Summary
Rakne hvordan fysiologi og morfologi er knyttet tillater en dypere forståelse av mekanistisk funksjon av plante blader. Vi presenterer både en prosedyre for å avlede parametere av stomatal regulering fra stomatal konduktansmålingene og korrelasjoner med tradisjonelle funksjonelle blad trekk.
Abstract
Leaf funksjonelle egenskaper er viktige fordi de reflekterer fysiologiske funksjoner, som for eksempel tran og karbon assimilering. Spesielt morfologiske blad egenskaper har potensial til å oppsummere planter strategier i form av vann bruk effektivitet, vekstmønster og næringsbruk. Bladet økonomi spektrum (LES) er en anerkjent rammeverk i funksjonell anlegg økologi og reflekterer en gradient av økende spesifikk bladområde (SLA), blad nitrogen, fosfor og kation-innhold, og avtagende bladtørrstoffinnhold (LDMC) og karbon-nitrogen-forhold ( CN). LES beskriver ulike strategier som spenner fra det av kortvarige blader med høy fotokapasitet per blad masse til langlivede blader med lav masse basert karbon assimilering priser. Men kanskje egenskaper som ikke er inkludert i den LES gi ytterligere informasjon om artens fysiologi, slik som de som er knyttet til stomatal kontroll. Protokoller presenteres for et bredt spekter av blad functioelle egenskaper, herunder trekk av LES, men også egenskaper som er uavhengig av LES. Spesielt er en ny metode innført som gjelder plantenes regulerende atferd i stomatal konduktans til damptrykk underskudd. De resulterende parametre for stomatal regulering kan deretter sammenlignes med LES og andre plante funksjonelle egenskaper. Resultatene viser at funksjonelle blad trekk av nevnte LES ble også gyldige prediktorene for parametrene i stomatal regulering. For eksempel, blad carbon-konsentrasjonen var positivt relatert til trykkdampunderskudd (VPD) ved punktet for bøyning og maksimum av den konduktans-VPD kurve. Men egenskaper som ikke er inkludert i LES lagt til informasjon i å forklare parametre for stomatal kontroll: vpd på det punktet av bøyning av ledningsevne-vpd kurven var lavere for arter med høyere stomatal tetthet og høyere stomatal indeksen. Totalt sett stomata og vene trekk var kraftigere prediktorer for å forklare stomatal regulering tHan egenskaper som brukes i LES.
Introduction
Å fremme funksjonell forståelse av plante blader, har mange nyere studier har forsøkt å forholde morfologisk, anatomisk og kjemisk blad trekk til fysiologiske responser, som for eksempel blad stomatal ledningsevne (g S) 1-4. I tillegg til blad trekk, stomatal ledningsevne er sterkt påvirket av miljøforhold, for eksempel photosynthetically aktiv foton flukstetthet, lufttemperatur og vpd 5. Ulike måter har vært foreslått å modellere gs - VPD kurver 6-8 som hovedsakelig er basert på lineær regresjon av gs på vpd 6. I motsetning til dette, den modell som presenteres i denne undersøkelse går tilbake til logits med relativ stomatal ledningsevne (dvs. forholdet mellom g S til maksimum stomatal konduktans g SMAX) på vpd og står for ikke-linearitet ved å legge vpd som en kvadratisk regressor sikt.
Sammenlignet med andre modeller, tillater ny modell for å utlede parametere som beskriverVPD hvor g S er nedregulert under vann mangel. Tilsvarende er vpd oppnås ved hvilken g S er maksimal. Som slike fysiologiske parametre kan forventes å være tett knyttet til karbon assimilering 9,10 nær sammenheng mellom disse modellparametere og nøkkel blad trekk til næringsstoff og ressursfordeling som reflekteres i LES bør forventes 3,11. Følgelig bør det også være en tett forhold mellom strategier for stomatal regulering med Les trekk. Et slikt forhold er særlig for blad vane (evig versus løvskog) som leaf vane er både korrelert med LES og med bruk av vann effektivitet 12,13. Evergreen art har en tendens til å vokse langsommere, men er mer effektive i miljøer næringsfattig 14. Derfor bør blad vane sette til ulike stomatal regulering mønstre, med en mer konservativ bruk av vann strategi enn løvfellende arter.
Comparing et stort sett av løvtrær arter i en felles hage situasjon, ble følgende hypoteser testes: 1) Modell parametere fra g S - VPD modeller er koblet til blad trekk knyttet til bladet økonomi spekteret. 2) Evergreen arter har lavere gjennomsnittlig g S og g Smaks verdier enn løvfellende arter.
Protocol
1. stomatal Conductance
- Målinger av stomatal ledningsevne
MERK: Forfatterne benyttet seg av en enkel type steady state porometer (Tikant SC1). Den porometer design har fordelen av liten størrelse, intuitiv manuell betjening og høy pålitelighet. Ved måling stomatal ledningsevne i felten, må du sørge for å minimere avstanden mellom målt individer for en gjentatt måling syklus for å være mest mulig effektiv. - Velg blader av ulike arter og individer i henhold til en reproduserbar mønster (samme høyde, samme eksponering, samme posisjon i anlegget, om mulig bare fra samme node, og bare fra én kategori, sol eller skygge blader, etc.).
- Eneste tiltaket blader i friske, ikke-skadet og fullt utviklet tilstand. Marker bladene på enkeltpersoner (f.eks med strips eller farge tape), for å sikre at de gjentatte målingene er gjort på samme blad.
MERK: Måltements av stomatal ledningsevne bør gjøres bare på bladet overflaten samtidig unngå midrib og sterke blad årer. - Starte målinger i de tidlige morgentimer før soloppgang tar fem til ti gjentatte målinger før stomatal ledningsevne verdier viser en klar nedgang på formiddagen.
MERK: En daglig løpet av målingene vil levere gode data for å analysere forholdet mellom vpd og stomatal ledningsevne.
- Eneste tiltaket blader i friske, ikke-skadet og fullt utviklet tilstand. Marker bladene på enkeltpersoner (f.eks med strips eller farge tape), for å sikre at de gjentatte målingene er gjort på samme blad.
- VPD målinger
- Med hver g S måling, registrering temperatur og relativ fuktighet, fortrinnsvis med bærbare loggere for direkte å måle forholdene på stilling av det samme blad. For beregning av damptrykk underskuddet bruke August-Roche Magnus formel 15.
e r = metningsvanndamptrykket [hPa]
- Modell g S - vpd svar
- Nå tegner arts kloke alle g S data mot vpd, som kombinerer alle daglige kurs av enkelte blader i en analyse per arter. Pakk den maksimale verdien observert fra stomatal konduktans data ved å søke etter maksimumsverdien. Å skalere modellen for arts kloke sammenlignbarhet, dele de observerte verdiene gjennom den maksimale verdien observert for at arter (g S / g SMAX).
- For hver art, regress de logits av g S (g S / g SMAX) til vpd og kvadratisk løpetid vpd bruke en generalisert lineær modell med en binomial feilfordeling (a, b og c representerer regresjonsparametrene):
Figur 1. Eksempel på de plottede verdiene og den tilpassede modellen for g S -. Vpd stomatal konduktans plottet som en funksjon av damptrykket underskudd for arten Liquidambar formosana. Tomme prikker representerer de observerte verdiene. (A) Maksimal stomatal ledningsevne ble vpd ved maksimal stomatal ledningsevne og mener stomatal konduktans hentet fra den absolutte dermed ikke-skalert stomatal ledningsevne (g S) data. (B) Skalert stomatal ledningsevne data (g S / g SMAX) ble plottet til å trekke ut de relative parametere (vist som fylte prikker) 20. Re-print med tillatelse fra 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. All montert modeller for alle arter. Modell grafer for stomatal konduktans data til vpd regresjon for alle arter. Eviggrønne arter er representert med svarte linjer, løvfellende arter av røde linjer 20. Re-print med tillatelse fra 20.
MERK: Bruke logits stedet for tilbakegang g S direkte til vpd, fører til det punktet at modellert maksimumsverdiene overstiger ikke g SMAX og at g S nærmer seg 0 på høy vpd.
- Pakk parameter av stomatal regulering for hver art
- Beregne absolutte modellert g Smaks verdier (MaxFit i figur 1B). For å gjøre dette, beregne vpd ved maksimal stomatal konduktans fra å sette den første deriverte av 1.4.2 til null, noe som gir vpd gsMaxFit = -b / 2a. Sett vpd gsMaxFit inn i formelen for 1.4.2 og heve til kraften i e å skaffe MaxFit. Beregn mean av konduktansforandringer målinger pr art (se figur 1A).
MERK: Bruk statistisk programvare R (http://www.r-project.org). - For å beregne relative verdier, fra den skalerte modellen (g S / g Smaks), trekke stomatal ledningsevne og VPD verdier for de følgende to punkter: (1) stomatal ledningsevne og vpd på maksimalt modellen (MaxFit) og (2) vpd på det andre vendepunkt på kurven (se figur 1B). Multipliser disse verdiene etter g SMAX å få absolutte g S verdier for disse punktene. Se figur 2 for en fullstendig overlegg av enkeltmodeller av alle 39 artene.
- Beregne absolutte modellert g Smaks verdier (MaxFit i figur 1B). For å gjøre dette, beregne vpd ved maksimal stomatal konduktans fra å sette den første deriverte av 1.4.2 til null, noe som gir vpd gsMaxFit = -b / 2a. Sett vpd gsMaxFit inn i formelen for 1.4.2 og heve til kraften i e å skaffe MaxFit. Beregn mean av konduktansforandringer målinger pr art (se figur 1A).
2. Målinger av stomatal Traits
- Ta prøver fortrinnsvis fra nøyaktig de samme bladene som har blitt brukt for målingene av stomatal ledningsevne. Dersom dette ikke er mulig, gjelder det samme utvelgelsesprosedyre som ble brukt til å velge bladenefor de stomatal konduktansmålingene, fortrinnsvis på de samme individene.
- Påføre et tynt lag av farveløse, hurtig tørking neglelakk (test forskjellige merker, noen er mer egnet enn andre) til en frisk prøve. Hvis prøvene ikke kan behandles umiddelbart, lagre dem i 70% alkohol. Etter neglelakk har tørket ut, forsiktig skrelle inntrykk av fra bladet og fortsett for mikroskopisk analyse, som med et vanlig blad prøven.
NB: I tilfelle av bladene med høy tetthet trichome et foregående trinn med påføring av natriumhydroksyd eller en 1: 1 løsning av eddiksyre og oksygen peroksyd kan føre til bedre resultater. - Optisk mikroskop analytics
- Koble et kamera til en optisk mikroskop stand til forstørrelser mellom 40X til 400X. Når kameraet er koblet til mikroskopet, samsvarer med de bilder som er tatt i den optiske forstørrelse og oppløsning av bildet, for eksempel, ved hjelp av en skala.
- Ansette åpen kildekode image prosessering programvare som ImageJ 16 analysere disse bildene.
- Tegn en figur med formen verktøyet fra bildet analyseverktøy på bildet i et område uten skitt, tommelen utskrifter, skadede områdene, eller store blad årer. Telle stomata i dette området og i totalt minst 50 000 um 2 per prøve.
- Mål stomatal vakt cellelengden og pore lengde. Beregne antall stomata per mm 2. Beregn stomatal indeksen som forholdet mellom stomatal tetthet til epidermal celle nummer per mm 2.
3. Vurdering av Leaf Vein Traits
MERK: For vurderingen av blad vene trekk, en modifisert en protokoll fra Sack & Scoffoni 17 ble ansatt.
- Prøveopparbeidelse
MERK: For å optimalisere synligheten av bladet årer, er bladene først bleket og deretter farget med safranin og malakittgrønt.- Å bleke leaves, la dem minst 72 timer i 50% løsning av decolorizer (test forskjellige gjør, igjen noen kan fungere bedre). Alternativt kan bruke 5% NaOH-oppløsning eller 10% KOH-oppløsning eller 25% H 2 O 2 løsning.
- Varm løsningen opp til 30 ° C eller kombinere de ulike løsningene fra trinn 3.1.1 for bedre effekter. Skyll flere ganger i vann etterpå. Tilpasse blekeprosessen for de spesifikke arter, avhengig av deres egenskaper blad.
MERK: Tykkere bladene kan trenge lengre perioder av løsningen bad og eller de mer aggressive løsninger. Tynnere og mer ømme blader kan bli bleket til en tilfredsstillende grad i mindre enn 72 timer. - Å farge bladene plassere dem i 100% etanol. Farge dem for 2 - 30 min i 1% safranin løsning. For å forbedre farge, legge til en ekstra behandling med 1% malakittgrønt løsningen bare i noen sekunder. Tilpass protokollen til alle arter i form av timing og intensitet for å oppnå optimale resultater. Skyll seVeral ganger i vann etterpå. Hvis bladene er å dypt farget, kan litt tid i etanol eller decolorizer hjelpe.
- Prøveanalyse
- Skann bladene med en bakgrunnsbelysning skanner med en oppløsning på ca 1200 dpi. Match skanner tatt til oppløsningen på bildet, for eksempel ved hjelp av en skala, for å sikre at pixel lengden kan spores tilbake til absolutte lengde tiltak av det skannede blad.
- Mål-området, omkrets, lengde og bredde av bladene. Beregn flere indekser, for eksempel, lengde / bredde og omkrets 2 / område. Skjær et 1 til 1 cm rektangel ut av midten av bildet. Mål diameteren på venene i første og andre orden (ikke inkluderer hoved midten vene). Mål lengden på alle vener av første orden i dette quadrat (vene tetthet).
4. Vurdering av Andre Leaf Traits
MERK: Asses typiske blad egenskaper som spesifikkbladareal (SLA), blad tørrstoffinnhold (LDMC), bladareal, elementinnhold, blad vane, blad pinnation, blad sammensatte typen, blad margin type etc. følge etablerte protokoller 18,19.
- Observasjons blad trekk
- Vurdere blad pinnation, blad sammensatte typen, blad margin type og tilstedeværelsen av extrafloral nectaries 18,19 gjennom observasjon i felten.
- Analytiske blad trekk
- Samle friske blad prøver, fortrinnsvis på de samme individer som brukes for andre målinger, for bestemmelse av spesifikke bladområde (SLA), bladareal og blad tørrstoffinnhold (LDMC) 18,19. Etter 48 timer i tørkeskap ved 80 ° C, måler elementinnhold og forhold, fortrinnsvis på det samme blad.
Representative Results
Mange parametere av stomatal ledningsevne og stomatal regulering ble funnet å være relatert til morfologisk, anatomisk og kjemiske blad trekk. I det følgende vil fokus være på lenkene for å VPD på vendepunkt, som sank med stomatal tetthet (p = 0,04) og stomatal indeks (p = 0,03) og økt med blad karboninnhold (p = 0,02, se figur 3). Resultatene viser at med avtagende vpd ved vendepunkt var det en nedgang i stomatal tetthet og stomatal indeksen. I kontrast, ingen parameter for stomatal ledningsevne viste en klar sammenheng til blad vane. Den høye variasjon innenfor de to gruppene av blad vane viser at ulike reguleringsmekanismer finnes både innenfor gruppen av eviggrønne og løvfellende blad vaner.
Figur 3. Resultat tall for the koblinger mellom mønstre stomatal ledningsevne regulering og blad trekk Damptrykk underskudd (VPD) ved vendepunkt for g S -. vpd kurve (VpdPoi) som en funksjon av (A) stomata tetthet, (B) stomata indeksen, og (C) 20 blad karboninnhold. Re-print med tillatelse fra 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Parametrene av stomatal regulering utvunnet ved metoden som presenteres i denne artikkelen understreker betydningen av stomatal egenskaper, for eksempel stomata tetthet og stomata indeksen. Disse nye relasjoner demonstrere potensialet i å knytte parametere fra fysiologiske modeller til morfologisk, anatomisk og kjemisk blad trekk 20. Sammenlignet med andre fremgangsmåter, har det overliggende løsning fordelen av å fange en unik og entydig vpd verdi ved hvilken stomatal konduktans blir nedregulert til halvparten av den modellerte g s maksimum.
Av alle trinnene i protokollen de mest kritiske de er målinger av stomatal ledningsevne. På grunn av den multifaktorielle regulering av stomatal vær ledningsevne omgivelsesforhold har en sterk innflytelse på g S. Stomatal konduktansmålingene ved høy luftfuktighet og lav lysintensitet kan være upålitelige 21-23. Med hensyn til morfologiske og anatomical trekk, skal protokollen alltid tilpasses de målartene inkludert i studien. Særlig i analysen vene tetthet, bør varigheten av bleking og farging av bladene bli variert, avhengig av bladstruktur og seighet. Potensielle begrensninger av fremgangsmåten omfatter arter, hvor målinger av stomatal konduktans er umulige eller komplisert og utsatt for feil på grunn av ekstraordinære bladformer. Dette kan inkludere bartrær og gress med svært smale blader.
Våre resultater delvis bekrefte den første hypotese for en kobling mellom stomatal konduktans parametere og blad egenskaper av bladet økonomi spektrum (LES), som svarer til en rekke andre undersøkelser. For eksempel Poorter og Bongers (2006) 24 rapporterte en nær sammenheng mellom g S og egenskaper representert ved LES, f.eks med g S avtagende med økende blad levetid. Følgelig Schulze et al. (1994) 1 demonstrerer atrangerte klare sammenhenger mellom blad nitrogeninnhold og g SMAX. Tilsvarende Juhrbandt et al. (2004) 25 funnet betydelige forbindelser mellom g SMAX og bladareal og blad nitrogeninnhold.
Vår andre hypotese av klare forskjeller med hensyn til blad vane kunne ikke bekreftes. Den høye variasjon i de målte parametere og egenskaper innenfor eviggrønne og løvfellende blad vane tyder på at bladet vane er ikke en god descriptor av LES. Brodribb og Holbrook (2005) 26 diskutert at blad vane og blad fysiologiske strategier ikke kan være uunngåelig koblet siden brede trekk variasjon er vanlig i alle typer blad vane.
Tilnærmingen kan utvides til trekk og fysiologiske karakteristikker av plante andre enn bladene, for eksempel for å trekk knyttet til Xylem hydraulikk organer som spesifikk xylem hydraulisk ledningsevne og mikros tre trekk 27. Likeledes kan andretyper blad egenskaper som stammer fra mikroskopi som palisade parenkym struktur og epicuticular voks lagstruktur kunne inkluderes 28.
Oppsummert denne studien bekreftet den nære sammenhengen mellom LES og stomatal regulering. I tillegg vil metoden presenteres her avslørte fasetter av stomatal regulering mønstre som ikke er relatert til den LES. Spesielt spesifikke blad egenskaper som stomata størrelse, tetthet og indeksen samt vene lengde fortjener fremtiden oppmerksomhet i funksjonelle plante studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC 1 Porometer | Decagon | Any other porometer is suitable | |
| Cable ties to mark leaves | |||
| Plastic sample bags | |||
| Paper sample bags | |||
| Hygrometer | Trotec | Any other is suitable | |
| Nail polish | |||
| Axioskop 2 plus | Zeiss | Any other is suitable | |
| Ethanol | |||
| Bleach | |||
| 5% NaOH | |||
| 10% KOH | |||
| 25% H2O2 | |||
| Malachite green | |||
| Safranine |
References
- Schulze, E. -D., Kelliher, F., Körner, C., Lloyd, J., Leuning, R. Relationships among maximum stomatal conductance, ecosystem surface conductance, carbon assimilation rate, and plant nitrogen nutrition: a global ecology scaling exercise. Annual Review of Ecology and Systematics. 25 (1), 629-662 (1994).
- Chaturvedi, R. K., Raghubanshi, A. S., Singh, J. S. Growth of tree seedlings in a tropical dry forest in relation to soil moisture and leaf traits. Journal of Plant Ecology. 6 (2), 158-170 (2013).
- Santiago, L. S., Kim, S. C. Correlated evolution of leaf shape and physiology in the woody Sonchus. alliance (Asteraceae: Sonchinae) in Macaronesia. International Journal of Plant Sciences. 170 (1), 83-92 (2009).
- Aasamaa, K., Sober, A. Hydraulic conductance and stomatal sensitivity in six deciduous tree species. Biologia Plantarum. 44 (1), 65-73 (2001).
- Waring, R. H., Chen, J., Gao, H. Plant-water relations at multiple scales: integration from observations, modeling and remote sensing. Journal of Plant Ecology-UK. 4, 1-2 (2011).
- Oren, R., Sperry, J. Survey and synthesis of intra- and interspecific variation in stomatal sensitivity to vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 22 (12), 1515-1526 (1999).
- Leuning, R. A critical appraisal of a combined stomatal-photosynthesis model for C3 plants. Plant, Cell and Environment. 18 (4), 339-355 (1995).
- Patanè, C. Leaf area index, leaf transpiration and stomatal conductance as affected by soil water deficit and vpd in processing tomato in semi arid mediterranean climate. Journal of Agronomy and Crop Science. 197 (3), 165-176 (2011).
- Jarvis, A. J., Davies, W. J. The coupled response of stomatal conductance to photosynthesis and transpiration. Journal of Experimental Botany. 49 (Special Issue), 399-406 (1998).
- Roelfsema, M. R. G., Hedrich, R. In the light of stomatal opening: new insights into “the Watergate.”. New Phytologist. 167 (3), 665-691 (2005).
- Wong, S. C., Cowan, I. R., Farquhar, G. D. Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity. Nature. 282 (5737), 424-426 (1979).
- Sobrado, M. A. Hydraulic conductance and water potential differences inside leaves of tropical evergreen and deciduous species. Biologia Plantarum. 40 (4), 633-637 (1998).
- Zhang, Y. -J., Meinzer, F. C., Qi, J. -H., Goldstein, G., Cao, K. -F. Midday stomatal conductance is more related to stem rather than leaf water status in subtropical deciduous and evergreen broadleaf trees. Plant, Cell and Environment. 36 (1), 149-158 (2013).
- Aerts, R. The advantages of being evergreen. Trends in Ecology, & Evolution. 10 (10), 402-407 (1995).
- Murray, F. W. On the computation of saturation vapor pressure. Journal of Applied Meteorology. 6 (1), 203-204 (1967).
- Basic Concepts. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij/docs/concepts.html (2015).
- Scoffoni, C., Sack, L. Quantifying leaf vein traits. PrometheusWiki. , Available from: http://prometheuswiki.publish.csiro.au/tiki-index.php?page=Quantifying+leaf+vein+traits (2011).
- Cornelissen, J. H. C., Lavorel, S., et al. A handbook of protocols for standardised and easy measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 51 (4), 335-380 (2003).
- Perez-Harguindeguy, N., Díaz, S., et al. New handbook for standardised measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany. 61 (3), 167-234 (2013).
- Kröber, W., Bruelheide, H. Transpiration and stomatal control: A cross-species study of leaf traits in 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. Trees. 28 (3), 901-914 (2014).
- Larcher, W. Physiological plant ecology. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York, Hong Kong, London, Milan, Paris, Tokyo. 514 (2003).
- Bunce, J. Does transpiration control stomatal responses to water vapour pressure deficit. Plant, Cell and Environment. 20 (1), 131-135 (1997).
- Bunce, J. A. How do leaf hydraulics limit stomatal conductance at high water vapour pressure deficits. Plant, Cell and Environment. 29 (8), 1644-1650 (2006).
- Poorter, L., Bongers, F. Leaf traits are good predictors of plant performance across 53 rain forest species. Ecological Sciences of America. 87 (7), 1733-1743 (2006).
- Juhrbandt, J., Leuschner, C., Hölscher, D. The relationship between maximal stomatal conductance and leaf traits in eight Southeast Asian early successional tree species. Forest Ecology and Management. 202 (1-3), 245-256 (2004).
- Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. Leaf physiology does not predict leaf habit; examples from tropical dry forest. Trees. 19 (3), 290-295 (2005).
- Kröber, W., Zhang, S., Ehmig, M., Bruelheide, H. Xylem hydraulic structure and the Leaf Economics Spectrum - A cross-species study of 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species. PLOS ONE. 9 (11), e109211 (2014).
- Kröber, W., Heklau, H., Bruelheide, H. Leaf morphology of 40 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species and relationships to functional ecophysiological traits. Plant Biology. 17 (2), 373-383 (2015).
