CD71 PerCP eFluor 710 (RBC ataları), veya negatif boyanma (eritrositlerde olgun) (D). Hoechst ve JC-1 pozitif (parazitlenmiş eritrositler), Hoechst pozitif ve JC-1 negatif (Howell Jolly organları içeren eritrositlerde), JC-1 pozitif ve negatif Hoechst (bilinmeyen hücreler), ya da çift negatif: olgun eritrositlerde seçtikten sonra, hücreler ya vardır (bulaşmamış eritrositler). Enfekte olmamış ve P. Hoechst 33.342 (E, F), ya da Hoechst 34580 (G, H) ile boyandı enfekte örnekleri chabaudi, gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
In vivo iki etiketli RBC nüfus içine Merozoit işgali 3. Değerlendirmesi Şekil. Arsalar, olgun eritrosit kapılı olanŞekil 2 olmasıdır. İşaretli iki eritrosit gruplar ise etiketin (A) bağlı olarak seçilebilir. Atto 633 etiketli hücreler 670/30 kanalı (L1) 'de floresan, biyotin etiketli hücreler streptavidin bağlanan ve PE-Cy7 kanalı (L3) bulunur floresan ve etiketlenmemiş hücrelerin bu lekeler (L4) için negatiftir. Parazite eritrositler Hoechst ve JC-1 pozitif boyanma (Q2) (BD) dayalı tespit edilebilir bu nüfusun her birinde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu, in vivo örneklerin her ikisi de parazitemi ve Merozoit istilası ölçümü için bir yöntem tanımlanmıştır. Parazitemi ölçümü açısından, bu yöntem, ve böylece yanlış pozitif olayların sayısını azaltarak, prbcS ayırt edilebilir HJ-eritrositlerde önceki yöntemlerin 10-13 üzerinde bir avantaj sağlar. HJ-eritrosit insanlarda genellikle nadir olmakla birlikte, bazı çalışmalar kemirgen parazitemya doğru ölçümü için önemli olan bu hücreler ve prbcS arasındaki ayrım yapmadan farelerde 15,16 yüksek seviyelerde rapor. Doğru koşullar altında bu kadar düşük 0.0005 olarak% azaltmak mümkün olmasına rağmen bu yöntemi parazitemya için tespit sınırı kullanarak, yaklaşık 0.007% 14 olduğunu. Özellikle, bu sınır kullanılır akış sitometresi ve makul bir zaman miktarında olaylar çok sayıda elde etme özelliği gibi temizlik göre belirlenir. Bu tekniğin kullanımı ile ilişkili en yaygın sorun yetersiz boyama zekâh JC-1. JC-1 floresan parazit mitokondriyal membran potansiyeline bağlıdır ve parazitler uygun boyama elde etmek için, sağlıklı olmalıdır. Parazitlerin ya da tespitin uzun süreli depolama nedenle boyama öncesinde kaçınılmalıdır.

İlaç müdahalelere maruz kalmıştır parazitleri analiz ederken bu da JC-1 ile boyanma ölçüde etkileyebilir gibi bakım da, dikkatli olunmalıdır. Bu durumlarda, JC-1 boya ilavesi ile parazitemi ile karşılaştırıldığında, tek başına Hoechst floresan göre paraziteminin analiz etmek faydalı olabilir. Gerçekten de, bu parazit sayısının bir ölçüsünü, hem de parazit sağlık hakkında genel bir bilgi temin edebilmektedir. Son olarak, JC-1 boyasıyla J agregatları oluşturarak 590 nm'de bir tepe 529 nm'de bir zirveye flüoresanını kayabilir. Bu agrega oluşumu da hücre mitokondriyal membran potansiyeline bağlıdır boya konsantrasyonuna bağlıdır. mitokondriyal membran potansiyometresi kaybıEl hücreleri apoptotik olan gösterebilir 529 nm doğru floresan bir kayma neden olur. JC-1 ile boyanmıştır deneyim prbcS daima 530/40 nm kanal ve 585/42 nm hem de kanal bakımından yaklaşık olarak eşit yoğunlukta olan benzer bir floresan deseni sergilemiştir. Ancak, bazı çalışmalarda, bu tür ilaç müdahalelerini kullananlar gibi, bu 530/40 nm kanal ve mitokondriyal membran potansiyeli kaybı herhangi bir endikasyon için 585/42 nm kanal arasındaki floresan oranı değişiklikleri izlemek için değerli olabilir. Bu JC-1 bozulmaya karşı özellikle hassastır ve donma / erime döngüleri kaçınılmalıdır Taze olarak tarif edildiği gibi bir donmuş kısım hazırlanabilir gerektiğini not edilmesi de önemlidir. Boyama işleminden sonra JC-1 parlaklığı, en az birkaç saat boyunca flöresandaki çok az veya hiç azalma, nispeten kararlıdır.

In vivo işgali deneyi için, iki en kritik faktör RBC etiketleme pr tutarlılık vardırkapsayabilecektir ve etiketlenmiş kan enjeksiyon süresi. RBC etiketleme için, minimum boya miktarının, yüzey etiketleri 7 kullanıldığında bir olasılık olarak gündeme gelmiştir alyuvar, istila parazitin yeteneğine sahip herhangi bir etkileşimi önlemek için kullanılmalıdır. Burada anlatılan etiketleme koşulları altında işgali ancak dikkatli dikkat tutarlı etiket konsantrasyonlarını korumak verilmelidir, 14 inhibe değil, ve boyalar RBC etikete göre işgali inhibisyonuna bağlı herhangi bir yanlışlıklar önlemek için, açık olmalıdır. Parazitler bir senkronize işgali döngüsü geçmesi gibi, etiketli hücreler parazitler yaşam döngüsü içinde doğru zamanda enjekte edilmesi önemlidir. Bu işgal olayların sayısını ve bu nedenle tahlilin hassasiyetini en üst düzeye çıkarmak için yapılmalıdır. Bizim deneyimimizde işgali zirve Bu deney için bir ters ışık döngüsü oda avantajlı hale karanlık döngüsü boyunca yaklaşık yarım oluşur.

tEtiket işgali tahlil in vivo RBC farklı türlerde Merozoit işgali etkinliğini belirlemek için doğru bir yöntem sunmaktadır wo. Bu yaklaşım, bu nedenle tedavi yani RBCs, tripsinlendi ve kontrol eritrosit arasında bir karşılaştırma sağlar. Alternatif olarak, genetik olarak modifiye edilmiş farelerden alınan eritrositler karşılaştırılabilir kontrol farelerinin ya da farklı fizyolojik parametreler ya da farklı yaş eritrositlerde kişilerce karşılaştırılabilir. Benzer bir deney, in vitro 9 istilası ölçümü için tarif edilmiş olmakla birlikte, deney burada potansiyel parazit istilası mekanizmaları 17-19 değiştirebilir bağışıklık sisteminin etkisi de dahil olmak üzere, in vivo olarak, sadece, bu etkileri için hesaba potansiyel sağlar. Etiketli nüfus içindeki prbcS uzun bir süre boyunca izlenmektedir Son olarak, bu deney aynı zamanda, bağışıklık prbcS temizlenmesi ve parazit büyümesi gibi patolojilerin içgörü sağlama potansiyeline sahiptir.

OveraLl in vivo örneklerde parazitemi doğru ölçümü için detaylı bir protokol HJ-eritrositlerde önceki deneylere göre bir avantaj olan, açıklanan prbcS ayırt edilebilir. Ayrıca, bir analiz, in vivo olarak farklı eritrosit tipe istila etkinliği ölçümü için tarif edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz (APP605524, 490.037 ve 1.047.082 hibe) Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi destek fon yny, Avustralya Araştırma Konseyi (DP12010061 hibe), Yenilik Bölümü'nden Avustralya Ulusal İşbirlikçi Araştırma Altyapısı Strateji ve Eğitim yatırım fonu, Sanayi Bilim ve Araştırma. PML Avustralya Lisansüstü ödül bir alıcı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
Akış Cytometry tarafından Kemirgen <em>Plasmodium</em> parazitemi <em>Vivo</em> Değerlendirilmesi ve Merozoit <em>Invasion</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter