Introduction
Zellen werden gegenüber mechanischen Belastungen in vielen Geweben unterzogen, und das mechanische Stimulation wurde gezeigt, dass Veränderungen in den Mustern der Genexpression, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Umbau der extrazellulären Matrix zu fördern und Zytoskelett 1-4. Die intrazellulären Signale solcher mechanischen Reizen transduziert auftreten durch den Prozess der mechanotransduction 5-7. Im Atmungssystem ist ein Ergebnis der mechanotransduction die Erhöhung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 8,9 und proinflammatorische Zytokine 10 in Lungenepithelzellen in Gegenwart von zyklischen Zugbelastung. Starke Beweise legen auch nahe, dass die übermäßige Zugspannung führt zu Verletzungen der Alveolarepithel direkt neben den biochemischen Reaktionen der Zellen 11-14. Obwohl der Fokus liegt hier vor allem auf die Reaktion der Lungenzellen auf mechanische Verformung, Wege durch Mechanotransduktion induzierte spielen eine Schlüsselrolle in den basic Funktion vieler Gewebe im menschlichen Körper, einschließlich der Regulation des Gefäßtonus 15 und die Entwicklung der Wachstumsplatte 16.
Das wachsende Interesse an mechanotransduction hat zur Entwicklung zahlreicher Geräte für die Anwendung von physiologisch relevanten mechanischen Belastungen an kultivierte Zellen und Gewebe geführt. Insbesondere sind Geräte Anlegen einer Zugspannung, die eine häufige Form der mechanischen Belastung durch Gewebe erfahren ist, populär 11,17-19. Jedoch können viele der verfügbaren Geräte werden entweder als Bioreaktor für das Tissue Engineering-Anwendungen entwickelt oder sind nicht förderlich für eine Echtzeitabbildung mit Stretch. Als solches gibt es einen Bedarf an Werkzeugen und Verfahren, die Zellen und Gewebe unter Zugspannung zu visualisieren kann, um die Untersuchung von Wegen von mechanotransduction erleichtern.
Dabei wurde eine in der Ebene mechanischen Spannvorrichtung entwickelt und Protokolle wurden entwickelt, um m geltenultiple Formen Stamm zu Geweben und Zellen und ermöglicht die Abbildung der biochemischen und mechanischen Reaktionen in Echtzeit (1A-D). Das Gerät verfügt über sechs in Umfangsrichtung angeordnet, um eine flexible Membran greifen und gelten in der Ebene liegende radiale Ausdehnung von bis zu etwa 20% (1B) gleichmäßig beabstandete Schellen. Die Betätigungsvorrichtung kann in einem Zellkulturbrutschrank über einen längeren Zeitraum gegeben werden, während der Motor (1C) außerhalb des Inkubators angeordnet ist und von proprietärer Software vom Motorlieferanten bereitgestellt gesteuert. Der Motor ist mit einem linearen Antriebsteil, der einen Innennocken dreht, fahren die sechs Trage Klemmen einheitlich in An- und Entspannung verbunden ist.
Zusätzlich zu der mechanischen Vorrichtung wurden angepasst flexiblen Membranen aus im Handel erhältlichen Zellkultur bereit Membranen geschaffen, um in dem mechanischen System verwendet werden. Dann kreisförmigen Wände (mit einem Durchmesser von ca.28 mm) wurden hergestellt und auf die flexible Membran, so dass Zellen nur in diesem Bereich der gut beschriebene Spannungsprofil kultiviert werden, befestigt. Um zu bestimmen, ob die Position dieser Membranen innerhalb der Betätigungsvorrichtung würde gleichförmig und isotrop Belastung in der Mitte der flexiblen Membran bereitzustellen, wurde Finite-Elemente-Analyse unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software (1E-F) durchgeführt. Die flexible Membran wurde mit symmetrischen Randbedingungen und die Nutzung aller vierseitigen Elemente zu dem Netz modelliert. Die konzentrischen Ringe in der Konturdiagramm der maximalen Hauptdehnung in 1F gezeigt gesehen zeigen die isotropen Verteilung der Belastung.
Der Stamm von der Membran erfahren wurde durch die Aufnahme von Bildern von Markierungen durch Beladung (Figur 2) gemessen. 2D zeigt, dass der durchschnittliche Membran Dehnung in radialer und axialer Richtung gemessen wurde, war annähernd linearenin Bezug auf die angelegte Motor zählt bis zu einer maximalen linearen Dehnung von 20%. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Dehnungsniveaus während Ausdehnung gemessen im Vergleich mit denen beim Zurückziehen wieder in die Ruheposition gemessen wird. Als nächstes wird die Verschiebung der humanen bronchialen Epithelzellen (16HBE) und ihre Kerne auf dem benutzerdefinierten flexible Membran kultiviert wurden, wurden gemessen. Fluoreszenzmarkierten (DAPI) Kerne der 16HBE Zellen wurden mit einem 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird, während ganze Zelle Verschiebung wurde mit Phasenkontrast-Aufnahmen mit einem digitalen Mikroskop aufgenommenen Mess. Wie in Figur 3 zu sehen ist, die Belastung durch die Verschiebung der Kerne gemessen wurde, war ähnlich der durch Verschieben von Markierungen auf der Membran gemessen wird, bis zu ca. 20% linear Belastung. Dies bestätigt, daß der Stamm zu den Membranen aufgebracht wurde zu den adhärenten Zellen übertragen. Die Protokolle, die die Verwendung des benutzerdefinierten Geräte auf einem herkömmlichen Mikroskop und ein Atomkraft microscope werden in den folgenden Schritten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aufbau der Membrane mit Well Walls für Retention von Zellkulturmedien (siehe 1D für das Endprodukt)
- Verwendung Polydimethylsiloxan (PDMS) Platten mit Collagen I beschichtet sind, schneiden die Kontur der flexiblen Membran mit einem Skalpell oder einer Düse.
- Platzieren Sie jede Membran in einer 60 mm Petrischale für die Lagerung.
- Erstellung von Wänden:
- Mischungs PDMS bei einem 10: 1-Gewichtsverhältnis von Elastomer A bis B (Härter) Elastomer ist.
- Gießen Sie 5 ml vollständig vermischt PDMS in 50 ml Tuben.
- Zeigen 50 ml Röhrchen mit nicht ausgehärteten PDMS horizontal in einem Hybridisierungsofen.
- Verwenden die Rotorfunktion zur Beschichtung der Innenwände der Rohre bei 8 rpm während der Aushärtezeit. Bei RT wird das PDMS vollständig in 2 Tagen ausgehärtet werden.
- Entfernen Sie die PDMS aus der Röhre in einem sterilen Zellkultur Kapuze.
- Mit Hilfe einer neuen Rasierklinge, partitioniert die Zylinder des PDMS in Abschnitte 4 mm in der Höhe.
- Legen Sie die Abschnitte, die als Membran wa dienen wirdlls, in eine Petrischale Behälter, ohne dass die Wände zu werden erhöht.
- Auszuwählen und in der Mitte einer Wand des PDMS an einer Membran, während die beiden in der Petrischale erhalten bleibt.
- Ganz sanft ungehärteten PDMS (Verhältnis 10: 1) auf dem äußeren Umfang der Wand, als Klebstoff verwendet werden. Verhindern die Bildung von Zwischenräumen zwischen der Wand und der Membran, da es dort zu Flüssigkeit zurückzuhalten.
- Platzieren Sie jede Petrischale mit den fertigen Membran und in einem Ofen bedeckt bei 70 ° C für 24 Stunden, um zu heilen.
2. Korrelation der Motorumdrehungen mit Clamp Verschiebung oder radiale Wachstum für Kalibrierung (Abbildung 2)
- Starten Sie die Software die Steuerung des Motors.
- Verdrängen die Klemmen des Geräts mit der manuellen Einstellung der Motorsoftware.
- Messen des Abstands und Aufzeichnung der Motor Zählposition zwischen gegenüberliegenden Klemmen an beiden minimalen und maximalen Verschiebung der Klammern.
- Berechnen der prozentualen Änderung in der distance zwischen den Klammern in Abhängigkeit von der Motorzählung (~ 0-75k Aktivität). Dadurch wird die maximal mögliche Belastung der Membran erreicht anzuzeigen.
3. Anwendung der Stretch auf Maus Lung Epithelzelllinie (MLE12)
- Samen MLE12 Zellen 2,5 Millionen Zellen auf der flexiblen Membran (Schritt 1) pro Vertiefung innerhalb von zwei Tagen konfluent werden. Die Aussaatdichte für unterschiedliche Zelltypen variieren.
- Sicherzustellen, dass die mechanische Betätigungseinrichtung in einer vollständig entspannten Position.
- Entfernen von Zellkulturmedien.
- Verwendung von 1,5 mm Biopsieausstanzungen, Punch zwei Löcher in jeder der sechs Klemm (siehe Figur 1D) Laschen der Membran. Die radiale Anordnung der Löcher bestimmt die Menge der Vorspannung der Membran zunächst Erfahrungen. Ausstanzung der Löcher auf einem Radius von 20,5 mm an den Membranzungen wenn keine Vorspannung erwünscht ist.
- Positionieren Sie die Membran auf dem Keilrahmen mit den gestanzten Löchern Schlange mit den Stiften in den Klammern.Zeigen oberen Klemmen vorhanden. Ziehen Sie die Schrauben ein zu einer Zeit wechselseitig.
- 1 ml Zellkulturmedium.
- Platzieren der Vorrichtung auf dem Mikroskoptisch Zentrierung der Mitte der Membran mit dem Lichtweg.
- Verwenden Sie Isolierband oder Magneten (wenn möglich), um das Gerät auf die Bühne zu beheben. Sobald festen, steuern die in der Ebene (parallel zur Membran) und vertikalen (z-Richtung) der mechanischen Einrichtung mit der Tischsteuereinrichtung des Mikroskops.
- Bewerben Strecke mit dem vom Hersteller durch die Position und Geschwindigkeit der Motordrehung 20 manuelle Steuerung zur Verfügung gestellte Software.
4. Messung der Mitochondrial reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
- Sobald Zellen konfluent, fügen Sie 1-2 ml RT DMEM mit mitochondrialen Superoxid-Anzeige (5 & mgr; M Endkonzentration) direkt auf die Zellen.
- Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
- Wasche die Zellen vorsichtig dreimal mit Puffer erwärmt in einem Wasserbad auf37 ° C.
- Sofort platzieren die flexible Membran auf dem Keilrahmen (Schritt 2.2) bereits im Rahmen einer aufrechten konfokalen Mikroskop.
- 1 ml DMEM mit Phenolrot-freiem Medium und 25 mM HEPES.
- Stellen Anregungs- / Emissions Filter können 510/580 nm.
- Bild mehrere Felder alle 15 min, um die gewünschte Zeitverlauf der mitochondrialen Superoxid-Produktion zu schaffen.
- Von aufgenommenen Bildern, Histogramme Aufzeichnung der Fluoreszenzintensität in jedem Zeitintervall unter Verwendung von Software in der Lage ist die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität.
5. Anwendung der Stretch und Rasterkraftmikroskopie (AFM)
Hinweis: Diese Schritte werden für eine bestimmte AFM und optischen Mikroskop Kombination (Abbildung 4 und Materialliste) versehen ist.
- Bereiten Sie das AFM für das Experiment.
- Erhöhen die Höhe des AFM Kopfes zu seiner maximalen Position in der z-Richtung.
- Gesetzt Extender auf die Beine des AFMHeben Sie die Ebene, bei der AFM Cantilever Kontakten der Probe. Die Probe und das AFM Kopf muss angehoben werden, um die Höhe der mechanischen Vorrichtung aufzunehmen.
- Bereiten Sie das Lichtmikroskop (falls vorhanden).
- Entfernen Sie die AFM-Scanner Platte. Entfernen Sie das gewünschte Ziel.
- Fügen Sie einen Abstandshalter auf das Ziel. Die Höhe des Abstandhalters würde die Aufgabe und die spezifische AFM Aufbau abhängen, aber es ist erforderlich, wenn optische Bildgebung erwünscht ist, da Beobachtungsebene verschiebt sich in der z-Richtung um einen Betrag gleich der Trage und Adapterhöhe (Figur sein 5A). Beachten Sie, dass die AFM bietet in der Regel geringer Vergrößerung Bildgebung aus einer optischen Pfad über dem Gerät.
- Montieren Sie die gewünschte Ziel wieder in seine Lage. Stellen Sie den Scanner wieder ein, um die AFM.
- Starten Sie die AFM-Software. Starten Sie alle notwendigen Lichtquellen einschließlich der Lichtquelle für Fluoreszenzmessungen.
- Montieren Sie einen Chip mit einer freitragenden Balken,ist für die gewünschten Messungen geeignet. 200 pN / nm oder weniger Steifigkeit wird bevorzugt, wenn die Messung des Elastizitätsmoduls von lebenden Zellen.
- Richten Sie den Laser und Kalibrierung des freitragenden Steifigkeit nach Hersteller Vorschläge auf einem Deckglas auf dem Gerät angebracht ist.
- Vorbereitung einer Membran wie in Schritt 1, jedoch mit folgenden Modifikationen.
- Unmittelbar vor der Montage der Membran an der Streckvorrichtung, schneiden die Wände bis etwa 1 mm in der Höhe. Dies verhindert, dass die Interferenz zwischen den Membranwänden und dem Last Zelle erfährt.
- Halterung der Membran an der mechanischen Vorrichtung, wie beschrieben, 3.2.1-3.2.3.
- Zellkulturmedium zu entfernen, um eine Beschädigung der AFM-Scanner im Falle eines Austretens verhindern.
- Paar das Gerät mit einem Adapter (5A). Legen Sie die mechanische Vorrichtung mit dem Adapter auf den Scanner.
- Dehnen Sie die Membran auf die gewünschte Dehnung Ebene.
- Fügen Sie eine begrenzte (<0,5 ml) Volumen von Medien auf die Zellen, um AFM Scanner oder Mikroskop Schäden zu vermeiden aufgrund eines spill.
- Aktivieren Sie den Freiträger mit der Membran.
- Folgen Sie dem Protokoll des jeweiligen AFM-Gerät, um Bereiche von Interesse zu scannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reaktive Sauerstoffspezies und Deformation
Frühere Studien haben Steigerungen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Atemwegen und alveolare Epithelzellen in Reaktion auf zyklische Dehnung 21 gezeigt. Reaktive Sauerstoffspezies umfassen Moleküle und freie Radikale aus molekularem Sauerstoff mit einer hohen Reaktivität gegenüber Lipiden, Proteinen, Polysacchariden und Nukleinsäuren 22-24 abgeleitet ist. ROS dienen als gemeinsame intrazellulären Signal an Ionenkanalfunktion zu regulieren, Protein-Kinase / Phosphatase-Aktivierung und Genexpression, aber eine übermäßige oder unregulierte Produktion beitragen kann, den apoptotischen und nekrotischen Zelltod, Neurodegeneration, Atherosklerose, Diabetes und Krebs 24,25. Superoxid, einem Vorläufer für andere Formen von ROS, kann als Nebenprodukt der mitochondrialen Atmung erzeugt werden, wenn Elektronen austreten vom Elektronenübertragungskette. Frühere Studien vorgeschlagen, dass zyklische mechanische Dehnung stimuliert die Produktion von Super-Oxid durch eine Kombination des NADPH-Oxidase-System (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase) und der mitochondrialen Elektronentransportkette (Komplex I und III). Es wurde vorgeschlagen, dass diese Stimulation wurde durch eine direkte Verformung der Mitochondrien 21 möglicherweise aufgrund der Verbindungen zu der Zelle Zytoskeletts. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Zellstreckvorrichtung entwickelt, so dass wir Bildänderungen in ROS-Produktion in lebenden Zellen in Reaktion auf mechanische Dehnung. Hier wurde die mitochondriale ROS von bronchialen Epithelzellen dank Stretch erzeugt das benutzerdefinierte Gerät und Protokoll gemessen. In Abwesenheit von mechanischen Dehnung, die ROS-Produktion nicht wesentlich über 60 min (Figur 4) zu erhöhen. Wenn ein einzelnes 17% Dehnung wurde aufgebracht und gehalten wird, gibt es einen Anstieg der mitochondrialen ROS, die für weitere 60 min beibehalten.
Direkter Epithelial Monolayer Schäden durch Stretch
2 diskutiert. Mehrere Studien zeigen, dass übermäßige mechanische Strecke von Lungenepithelzellen können direkte Verletzungen mit Schäden an Zellen 11,13,26,27 verursachen. Diese Art von Schäden ist schwierig, während der mechanischen Ausdehnung ohne Echtzeit-Bildgebung zu erfassen. Als solche unter Verwendung des angepassten Geräte und Phasenkontrastmikroskopie aufeinanderfolgenden Bildern von Zellen, mechanisch gestreckt wurden, bevor aufgezeichnet und nach Behandlung mit einem pro-inflammatorischen Zytokins (50 ng / ml TNF-α für 6 Stunden) (Abbildung 5). Bilder von der gleichen Bereich der Zellen wurden bei zunehmender Belastung Ebenen erfasst. Die Aufnahmen zeigen die Ausbildung eines Spaltes, wenn die Zellen zwischen 10 und 15% Dehnung gedehnt, wie durch die roten Pfeile angedeutet. Es ist wichtig, zwischen dem Ende des stretc beachten, dass diese Bilder in Echtzeit erfasst, <10 sec Nachhangwinkel h und Bildgebung, während die Zellen wurden gestreckt. In früheren Untersuchungen von Zellenabbildungs verstreckter Zellen wurden Bilder vor und nach dem Strecken vergleicht nur die Bilder von Zellen nicht gedehnten Zustand 11,13,28 erhalten.
AFM Nano-Eindruck auf gestreckten Zellen
Die mechanische Einrichtung in den AFM mit der Verwendung einer Adapterplatte (siehe 6A). Verwendung von zuvor veröffentlichten Verfahren 13, ein Elastizitätsmodul Karten (E-Karten) von MLE12 Zellen vor und nach 10% Dehnung erhalten wurden (6D-E). Obwohl Phasenkontrastbild bei 10% Dehnung (6D) wurde innerhalb von 10 Sekunden von der Strecke erhalten, die E-Karten in 6D-E gezeigt, verbraucht etwa 22 min mit 300 Einzel Kraft-Weg-Kurven über einen 40 & mgr; m × 40 & mgr; m aufgezeichnet Bereich mit einer 2,5 & mgr; m / s Geschwindigkeit der Spitze in der Z-Richtung.om / files / ftp_upload / 52.737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 1. Die kundenspezifische Einrichtung zur Zellkultur und Stretching. (A) Computer-generierte Zeichnung der mechanischen Konstruktion der Vorrichtung, (B) Lichtbild der fertigen Vorrichtung, (C) Photographie Vorrichtung an den Motor und die lineare Treiber, der die Motordrehung in eine 1-dimensionale Bewegung umwandelt welcher steuert die Klemme biaxialen Dehnung des (D) Silikon-Gummi-Membran. Das Substrat enthält zwei Löcher an jeder Klemme Registerkarte, auf Beiträge zu jeder Klemme gelegt werden. (E) Dimensioned FEA-Modell der flexiblen Membran, ist ein Viertel der gesamten Struktur durch die Verwendung von symmetrischen Randbedingungen. (
Abbildung 2. (A) Das Gerät unterstützt eine flexible Membran mit Markierungen aufgebracht, um aufgebrachte Dehnungsmessung gezeigt. Nahaufnahmen der Markierungen vor (B) und nach (C) Dehnung wurden mit einem Pfeil markiert ist, um deutlich die Verschiebung der Markierungen auf der Membran. (D) Membrane Belastung in Abhängigkeit von der Motor zählt beim An- und Abfahren. Membran-Stamm war in beiden An- und Abfahren mit Rückzug Herstellung etwas höheren Belastungen. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Membrandehnungsübertragung zu den Zellen. (A - B) Phasenkontrast-Aufnahmen der humanen bronchialen Epithelzellen (16HBE) auf der flexiblen Membran mit einem 10X-Objektiv, vor (A) und nach (B) 20% Dehnung. (C - D) fluoreszenzmarkierte (DAPI) Kerne der 16HBE Zellen wurden unter Verwendung eines 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop, bevor (C) und nach (D) 20% Dehnung abgebildet. (E) Die Membran-Stamm von Zellen erlebte, war linear und homogen.t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Auswirkungen einer einzelnen Strecke auf der ROS-Produktion von 16HBE Zellen wurde unter Verwendung einer kumulativen mitochondrialen Superoxid-Sensor mit einem 20x-Objektiv unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet (A - C). Momentaufnahmen des Zeitverlaufs (0, 60 min, und ~ 65 min) von Superoxid-Produktion während der Strecke in dem selben Gebiet von Zellen. (D) Relative Fluoreszenzintensität 16HBE Zellen über die Zeit, die eine 50% ige Erhöhung der Fluoreszenzintensität von der Grundlinie Produktion von Superoxid innerhalb der ersten Stunde (A zu B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Phasenkontrastaufnahmen eines Alveolarepithelzellen (MLE12) Mono Reaktion auf die zunehmende Ausdehnung (A - D). Wurden alle aufgezeichnet unter Verwendung eines Digital-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv. Die Pfeile zeigen die Orte, an denen Zell-zu-Zell-Trennung aufgetreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. (A) Mechanisches Gerät in der AFM für Nano-Eindruck von Zellen mit Stretch gezeigt. Muss der Scanner für die Platzierung von Ziel extender entfernt werden. Drei Bein Extender werden auf alle drei Beine des AFM Kopf befestigt, um zum Gerät zu ermöglichenPlatzierung. Eine Adapterplatte verwendet wird, um die Trage auf den AFM-Scanner (schwarze Platte) zu montieren. Der Auslegerarm Abtastungen in der Richtung des in der vor der Streckphasenkontrastbild ein MLE12 Zelle (B) dargestellten Pfeils. Die roten Quadrate in der vor (B) und nach (C) Stretch Bilder zeigen den Bereich, der während der Nano-Eindruck (40X-Objektiv) gefangen genommen wurde. Der Elastizitätsmodul Karten, bevor (D) und nach (E) strecken, werden mit bisher veröffentlichten Analysetechniken 13 erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein einzigartiges Gerät für Live Cell Imaging bei mechanischer Dehnung entwickelt; und diese Vorrichtung wurde in einem Protokoll zum Lungen Epithelzellen Mechanobiologie studieren. In Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass eine einzige statt Streck stimuliert die Produktion von Superoxid in mitochondrialen bronchiale Epithelzellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erhöhte mechanische Belastung verursacht direkte Beschädigung der Integrität einer Monoschicht von alveolären Epithelzellen.
Diese Vorversuche durchzuführen, wurde die Vorrichtung zuerst kalibriert, und dann wurde es gezeigt, dass die Membran-Stamm wurde zu den Zellen (Abbildungen 2-3) übertragen werden. Insgesamt ist die Vorrichtung auch durchgeführt werden, wie durch die enge Korrelation zwischen der in 3E gezeigten Membran-Stamm (mit den Markierungen auf der Membran gemessen) und die Zelllinie (durch die Abstände zwischen den Kernen gemessen) angegeben. Allerdings gab es einige zwischen stra beobachteten kleinen Unterschiedegemessen an den Membranen während der Ansatz und die Rückkurven der Markierer, wie in 2D gezeigt. Dies war wahrscheinlich auf die in der Vorrichtung spielfrei und möglicherweise mit der Greifprobleme. Darüber hinaus wird eine universelle Montagemechanismus für die Vorrichtung benötigt, so dass sie effizient auf Mikroskope mit verschiedenen Konfigurationen verwendet werden. Dies würde die Zeit zwischen Positionierung der Vorrichtung und Bildaufnahme ausgegeben und gleichzeitig eine stabile Verbindung mit dem Mikroskop zu reduzieren. Löcher in den Membranen ausgestanzt wurden verwendet, um eine kleine Vorbelastung auf die Membran anzuwenden, um die Bildung einer anfänglichen Kompressionszustand aufgrund Klemm aus einem elastischen Material zu verhindern. Die Druckzustand führt auch zu einer Reduzierung der maximal anwendbaren Belastung.
Die individuelle Einrichtung wurde entwickelt, um in einem Asyl MFP3D-Rasterkraftmikroskop passt zu Nano-Eindruck lebender Zellen bei der mechanischen Strecke ermöglichen. Wir sind keine Kenntnis von einem anderen Gerät, das in der Lage ist, inlisch isotropen Spannungszustand in der Bildebene, die innerhalb eines AFM funktionieren kann. Die Vorrichtung wurde auch für den Dauereinsatz in einem Zellkulturbrutschränken (bei 37 ° C in einer feuchten, sterilen Umgebung mit 5% CO 2). Die Fähigkeit, in einem Inkubator-Funktion ermöglicht die Untersuchung von Zellen, die eine langfristige Strecke Regimen.
Es gibt einige Einschränkungen bei der vorgestellte Ansatz. Zunächst wird, wie die Membranabschnitte der Bereich der Markierung kann man aus der Ebene heraus, wenn auch minimal (~ 100 & mgr; m). Dies wird zu einer Einschränkung bei der Verfolgung ein Feld von Zellen durch einen Stretch-Regime, da das Sichtfeld im Laufe der Membran Ausdehnung ändert. Auch wenn innerhalb der Membran 22 mm Durchmesser erfährt 0,23-0,25 Stamm, die Bereiche außerhalb des Innendurchmessers Erfahrung eine variable Spannungsfeld. Obwohl bildgebende Verfahren werden einfach auf diesem zentralen Bereich beschränkt ist, ist es möglich, dass die Zellen, die auf höheren Belastungenan äußeren Bereichen kann Einfluss auf die Reaktion der Zellen innerhalb des Zentralbereichs. Eine gleichmäßige Spannungsverteilung über einen größeren Bereich von Interesse kann durch Verbesserungen in der Membrandesign erreicht werden. Die PDMS Membran Autofluoreszenzwellenlänge üblicherweise für fluoreszierende Indikatoren verwendet werden, und dies begrenzt die Fähigkeit zur Abbildung von Fluoreszenz in Zellen, die von unterhalb der Membran. Aus diesem Grund wurde ein aufrechtes Mikroskop mit Wasserimmersionsobjektive in unseren Studien der ROS-Produktion oben beschrieben verwendet. Dies kann eine Einschränkung für Studien, in denen AFM und Fluoreszenz-Bildgebung kombiniert werden können.
Das häufigste kommerzielle Vorrichtung (Flexcell FX 5000 Zugstangensystem) zum Anlegen mechanischer Belastung auf Zellen enthält einen steuerbaren Vakuumsystem Anwendung Zugbelastung auf einer Membran während der Bewegung in die und aus der optischen Ebene. Die Membran und Klemmenkonstruktion hier präsentierten erstellen Sie einen zweiachsigen Dehnungsfeld in dem Stamm isotrop ist und bleibt in der Ebene allowing eine Echtzeitabbildung. Mit geringfügigen Änderungen an der Membran-Design kann die Trage einachsigen Streckschwingungen als auch zu produzieren. Wenn die Zellen zuerst auf einem ausgedehnten Membran ausgesät, in der Ebene liegende Druckbelastung kann auch angewendet werden. Das Gerät ist in der Lage, sowohl physiologische und pathologische Mengen an Dehnung zu erreichen. Zusammenfassend wurde eine neue Vorrichtung und Protokolle entwickelt, die verwendet werden können, um mechanische Spannung anzuwenden, um Zellen, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und AFM Nanoindentierung abgebildet werden kann leben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten, dass Fedex Institute of Technology an der Universität von Memphis danken für ihre Unterstützung. Die Autoren bedanken sich bei Studenten der Senior Design-Projekt-Gruppe in der Maschinenbau-Abteilung an der Universität von Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) anerkennen, Daniel Kohn von der Universität von Memphis Engineering Technology-Abteilung für die Motorsteuerung und Dr. Bin Teng und Frau Charlean Luellen für ihre Hilfe in der Zellkultur. Diese Arbeit wurde von K01 HL120912 (ER) und R01 HL123540 (CMW) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5" x 5.25" x 0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
