Summary
生理学と形態がリンクされている方法を解明することは、植物の葉のメカニズムの機能をより深く理解することができます。私たちは、伝統的な機能の葉形質と気孔コンダクタンスの測定値との相関関係から気孔規制のパラメータを導出するための手順の両方を提示します。
Abstract
彼らはそのような蒸散と炭素同化などの生理学的機能を反映するため、葉の機能特性が重要です。具体的には、形態学的形質の葉は、成長パターン及び栄養利用、水利用効率の観点から、植物戦略を要約する可能性があります。葉の経済スペクトル（LES）は、機能植物生態学における認識のフレームワークであり、（特定の葉面積（SLA）、葉の窒素、リン、陽イオン含有量を増加し、葉の乾物含量（LDMC）と炭素窒素比を低下させる勾配を反映していますCN）。 LESは、葉の質量あたりの光合成能力と短命の葉のことから、低質量系炭素同化率と長寿命の葉に至るまで様々な戦略について説明します。しかし、LESに含まれていない形質は、このような気孔制御に関連するものとして、種の生理機能に関する追加情報を提供することがあります。プロトコルは、葉の広い範囲のために提示されていfunctioLESの特性だけでなく、LESとは独立した形質を含む最終的形質。具体的には、新しい方法は、蒸気圧の赤字に気孔コンダクタンスの工場 '調節行動に関するものが導入されます。気孔調節の結果として得られるパラメータは、LES及び他の植物の機能的特性と比較することができます。結果は、LESの機能葉の形質は気孔規制のパラメータにも有効な予測因子であったことを示しています。例えば、葉の炭素濃度は、屈曲及びコンダクタンスVPD曲線の最大の点で蒸気圧不足（VPD）に積極的に関連していました。しかし、LESに含まれていない形質は気孔制御のパラメータを説明する際に情報を追加しました：コンダクタンス-VPD曲線の変曲点でのVPDは、より高い気孔密度と高い気孔指数を有する種のために低かったです。全体的に、気孔および静脈形質は気孔規制トンを説明するためのより強力な予測因子でしたLESで使用漢特性。
Introduction
植物の葉の機能の理解を進めるために、多くの最近の研究は、葉の気孔コンダクタンス（GのS）1-4のような生理的反応、形態学的に、解剖学的および化学葉の形質に関連することを試みてきました。また、葉の形質に、気孔コンダクタンスが強く、このような光合成有効光量子束密度、空気の温度とVPD 5のような環境条件によって影響されます。主にVPD 6のGSの線形回帰に基づいているVPD曲線6-8 -様々な方法がGSをモデル化するために提案されています。これとは対照的に、本 研究で提示したモデルは、VPDに（最大気孔コンダクタンスG SMAXにG Sのすなわち、比率）の相対的な気孔コンダクタンスのlogitsを退行し、二次回帰の用語としてVPDを追加することにより、非直線性を占めています。
他のモデルと比較して、新しいモデルが記述するパラメータを導出することができますG Sは水不足の下でダウンレギュレートされたVPD。同様に、VPDがG Sが最大となるで得られます。そのような生理学的パラメータは、LESに反映されるようにしっかりと炭素同化9,10栄養や資源配分にこれらのモデルパラメータとキー葉形質との間の密接なリンクにリンクすることが期待できるとして3,11期待されるべきです。その結果、またLES形質を持つ気孔規制の戦略との間に密接な関係があるはずです。このような関係は、双方のLESおよび水利用効率12,13と相関している葉の習慣として（常緑対落葉）の葉の習慣のために特に期待されています。エバーグリーン種は遅く成長する傾向があるが、栄養分14の貧しい環境でより効率的です。このように、葉の習慣が落葉の種よりも保守的な水利用戦略で、気孔規制パターンが異なるに変換する必要があります。
コンプ共通の庭の状況で広葉樹の種の大規模なセットをARING、次の仮説を試験した：G Sからの1）モデルのパラメータは- VPDモデルは、葉の経済スペクトルに関連した葉の形質に接続されています。 2）エバーグリーン種は落葉種よりも低い平均G SおよびG SMAXの値を持ちます。
Protocol
1.気孔コンダクタンス
- 気孔コンダクタンスの測定
注：定常状態ポロメーター（十角形SC1）の単純型を利用した作者。ポロメーターのデザインは、小型、直感的な手動操作と信頼性が高いという利点があります。フィールド内の気孔コンダクタンスを測定する場合、最も効率的なことができると繰り返し測定サイクルについて測定し、個人間の距離を最小化するようにしてください。 - 再現性のパターンに応じて異なる種や個人の葉（;太陽や日陰の葉など 、可能な場合のみ、同じノードから、ただ一つのカテゴリから同じ高さ、同じ露出、プラント内の同じ位置に、）を選択します。
- 唯一の対策は、健康、非損傷を受け、完全に開発された状態で残します。繰り返し測定が同じ葉の上で行われることを保証するために、（ケーブルタイや色のテープで、例えば ）個人に葉をマーク。
注：Measur気孔コンダクタンスのementsは中肋と強力な葉脈を避けながら、唯一の葉の表面になされるべきです。 - 気孔コンダクタンスの値は正午に明確な減少を示すまで、5〜10を繰り返し測定を行う日の出前に早朝の時間で測定を開始します。
注：測定の毎日のコースでは、VPDと気孔コンダクタンスの関係を分析するための良好なデータをお届けします。
- 唯一の対策は、健康、非損傷を受け、完全に開発された状態で残します。繰り返し測定が同じ葉の上で行われることを保証するために、（ケーブルタイや色のテープで、例えば ）個人に葉をマーク。
- VPD測定
- 好ましくは、ポータブルロガー各G Sを測定 、記録温度と相対湿度と直接同じリーフの位置の状態を測定します。蒸気圧赤字は8月、ロシュマグナス式15を使用して計算するため。
E、S =飽和水蒸気圧[ヘクトパスカル]
- モデルのG S - VPD応答
- 今種ごとに1つの分析に、個々の葉のすべての毎日のコースを組み合わせ、種ごとのVPDに対するすべてのG Sデータをプロットします。最大値を検索することにより、気孔コンダクタンスデータから観測された最大値を抽出します。 、種ごとの比較のためのモデルをスケーリングその種（G S / G SMAX）のために観察された最大値を通って観測値を分割します。
- それぞれの種について、G Sのlogitsを退行（G S / G SMAX）VPDと二項誤差分布（a、b、および回帰パラメータを表すC）と一般化線形モデルを用いて、VPDの二次項に：
図プロットされた値とG Sに対する当てはめモデルの1例- 。VPD気孔コンダクタンスは、種フウ属のタイワン用の蒸気圧不足の関数としてプロットしました。空のドットが観察された値を表します。 （A）最大気孔コンダクタンス、最大気孔コンダクタンスでVPDと気孔コンダクタンスが絶対ので、非スケール気孔コンダクタンス（G S）データから抽出された意味。 （B）スケーリング気孔コンダクタンスデータ（G S / G SMAX）の相対パラメータ（充填ドットとして示す）20を抽出するためにプロットしました。再印刷20からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
すべての種のために、図2のすべてのフィットモデル。すべての種のVPD回帰に気孔コンダクタンスデータのモデルグラフ。エバーグリーン種は赤線20で黒線、落葉樹で表されます。 20から許可を得て再印刷します。
注：logitsを使用する代わりに、VPDに直接G Sを回帰は、グラムSMAXを超えない最大値をモデル化する点につながり、そのG Sが高いVPDで0に近づきます。
- すべての種のための気孔規制のパラメータを抽出
- 絶対モデル化されたG SMAX値 （ 図1Bの MaxFit）を計算します。これを行うには、VPD gsMaxFit = -b / 2aに与えるゼロに1.4.2の一次導関数を、設定から最大気孔コンダクタンスでVPDを計算します。 1.4.2の式にVPD gsMaxFitを挿入し、MaxFitを取得するために、電子のパワーに上げます。 Mを計算します種ごとのすべてのコンダクタンス測定のEAN（ 図1Aを参照）。
注：使用統計ソフトウェアR（http://www.r-project.org）。 - モデルの最大値（MaxFit）及び（2）VPDで（1）気孔コンダクタンスとVPD：スケールモデルからの相対値を、（G S / G SMAX）、気孔コンダクタンスとVPD値以下の2点を抽出する計算するには曲線の変曲の第二の時点で（ 図1B参照 ）。これらの点の絶対G Sの値を取得するためにグラムSMAXすることによって、これらの値を乗算します。分析した全39種の単一モデルの完全なオーバーレイについては、図2を参照してください。
- 絶対モデル化されたG SMAX値 （ 図1Bの MaxFit）を計算します。これを行うには、VPD gsMaxFit = -b / 2aに与えるゼロに1.4.2の一次導関数を、設定から最大気孔コンダクタンスでVPDを計算します。 1.4.2の式にVPD gsMaxFitを挿入し、MaxFitを取得するために、電子のパワーに上げます。 Mを計算します種ごとのすべてのコンダクタンス測定のEAN（ 図1Aを参照）。
気孔特性の測定2。
- 気孔コンダクタンスの測定に使用されている全く同じ葉から好ましくはサンプルを取ります。これが不可能な場合、葉を選択するために適用された同一の選択手順を適用します気孔コンダクタンスを測定するため、好ましくは、同一個人に。
- 新鮮なサンプルに（テスト違うが、いくつかは他よりも適しています）無色、素早く乾燥マニキュアの薄い層を適用します。サンプルは、すぐに処理できない場合は、70％アルコールに保存。マニキュアが出て乾燥した後、そっと葉からの印象をはがし、通常の葉のサンプルと同様に、顕微鏡分析のために進んでください。
注：1の酢酸溶液と酸素、過酸化物、より良い結果をもたらすことができる：水酸化ナトリウムまたは1を適用する前のステップが高いトリコーム密度の葉の場合。 - 光学顕微鏡分析
- 400Xに40Xの間に倍の可能な光学顕微鏡にカメラを接続します。カメラを顕微鏡に接続された後、スケールの助けを借りて、例えば 、画像の光学倍率と解像度に撮影した画像と一致しています。
- オープンソースの私を採用ImageJの16のような魔術師処理ソフトウェアは、これらの写真を分析します。
- いいえ汚れ、親指プリント、損傷領域、または大規模な葉脈を持つ領域の画像上の画像解析ツールからシェイプツールで形状を描画します。この領域で、サンプルあたり少なくとも50,000 平方 μmの合計で気孔をカウントします。
- 気孔孔辺細胞の長さと細孔の長さを測定します。 1mm 2当たり気孔の数を計算します。 1mm 2当たりの細胞数を表皮する気孔密度の比として気孔指数を計算します。
葉脈形質の3評価
注：葉脈の特性を評価するために、サック＆Scoffoni 17から修正されたプロトコルを用いました。
- 試料調製
注：葉脈の可視性を最適化するために、葉が最初に漂白した後、サフラニンとマラカイトグリーンで染色されています。- LEAVを漂白しますES、消色剤の50％溶液中で少なくとも72時間それらを残す（テスト違う、再びいくつかの良い仕事かもしれません）。あるいは、5％NaOH溶液、または10％のKOH水溶液または25％H 2 O 2溶液を使用します。
- 30℃にソリューションを加熱したり、より良い効果のためのステップ3.1.1からさまざまなソリューションを組み合わせます。その後水で数回洗浄します。その葉の特性に応じて、特定の種のための漂白工程を適応させます。
注：厚い葉は液槽およびまたはより積極的なソリューションの長い期間が必要な場合があります。シンナー、より柔らかい葉未満72時間で満足度に漂白することができます。 - 葉は100％エタノールの中に置いて着色します。 1％サフラニン液に30分 - 2のためにそれらを色です。着色を強化するために、わずか数秒間1％マラカイトグリーン溶液でさらに処理を追加します。最適な結果を達成するためのタイミングと強度の面ですべての種にプロトコルを適応させます。 SEをすすぎますその後水でveral回。葉は深く染色する場合は、エタノールまたは脱色剤でいくつかの時間が役立つことがあります。
- 試料分析
- 約 1200 720dpiの解像度でバックライトスキャナと葉をスキャンします。そのピクセルの長さが戻ってスキャンした葉の絶対長さ対策にさかのぼることができる保証するために、スケールの助けを借りて、例えば 、画像の解像度に撮影したスキャンを合わせてください。
- 葉の面積、外周、長さと幅を測定します。いくつかの指標、 例えば、長さ/幅と円周2 /面積を計算します。絵の真ん中から1 1 CMで長方形をカットします。 （主なミドル静脈を含まない）は、第1および第2オーダーの静脈の直径を測定します。この方形（静脈密度）の最初のオーダーのすべての静脈の長さを測定します。
他の葉形質の4評価
注：このような特定などアス典型的な葉の形質葉面積（SLA）、葉の乾燥物含有量（LDMC）、葉面積、要素内容、葉の習慣、葉の羽状組織、葉の化合物の種類、リーフマージンタイプなど確立したプロトコル18,19以下。
- 観測の葉の形質
- 葉羽状組織、葉の化合物の種類、リーフマージンタイプとフィールドでの観察を通して花外蜜腺18,19の存在を評価します。
- 分析葉の形質
- 比葉面積（SLA）の決意、葉面積と葉乾物含量（LDMC）18,19のために、好ましくは、他の測定に使用したのと同じ人に、新鮮な葉のサンプルを収集します。 80℃の乾燥オーブン中で48時間後に、好ましくは同じ葉に、要素の内容および比率を測定します。
Representative Results
気孔コンダクタンスと気孔調節の多くのパラメータは、形態学的解剖学的および化学的な葉形質に関連することが見出されました。以下では、焦点は気孔密度（P = 0.04）と気孔率（P = 0.03）で減少し、 図を参照してください 、葉の炭素含有量（P = 0.02に増加した変曲点、でVPDへのリンクになります3）。結果は、VPDの減少に伴って変曲点で気孔密度と気孔指数の低下があったことを示しています。これとは対照的に、気孔コンダクタンスのないパラメータは、葉の習慣に明確な関係は認められませんでした。葉の習慣の二つのグループ内の高変動は異なる調節機構は常緑と落葉の習慣のグループ内の両方を存在することを示しています。
番目の図3.結果図気孔コンダクタンスの規制や葉形質のパターン間の電子リンク蒸気圧の赤字（VPD）G Sの変曲点で- 。（A）気孔密度、（B）気孔指数の関数としてVPD曲線（VpdPoi）、および（C）葉の炭素含有量20。再印刷20からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
本論文で提示された方法により抽出された気孔規制のパラメータは、気孔密度と気孔指標として気孔特性の重要性を強調する。これらの新規な関係は、解剖学的および化学的な葉が20を形質、形態学的に生理的なモデルからのパラメータをリンクの可能性を示します。他の方法に比べ、本発明の方法は、気孔コンダクタンスをモデル化し、G の最大値の半分にダウンレギュレートされたユニークかつ明確なVPD値を捕捉するという利点を有します。
プロトコールに記載されているすべての手順の最も重要なものは、気孔コンダクタンスの測定値です。気孔コンダクタンスの周囲の天候条件の多因子調節にG Sに強い影響力を持っています。高い相対湿度と低照度での気孔コンダクタンスの測定は、21〜23信頼できない場合があります。形態学的およびアナトに関してomical形質は、プロトコルは常に研究に含まれる標的種に適合させる必要があります。静脈密度解析で特に、葉の漂白や染色の持続時間は、葉の構造と靭性に応じて、変化させることが必要があります。この方法の潜在的な制限は、気孔コンダクタンスの測定は不可能であるか又は複雑で異常な葉の形のためにエラーが発生しがちであるために種を含みます。これは、非常に狭い葉身と針葉樹や草を含んでもよいです。
我々の結果は、部分的に気孔コンダクタンス・パラメータおよび他のいくつかの研究に対応する葉経済スペクトル（LES）の葉の形質との間のリンクの最初の仮説を確認します。例えば、PoorterとBongers（2006）24は、G、SおよびG Sが増加葉の寿命を減少させながら、例えば LES、によって表される特性との間の密接なリンクを報告しました。したがって、シュルツら（1994）1 demonst葉の窒素含有量とg SMAXとの間に明確なリンクを評価しました。同様に、Juhrbandt ら（2004）25グラムSMAXと葉面積と葉の窒素含有率との間に有意な関係を発見しました。
葉の習慣に関して明確な違いの2つめの仮説は確認できませんでした。常緑と落葉の習慣内の測定されたパラメータと特性の高い変動は、リーフ習慣がLESの良い記述子ではありませんことを示しています。 Brodribbとホルブルック（2005）26は、広い特性変化が葉の習慣のすべてのタイプでは一般的であるため、葉の習慣と葉の生理的戦略は必然的に接続されていないことを議論しました。
アプローチは、特定の木部透水係数と顕微鏡木材は27を形質など木部の油圧に関連形質に例えば、形質および葉以外の植物器官の生理学的特徴に拡張することができます。同様に、他のこのような柵状柔構造とエピクチクラワックス層構造として顕微鏡由来として葉の形質の種類は28を含めることができます。
要約すると、本研究では、LESと気孔調節との間の密接な関係を確認しました。また、ここで紹介する方法は、LESに関連していない気孔規制パターンの側面を明らかにしました。このような気孔の大きさ、密度、インデックスだけでなく、静脈長として特に特定の葉の形質には機能的な植物の研究に今後注目に値します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC 1 Porometer | Decagon | Any other porometer is suitable | |
| Cable ties to mark leaves | |||
| Plastic sample bags | |||
| Paper sample bags | |||
| Hygrometer | Trotec | Any other is suitable | |
| Nail polish | |||
| Axioskop 2 plus | Zeiss | Any other is suitable | |
| Ethanol | |||
| Bleach | |||
| 5% NaOH | |||
| 10% KOH | |||
| 25% H2O2 | |||
| Malachite green | |||
| Safranine |
References
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