Introduction
細胞は、多くの組織における機械的負荷にさらされ、この機械的刺激は、遺伝子発現、増殖因子の放出、サイトカイン、または細胞外マトリックスと細胞骨格のリモデリング1-4のパターンの変化を促進することが示されています。このような機械的刺激から形質細胞内シグナルは、メカノ5-7のプロセスを経て起こります。呼吸器系では、メカノの一つの結果は、活性酸素種（ROS）の環状の引張歪みの存在下での肺上皮細胞における8,9およびプロ炎症性サイトカイン10の増加です。強力な証拠も過度の引張歪みがセル11-14の生化学的応答に加えて、肺胞上皮の損傷を導くにつながることを示唆しています。ここでの焦点は、機械的変形に肺細胞の応答に主であるが、メカノによって誘発される経路は、BASにおいて重要な役割を果たし血管緊張15の調節および成長板16の開発など、人体の多くの組織のIC機能。
メカノへの関心の高まりは、培養細胞や組織への生理学的に関連する機械的負荷の適用のための多数のデバイスの開発をもたらしました。具体的には、組織が 経験する機械的負荷の一般的な形態である引っ張り歪を適用するデバイスは、人気11,17-19あります。しかし、利用可能なデバイスの多くは、いずれかの組織工学アプリケーションのためのバイオリアクターとして設計やストレッチでリアルタイムイメージングに資するものではありません。このように、メカノの経路の調査を容易にするために、張力の細胞及び組織を視覚化することができるツールおよび方法を開発する必要があります。
ここで、面内の機械的延伸装置が設計され、プロトコルは、Mを適用するために開発されましたultiple組織への株の形態および細胞リアルタイム（ 図1A-D）における生化学的および機械的応答のイメージングを可能にします。デバイスは、可撓性膜をつかみ、約20％（ 図1B）に面内、ラジアル膨満アップを適用するために円周方向に配置された6つの等間隔のクランプを使用しています。モータ（ 図1C）がインキュベータの外 部に配置され、モータ供給業者によって提供される独自のソフトウェアによって制御される作動装置は、長期間の細胞培養インキュベーターに置くことができます。モータは、緊張と弛緩中に均一6ストレッチャクランプを駆動する、内部カムを回転させるリニアドライバに接続されています。
機械装置に加えて、カスタマイズされた柔軟な膜は、機械的なシステムで使用される市販の細胞培養準備膜から作成されました。およその直径そして円形壁（28ミリメートル）を作製し、細胞にのみ十分に記載ひずみプロフィールのこの領域中で培養することができるように、可撓性膜上に付着させました。作動装置内のこれらの膜の配置は、可撓性膜の中心部に均一で等方性の歪みを提供するかどうかを決定するために、有限要素解析は、市販のソフトウェア（ 図1E-F）を用いて行きました。フレキシブル膜は、対称境界条件でモデル化し、メッシュのすべての四角形要素を利用しました。 図1Fに示す最大主ひずみの等高線図に見られる同心リングは、歪みの等方性の分布を示しています。
膜によって受ける歪みがローディング（ 図2）を介してマーキングの画像を記録することによって測定した。 図2Dは 、半径方向及び軸方向に測定された平均膜株がほぼ直線であったことを示します適用モータに対して20％の最大線形歪みにカウントアップします。バック休止位置へ後退時に測定されたものと比較して膨張時に測定された歪みのレベルの間に有意差はなかったです。次に、カスタム可撓性膜上で培養したヒト気管支上皮細胞（16HBE）及びそれらの核の変位を測定しました。全細胞の変位は、デジタルマイクロスコープを用いて記録位相コントラスト画像を用いて測定したのに対し16HBE細胞の蛍光標識（DAPI）核は、共焦点顕微鏡下で20X対物レンズを用いて画像化しました。 図3に見られるように20％の線形歪み〜まで、核の変位によって測定ひずみは、膜上のマーキングの変位によって測定されたものと同様でした。これは、膜に加わる歪みを接着細胞に伝達されたことを確認します。従来の顕微鏡のカスタムデバイスの使用を記述プロトコルおよび原子間力microscopeは、以下のステップで提供されます。
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Protocol
1。細胞培養培地の保持のためのウェル壁を有する膜の構築（最終製品については、図1Dを参照してください）
- コラーゲンIでコーティングされたポリジメチルシロキサン（PDMS）のシートを使用して、外科用メスまたはダイを可撓性膜の輪郭をカットします。
- ストレージのための60ミリメートルペトリ皿に各膜を配置します。
- 壁の作成：
- B（硬化剤）をエラストマーにエラストマーAの1の重量比：10にPDMSを混ぜます。
- 50mlチューブに完全に混合PDMSの5ミリリットルを注ぎます。
- ハイブリダイゼーションオーブンに水平に未硬化のPDMSを用いて50 mlチューブを置きます。
- 硬化時間の間に8回転で被覆するために、チューブの内壁をローター関数を使用します。 RTで、PDMSは、完全に2日間で硬化させることになります。
- 滅菌細胞培養フード内管からPDMSを削除します。
- 新しいカミソリの刃を使用して、セクションの高さ4ミリメートルにPDMSのシリンダーを分割。
- 膜WAとなるセクションを配置壁が折り目を付けになることを可能にすることのないペトリ皿容器にLLS、。
- ペトリ皿に2を維持しながら、一つの膜の上にPDMSの一方の壁を選択し、中央。
- 接着剤として使用する壁の外側周囲に：（1比10）静かに未硬化PDMSを配置します。それは、液体を保持することがあるため、壁と膜との間のギャップの形成を防止します。
- 各ペトリ皿完成膜を含有し、硬化させる24時間70℃のオーブンでカバーを置きます。
キャリブレーションのためのクランプ変位または放射状の成長（図2）とモータ回転2.相関
- モータを制御するソフトウェアを起動します。
- モーターソフトウェアの手動設定を使用してデバイスのクランプを移動さ。
- 距離を測定し、クランプの最小値と最大変位の両方でクランプの対向間のモータカウント位置を記録。
- Dの変化率（％）を計算しますモーター·カウント（〜0-75kカウント）の関数としてのクランプ間istance。これは、膜上で達成される最大の潜在的なひずみを示します。
マウス肺上皮細胞株のストレッチの3.アプリケーション（MLE12）
- ウェルあたり可撓性膜上の250万細胞（ステップ1）でのシードMLE12細胞は、2日以内にコンフルエントします。播種密度は、異なる細胞タイプについて変化し得ます。
- 機械式アクチュエータが完全にリラックスした位置にあることを確認します。
- 細胞培養培地を除去します。
- 6クランプのそれぞれに2つの穴を開け、1.5ミリメートルに生検パンチを使用して膜のタブ（ 図1Dを参照してください）。穴の径方向の配置は、最初にプリテンション膜経験の量を決定します。何の予備張力を希望されない場合、膜のタブで20.5ミリメートルの半径で穴を開ける。
- パンチ穴がクランプ内ピンと並んでストレッチャー上の膜の位置を調整します。代わりにトップクランプを配置します。ネジの側面を交互に一つずつを締めます。
- 1ミリリットルの細胞培養培地を追加します。
- 光路を有する膜の中央を中心に顕微鏡ステージ上には置か。
- （可能な場合）ステージにデバイスを固定するテープや磁石を使用してください。いったん固定、顕微鏡のステージコントローラと機械装置の面内（膜に平行）および垂直（Z方向）を制御します。
- 手動でモータ回転20の位置や速度を制御することにより、製造業者によって提供されるソフトウェアでストレッチを適用します。
ミトコンドリア活性酸素種の4測定（ROS）
- 細胞がコンフルエントになったら、直接細胞にミトコンドリアのスーパーオキシドインジケータ（5μM最終濃度）でRT DMEM 1〜2mlのを追加します。
- 37℃で10分間インキュベートします。
- 洗浄細胞を穏やかに緩衝液で3回の水浴中で加温し37°C。
- すぐに直立共焦点顕微鏡下で既に代わりにストレッチャ（ステップ2.2）に柔軟な膜を配置します。
- フェノールレッドを含まない培地およびHEPES 25mMので1mlのDMEMを追加します。
- 580分の510 nmの励起/発光フィルターを設定します。
- 画像の複数のフィールドは、15分ごとには、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生の所望の時間経過を作成します。
- 撮影された画像から、記録蛍光強度は、蛍光強度を定量化することが可能なソフトウェアを使用して、各時間間隔でヒストグラム。
ストレッチや原子間力顕微鏡（AFM）の5.アプリケーション
注：これらの手順は、特定のAFMと光学顕微鏡の組み合わせ（ 図4および物質一覧）のために提供されます。
- 実験のAFMを準備します。
- z方向の最大位置にAFMヘッドの高さを増やします。
- AFMの足への増量を入れてサンプルAFMカンチレバーコンタクトれるプレーンを持ち上げます。試料とAFMヘッドは機械装置の高さに対応するために持ち上げられる必要があります。
- （利用可能な場合）、光学顕微鏡を準備します。
- AFMスキャナプレートを取り外します。所望の目的を削除します。
- 客観的にスペーサーを追加します。スペーサの高さは、客観的かつ具体的なAFMのセットアップに依存しますが、光学イメージングが所望される場合、観察面がストレッチャーとアダプター高さに等しい量だけz方向にシフト（ 図になりますので、それが必要です図5（a））。 AFMは、通常、デバイス上記光路から低倍率のイメージングを提供することに注意してください。
- バックの位置で所望の目的をマウントします。 AFMに戻すにスキャナを配置します。
- AFMソフトウェアを起動します。蛍光測定のための光源を含むすべての必要な光源を起動します。
- その片持ち梁にチップをマウントします目的の測定に適しています。生細胞の弾性率を測定するとき200 PN / nm以下剛性が好ましいです。
- レーザーの位置を合わせ、デバイスに搭載されたガラスカバースリップ上で製造者の指示に従ってカンチレバー剛性を調整します。
- ステップ1のものが、以下のように変更して膜を準備します。
- すぐにストレッチデバイス上に膜を取り付ける前に、高さ約1mmの壁をカット。これは、膜の壁とロードセルとの間に経験する干渉を防止します。
- 3.2.1-3.2.3に記載されているように機械装置の膜をマウントします。
- 流出の場合にはAFMスキャナへの損傷を防ぐために、細胞培養培地を取り除き。
- カップルアダプタ（ 図5A）を持つデバイス。スキャナーのアダプタと機械装置を配置します。
- 希望の引張ひずみレベルに膜を伸ばします。
- による流出にAFMスキャナや顕微鏡の損傷を避けるために、細胞上のメディアの限定（<0.5 ml）のボリュームを追加します。
- 膜と片持ち梁に係合します。
- 関心領域をスキャンするために、特定のAFM装置のプロトコルに従ってください。
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Representative Results
活性酸素種と変形
以前の研究は、環状のストレッチ21に応答して、気道及び肺胞上皮細胞における活性酸素種（ROS）の増加を示しました。活性酸素種は、分子及び脂質、タンパク質、多糖、および核酸22-24に対して高い反応性を有する分子酸素由来のフリーラジカルを含みます。 ROSは、一般的な細胞内のイオンチャネルの機能を調節するための信号、プロテインキナーゼ/ホスファターゼ活性化、および遺伝子発現としての役割を果たすが、過剰又は無秩序な産生は、アポトーシスおよび壊死性細胞死、神経変性、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および癌24,25に寄与することができます。電子は電子伝達鎖から漏れたときにスーパーオキシド、ROSの他の形態のためのプレカーソルは、ミトコンドリア呼吸の副産物として生成することができます。以前の研究では、力学的サイクルのストレッチは、スーパーの産生を刺激したことを示唆しましたNADPHオキシダーゼ系（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）、およびミトコンドリアの電子伝達鎖（錯体IおよびIII）の組み合わせを介して酸化物。それは、この刺激は、おそらく細胞骨格への接続に、ミトコンドリア21の直接の歪みに起因したことが提案されています。我々は、機械的ストレッチに応答した生細胞におけるROS産生の画像の変更をすることができるように、この仮説を検証するためには、デバイスをストレッチセルを開発しました。ここで、延伸による気管支上皮細胞によって産生されるミトコンドリアのROSは、カスタムデバイスおよびプロトコルを使用して測定しました。機械的なストレッチの非存在下では、ROSの産生が有意に60分（ 図4）を介して増加しませんでした。単一の17％の伸びを印加し、維持された場合には、さらに60分間持続し、ミトコンドリアROSの増加がありました。
ストレッチのために直接の上皮単層の損傷
2で議論されてきた害れる間接メカニズム。いくつかの研究は、肺上皮細胞の過剰な機械的ストレッチが細胞11,13,26,27への損傷を伴う直接的な傷害を引き起こす可能性があることを示唆しています。損傷のこのタイプの機械的膨張時にリアルタイムイメージングすることなく捕捉することは困難です。このように、カスタムデバイスおよび位相差顕微鏡、機械的に前に記録した延伸された細胞のおよびプロ炎症性サイトカイン（6時間50ng / mlのTNF-α）（ 図5）で処理した後の連続した画像を利用します。細胞の同じフィールドの画像が増加するひずみレベルで捕捉しました。画像は、赤の矢印で示されるように、細胞が10〜15％ひずみとの間に張架されたギャップの形成を示します。これは、ストレッチの端部との間に<、これらの画像は、ほぼリアルタイムで記録されたことを遅れの10秒に注意することが重要です hおよびイメージング、細胞を延伸されました。延伸した細胞の細胞イメージングの以前の研究では、画像は、前ストレッチがない延伸条件11,13,28で細胞の画像のみを比較した後に得られました。
延伸した細胞のAFMナノインデンテーション
機械装置は、（ 図6Aを参照）アダプタプレートを使用してAFMの中に入れました。以前に公開された方法13、弾性率マッピング前MLE12細胞の（Eマップ）および10％後の引張歪みを使用する（ 図6D-E）を得ました。 10％の株（ 図6D）での位相コントラスト画像はストレッチの10秒以内に得られたが、 図6D-Eに示すE-マップは、40ミクロン×40ミクロンにわたって記録300個々の力-変位曲線で約22分を消費しましたz方向の先端の2.5ミクロン/秒の速度でエリア。OM /ファイル/ ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図1.細胞培養、延伸のためのカスタム設計された装置。 （A）装置の機械的設計のコンピュータ生成された図面、（B）完成したデバイス、（C）1次元運動にモータの回転に変換し、リニアモータドライバに接続されたデバイスの写真を撮影します（D）シリコーンゴム膜のクランプ二軸延伸を制御します。基板は、各クランプのポストに置かれるように、各クランプタブの2つの穴が含まれています。による対称境界条件を使用することに全体の構造の1/4である可撓性膜の（E）に寸法FEAモデル。 （
図2（A）を適用ひずみを測定するために適用されるマーキング柔軟な膜をサポートするデバイスが示されています。クローズアップマーキングの画像は、（B）の前及び（C）のストレッチ後、明らかに膜上のマーキングのずれを示す矢印で標識しました。 （D）のアプローチと後退時のモータカウントの関数として膜株。膜株は後退がわずかに高い産生株でのアプローチと後退の両方に類似していました。 HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg「ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3膜株細胞への送信。（A - B）（A）の前に10倍の対物レンズを使用して、可撓性膜上のヒト気管支上皮細胞（16HBE）の位相差画像と、（B）は、20％歪の後。 （C - D）16HBE細胞の蛍光標識（DAPI）核（C）の前及び（D）は、20％歪の後、共焦点顕微鏡下で20倍の対物レンズを用いて画像化しました。 （E）細胞が経験した膜の歪みは、線形、均一でした。T = "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4. 16HBE細胞のROS産生上の単一のストレッチの影響は、共焦点顕微鏡下で20倍の対物レンズを使用して、累積ミトコンドリアのスーパーオキシドセンサーを用いて観察した（A - C）。スナップショット時間の経過（0、60分、および細胞の同じフィールドの延伸時のスーパーオキシド産生の〜65分）。 （D）最初の一時間（BとA）内のスーパーオキシドのベースライン生産からの蛍光強度の50％の増加を示す経時16HBE細胞の相対蛍光強度。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
増加のストレッチに肺胞上皮（MLE12）単層の応答の図5.位相差画像（A - D）がすべて 20Xの目的としたデジタル顕微鏡を用いて記録しました。矢印は、細胞と細胞の分離が発生した位置を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ストレッチによる細胞のナノインデンテーションのためのAFMに示す図6（A）の機械装置。スキャナは客観エクステンダーの配置のために除去しなければなりません。三つの脚延長装置を可能にするために、AFMヘッドのすべての3つの脚に取り付けられています配置。アダプタプレートは、AFMスキャナ（黒色プレート）上にストレッチャーを装着するために利用されます。前ストレッチ位相コントラスト画像MLE12細胞（B）に示す矢印の方向に片持ち梁走査します。前（B）及び後（C）のストレッチ画像の赤い四角は、ナノインデンテーション（40X対物レンズ）の間に捕捉された領域を示しています。弾性率マップは、（D）の前後（E）ストレッチ、以前に公開さ解析技術13で得られる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
メカニカルストレッチ中に生細胞イメージングのためのユニークなデバイスを開発しました。このデバイスは、肺上皮細胞のメカノを研究するためのプロトコルで使用されました。予備研究では、単一の保持されたストレッチは、気管支上皮細胞におけるミトコンドリアのスーパーオキシド産生を刺激することが見出されました。また、機械的な歪みのレベルの増加は、肺胞上皮細胞の単層の完全性に直接的な損傷を引き起こすことが実証されました。
これらの予備実験を行うために、デバイスが最初に較正し、次に、膜株細胞（ 図2-3）に送信されたことが示されました。 図3Eに示されている（膜上のマークによって測定される）は、膜のひずみと（核との間の距離によって測定される）細胞株との間に密接な相関関係によって示されるように、全体的なデバイスは、好調に推移しました。しかし、ストラの間で観察されたいくつかのマイナーな違いがありました図2Dに示すように、アプローチ中膜およびマーカーの戻り曲線に測定しました。これは、装置内のバックラッシュや問題点を把持する可能性と関連する可能性が高かったです。それは効率的に異なる構成を有する顕微鏡に使用することができるように加えて、デバイスのための普遍的な取り付け機構が必要です。これは、顕微鏡に強い接続を維持しつつ、装置及び画像取得の位置との間で費やされる時間を減少させるであろう。膜にパンチ穴は、弾性材料のクランプ初期圧縮状態の形成を防止するために膜にマイナー予歪を適用するために使用されました。圧縮状態も最大適用歪みの低減につながります。
カスタムデバイスは、機械的なストレッチの間に生きた細胞のナノインデンテーションを可能にするために、アサイラムMFP3D原子間力顕微鏡に適合するように設計されました。我々は、ですることができる任意の他のデバイスを認識していませんAFM内で機能することができ、撮像面に等方性応力状態をducing。デバイスはまた、細胞培養インキュベーター中での連続使用のために設計した（5％CO 2で湿った、無菌環境で37℃に保持）。インキュベーター内で機能する能力は、長期的なストレッチレジメンを受けている細胞の研究を可能にします。
提示方法にはいくつかの制限があります。まず、膜ストレッチとして、焦点のフィールドがあるが、最小限、平面の外に移動する（〜100ミクロン）。視野は、膜の膨張の過程で変化するため、ストレッチ療法を通して細胞のフィールドを追跡するときにこれが限界となります。直径22mm内膜は0.23から0.25株を経験していますが、この内径の経験より変動ひずみ場の外側の領域。イメージング研究を簡単に中央領域に限定しているが、それは、細胞株のより高いレベルに応答することが可能です外側の領域に中心領域内の細胞の応答に影響を与えることができます。関心の大きな領域にわたって均一なひずみ分布は、膜の設計の改善を達成することができます。 PDMS膜は、一般的に蛍光指示薬に使用される波長での自家蛍光であり、これは、膜の下からの細胞の蛍光を画像化するための能力を制限します。この理由のために正立顕微鏡は、上記のROS産生の我々の研究で水浸対物レンズを用いて使用しました。これは、AFMおよび蛍光イメージングを組み合わせた研究のために制限することができます。
細胞に機械的な歪みを適用するための最も一般的な市販の装置（FlexCell FX 5000テンションシステム）は、光学面の内外に移動させながら膜に引っ張り歪を印加する制御可能な真空システムを採用しています。本明細書に提示膜とクランプデザインは、歪みが等方性であると平面allowinに残る二軸ひずみ場を作成しますGリアルタイムイメージング。膜設計に若干の修正を加えて、担架にも一軸延伸モードを生成することができます。細胞を最初に膨張した膜上に播種した場合、面内の圧縮荷重を適用することもできます。デバイスは、歪みの生理学的および病理学的レベルの両方に到達することができます。要約すると、新たなデバイスおよびプロトコルは、蛍光顕微鏡およびAFMナノインデンテーションを使用して画像化することができる細胞を生きて機械的歪みを適用するために使用することができる開発されました。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、彼らのサポートのためにメンフィス大学の技術のフェデックス研究所に感謝そのたいと思います。著者らは、メンフィス（デビッド·バトラー、ジャッキー·カーター、ドミニククリーブランド、ヤコブシェーファー）の大学で機械工学部門のシニア·デザイン·プロジェクトグループの学生を認めるしたい、モータ制御のための大学メンフィスの技術工学部門からのダニエル·コーン細胞培養における彼らの助けのため、博士ビンテンさんとCharlean Luellen。この作品は、K01 HL120912（ER）とR01 HL123540（CMW）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5" x 5.25" x 0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
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