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Immunology and Infection

माउस भोले सीडी 4 Published: April 16, 2015 doi: 10.3791/52739
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Introduction

अलग प्रजातियों या सीडी 4+ टी सहायक के सबसेट की अवधारणा (ध) कोशिकाओं को 20 वीं सदी के एक के बाद के हिस्से के बाद से आसपास किया गया है। सेलुलर प्रसार और कोशिकाओं गु प्रेरक में अंतिम भेदभाव के कई दौर में costimulatory संकेतों परिणामों की उपस्थिति में आत्मीय प्रतिजन की मान्यता। इस प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न गु सेल के प्रकार के सक्रियण 2 के दौरान उपस्थित साइटोकाइन पर्यावरण पर निर्भर है। प्रारंभ में, भोले गु कोशिकाओं टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण, costimulatory CD28 बंधाव, और साइटोकाइन संकेतन निम्नलिखित दो अलग प्रजातियों में फूट डालना लगा रहे थे। टाइप 1 सहायक कोशिकाओं (Th1) IFNγ साइटोकाइन के अपने प्रेरक उत्पादन के साथ-साथ भेदभाव प्रक्रिया 3,4 दौरान आईएल-12 संकेतन के लिए उनकी आवश्यकता की विशेषता है। अंततः यह विभेदित Th1 कोशिकाओं सबसे विशिष्ट बी की विशेषता है कि एक आनुवंशिक प्रोफ़ाइल है कि खोज की थीY Th1 आनुवंशिक कार्यक्रम 5 के मास्टर नियामक माना जाता है जो टी बॉक्स परिवार प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति, Tbx21 (टी शर्त),। इसके अलावा, आईएल-12 के रूप में अच्छी तरह से IFNγ के रूप में टी-शर्त अभिव्यक्ति 6,7 प्रचार कर सकते हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में, Th1 कोशिकाओं इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ों के साथ ही स्व-प्रतिरक्षित सूजन की मजबूत प्रमोटरों के खिलाफ मेजबान सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, टाइप 2 सहायक कोशिकाओं (Th2) उनके विकास के लिए आईएल -4 और आईएल -4, आईएल -5 सहित उनके प्रेरक साइटोकिन्स, और आईएल -13 की आवश्यकता होती है, बी सेल प्रतिक्रिया ड्राइविंग के लिए महत्वपूर्ण हैं और एलर्जी 8 में रोगजनक हैं, 9। Th1 कोशिकाओं के लिए इसी प्रकार, Th2 कोशिकाओं को उनके खुद के मालिक ट्रांसक्रिप्शनल नियामक व्यक्त करने के लिए पाए गए, GATA-तीन 10,11 करार दिया। दिलचस्प बात यह है ध्रुवीकरण साइटोकिन्स की उपस्थिति और एक विशिष्ट गु वंश की पीढ़ी केवल एक विशेष गु सबसेट एक प्रतिरक्षा पुन दौरान प्रमुख बन सकते हैं, सुझाव है कि दूसरों को 2,12 के विकास के लिए विरोधी हैंप्रायोजक।

Th1 और Th2 प्रजातियों की पहचान के बाद से, आगे काम हाल ही में कूपिक सहायक (TFH), (Th9) आईएल-9-उत्पादन और आईएल-22-उत्पादन (Th22) (सहित टी सहायक कोशिकाओं के भी अद्वितीय कैंपेन्स, प्रदर्शन किया है ) 13 में समीक्षा की। इन विट्रो भेदभाव प्रयोगों के प्रयोजनों के लिए, इस प्रोटोकॉल विनियामक टी कोशिकाओं (Treg) और आईएल-17-उत्पादन सीडी 4+ टी कोशिकाओं (Th17) कहा जाता है, केवल पर दो अतिरिक्त गु कैंपेन्स ध्यान दिया जाएगा। CD25 + विनियामक टी कोशिकाओं थाइमस में स्वाभाविक रूप से (nTreg) हो सकता है; भोले गु कोशिकाओं को भी (14,15 में समीक्षा) परिधि में नियामक बनने के लिए (iTreg) प्रेरित किया जा सकता है। Tregs के दोनों प्रकार के एक विशेषता प्रतिलेखन कारक, घुलनशील विरोधी भड़काऊ मध्यस्थ उत्पादन, आईएल -2 की खपत, और सेल संपर्क निर्भर तंत्र 14,15 शामिल है कि उनके प्रेरक दमन तंत्र के लिए महत्वपूर्ण है जो forkhead बॉक्स पी 3 (Foxp3), करार दिया व्यक्त करते हैं। Foxp की कमीएक गंभीर, बहु अंग autoimmune विकार में 3 अभिव्यक्ति परिणाम प्रतिरक्षा अनियंत्रण, polyendocrinopathy, enteropathy करार दिया, सूजन को हल करने और आत्म करने के लिए परिधीय सहिष्णुता को विनियमित करने में इस गु सबसेट की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन एक्स-लिंक्ड सिंड्रोम (IPEX), 16 प्रतिजनों। इन विट्रो में, भोले सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं Foxp3 अप को विनियमित करने और आईएल -2 और 14,15 TGF-β साथ उत्तेजना पर Treg कार्यक्रम के लिए प्रतिबद्ध हो जाते हैं। (17,18 में समीक्षा) केवल साइटोकाइन उत्पादन पर है, खासकर जब सीडी 4 + टी सेल प्रजातियों में काफी plasticity के लिए उदार हो सकता है। हालांकि, इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, हम एक अद्वितीय वंश के रूप में प्रत्येक सबसेट पर चर्चा होगी।

हाल ही में, आईएल-17 साइटोकाइन है कि उत्पादन Th17 कोशिकाओं के एक सबसेट स्व-प्रतिरक्षित सूजन 19-21 के दौरान विशेष रूप से रोगजनक हैं कि समर्थक भड़काऊ कार्यों के साथ एक अद्वितीय वंश के रूप में पहचान की गई थी। Th17 कोशिकाओं को एक अद्वितीय प्रतिलेखन कारक एक्सप्रेस, Th17 आनुवंशिक कार्यक्रम 22 निर्देशांक कि करार दिया retinoid से संबंधित अनाथ रिसेप्टर गामा T (RORγt)। TGFβ RORγt की प्रेरण के माध्यम से Th17 वंश की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, TGFβ संकेतन का असर केवल (12 में समीक्षा) आईएल -6 के साथ भागीदारी पर Th17 प्रतिबद्धता प्रेरित करने के लिए माना जाता है। आगे के अध्ययन के अन्य सकारात्मक आईएल 1β सहित Th17 प्रतिबद्धता को नियंत्रित कर सकते हैं कि संकेतों में वृद्धि हुई, सोडियम, और TLR की एक किस्म 23-26 संकेत दिखाया है। अन्य रिपोर्टों विवो में रोगजनक Th17 कोशिकाओं को वास्तव में TGFβ सिगनल को बायपास करने वाले लोग कर रहे हैं और इसके बजाय उनके भेदभाव 27 के लिए आईएल -1, आईएल -6, और आईएल -23 का एक संयोजन पर निर्भर है कि सुझाव दिया है। इस प्रकार, Th17 कोशिकाओं रास्ते संकेतन की एक किस्म से प्राप्त किया जा सकता है; Th17 वंश प्रतिबद्धता के लिए इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, सामान्य रूप से प्रयुक्त (TGFβ और आईएल -6) मार्गप्रस्तुत किया जाएगा।

सभी प्रेरक प्रजातियों के लिए नीचे वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल प्रयोग का पूरा कोर्स में TCR और CD28 के लिए उत्तेजनाओं के रूप में तय एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। हालांकि, दूसरों को दिखा दिया है कि प्रतिजन कोशिकाओं पेश 28 या पार से जोड़ने विरोधी CD3 और हम्सटर एंटीबॉडी के साथ विरोधी CD28 एंटीबॉडी दो दिनों में 29 के लिए भी विभिन्न गु कैंपेन्स की पीढ़ी के उत्प्रेरण के अत्यधिक प्रभावी साधन हैं साथ TCR के सक्रियण। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Th17 कोशिकाओं 31 माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों 30 से murine सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग-थलग और पैदा करने के लिए पहले की रिपोर्ट के तरीकों पर बनाता है। एक प्रमुख अंतर यह है कि इस प्रोटोकॉल ल्य्म्फोइड ऊतकों से भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल सॉर्टर के उपयोग पर निर्भर करता है। हालांकि, कई कंपनियों को अब आवश्यकता च बायपास करने में सक्षम हो सकता है, जो भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध कर सकते हैं कि तेजी से जुदाई किट की पेशकशया छँटाई प्रयोग पर निर्भर करता है। तरीकों और इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत अभिकर्मकों हम नियमित रूप से इस्तेमाल करते हैं और सबसे प्रभावी होने के लिए मिल रहे हैं। हालांकि, वैकल्पिक अभिकर्मकों और तरीके से नीचे प्रस्तुत चरणों के कई के लिए मौजूद हैं कि मन में रखने के लिए और यह अपने उद्देश्यों के लिए सबसे अच्छा काम करेगा निर्धारित करने के लिए अलग-अलग प्रयोगशाला पर निर्भर है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चिकित्सा और विज्ञान के रॉसलिंड फ्रैंकलिन विश्वविद्यालय में पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा के कार्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया (NCI से खरीदा) C57BL / 6 चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखे गए थे, और सभी पशु प्रयोगों मेडिसिन के रॉसलिंड फ्रैंकलिन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया और विज्ञान।

उपकरण, आपूर्ति, और अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. विरोधी CD3 और विरोधी CD28 के साथ कोट 48-अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह प्लेटें (तालिका 1) बाँझ पीबीएस, कवर में और parafilm में लपेट वाष्पीकरण और प्रदूषण को रोकने के लिए, और फिर टी से पहले दिन सी ओ 4 में हे / एन सेते सेल अलगाव। 37 ओ सी पर वैकल्पिक रूप से, कोट कुओं एक ज करने के लिए 0.5-1 मिलीलीटर में 1μg / एमएल पर विरोधी CD3 और विरोधी CD28 दोनों कोटिंग से Th0, Th1, Th2, और iTreg शर्तों को पूरा करेंताल मात्रा (48 अच्छी तरह से थाली)। Th17 के लिए, हम आम तौर पर कोट विरोधी CD3 एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एमएल और विरोधी CD28 2 माइक्रोग्राम प्रति / पर।
    नोट: हम एक उच्च विरोधी CD3 एकाग्रता Th17 पीढ़ी के लिए इष्टतम है, जबकि एक कम विरोधी CD3 एकाग्रता Th1, Th2, और iTreg पीढ़ी के लिए इष्टतम है कि मिल गया है। इस प्रकार, विरोधी CD3 और विरोधी CD28 सांद्रता titrated और अलग-अलग प्रयोगशालाओं (तालिका 2) के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. आटोक्लेव या निस्संक्रामक समाधान द्वारा विच्छेदन उपकरण (कैंची और संदंश) का एक सेट जीवाणुरहित। एक ट्यूब या 70% इथेनॉल युक्त छोटे बीकर dissections के बीच उपकरणों की त्वरित नसबंदी के लिए आवश्यक हो जाएगा। अंत में, 70% इथेनॉल युक्त एक स्प्रे बोतल विच्छेदन से पहले माउस की सतह स्टरलाइज़ लिए आवश्यक हो जाएगा।
  3. एल्यूमीनियम पन्नी में एक फ्लैट स्टायरोफोम का टुकड़ा या corkboard लपेटकर द्वारा एक विच्छेदन सतह तैयार करें। विदारक पिन या सुई जगह में पशु तय करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  4. तिवारी के संग्रह के लिए बर्तन या प्लेटों की तैयारीssues। पूलिंग ऊतकों हैं, के 3ml युक्त अलग 60mm व्यंजन बाँझ पीबीएस + तिल्ली और लिम्फ नोड के ऊतकों के लिए FBS के (पीबीएस +) के लिए पर्याप्त है 1%। व्यक्तिगत चूहों से रखने के ऊतकों को अलग हैं, कुओं की वांछित संख्या में पीबीएस + की एक 24 अच्छी तरह से थाली युक्त 1ml तैयार करते हैं।
  5. उपयोग करने से पहले सेल संस्कृति और पूर्व गर्म के लिए पूरा RPMI मीडिया को तैयार (1 टेबल)।
    नोट: हम नियमित RPMI उपयोग करें, लेकिन इस तरह के IMDM और DMEM के रूप में अन्य मीडिया समान रूप से प्रभावी है या प्रयोगशाला और प्रयोग के आधार पर बेहतर हो सकता है।
  6. नायलॉन के वर्गों बाँझ एक 120 माइक्रोन रोमकूप आकार और आटोक्लेव के साथ जाल कट 2x2 सेमी (1 टेबल)।
  7. वैकल्पिक: इस तरह की सीडी 4+ कोशिका संवर्धन, पूर्व गर्म चलाने के लिए autoMACS के रूप में सिस्टम छँटाई उच्च गति चुंबकीय सेल का उपयोग करने और मशीन को नुकसान को रोकने के लिए एक 37 ओ सेल्सियस पानी के स्नान में buffers rinsing हैं।
  8. नोट: संवर्धन छँटाई उपज बढ़ाने के लिए और समय छँटाई कम करने के लिए सिफारिश की है।
  9. सबतैयारी कदम, विच्छेदन के लिए छोड़कर, एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

चूहे से लिम्फ नोड्स और तिल्ली के 2. अलगाव

  1. एक संस्थागत मंजूरी दे दी तकनीक का उपयोग पशुओं के लिए आवश्यक संख्या euthanize। कारण पुरुषों की तुलना में भोले टी कोशिकाओं और कम वसा शरीर के अपने उच्च प्रतिशत करने के लिए या बड़े चूहों को C57BL 6 / मादा चूहों, उम्र 5-10 wks के, का प्रयोग करें।
    नोट: पुरुष चूहों से ली गई कोशिकाओं इन विट्रो में इसी तरह प्रदर्शन करेंगे और प्रोटोकॉल चरणों में ही रहते हैं। 5-10 wks के पुराने मादा चूहों, आमतौर पर माउस प्रति 3-6 एक्स 10 6 भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं निकलेगा। हालांकि, चूहों का उपयोग करते हुए विभिन्न प्रकारों उपज और प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, C57BL / 6 चूहों से कोशिकाओं Balb.c चूहों से कोशिकाओं Th2 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए बेहतर कर रहे हैं, जबकि Th1 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए बेहतर होते हैं।
  2. जानवर के अंगों बिखरा हुआ है और चित्र 1 में दिखाया के रूप में उन्हें जगह में पिन। लंबे समय तक त्वचा में कटौतीसावधान किया जा रहा itudinally ठोड़ी को गुदा से करते हुए नहीं गहरी ऊतक पंचर करने के लिए।
  3. फैलाओ संदंश के साथ त्वचा को खोलने और चित्रा 1 में दिखाया गया है लिम्फ नोड्स के लिए आसान पहुँच की अनुमति देने के लिए जगह में त्वचा पिन।
  4. चित्र 1 में दिखाया स्थानों से सुलभ लिम्फ नोड्स हार्वेस्ट। संदंश की एक जोड़ी के साथ लिम्फ नोड हथियाने संदंश की एक और जोड़ी के साथ ऊतक को अलग करने के लिए आसान हटाने के लिए अनुमति देगा। संग्रह डिश में ऊतक रखें।
  5. चित्र 1 में दिखाया स्थान से तिल्ली हार्वेस्ट। इस मामले में, पेरिटोनियम में सावधान काटने तिल्ली के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। एक संग्रह डिश में ऊतक रखें।
  6. अधिक ऊतकों काटा जा रहा हो तो प्रक्रिया को दोहराएं। अन्यथा अगले कदम के लिए आगे बढ़ें। इस बिंदु पर, छंटाई के बाद टी कोशिकाओं के चढ़ाना जब तक बर्फ पर शेष सभी चरणों का प्रदर्शन।

3. ऊतक प्रसंस्करण और सीडी 4 + संवर्धन

  1. नाबालिग ल्युकोसैट मौत में परिणाम हो सकता है जो एरिथ्रोसाइट सेल की आवश्यकता नहीं है लिम्फ नोड सेल की तैयारी, के रूप में उपज बढ़ाने के लिए अलग बर्तन में लिम्फ नोड्स और तिल्ली की प्रक्रिया। इसलिए, निम्न चरणों का अलग से छंटाई के लिए लेबलिंग करने के लिए पहले के संयोजन के द्वारा पीछा किया प्लीहा और लिम्फ नोड आबादी के प्रसंस्करण के लिए एक विधि का वर्णन।
  2. पीबीएस + के 3 मिलीग्राम से युक्त एक नया 60 मिमी डिश में संग्रह पकवान और जगह से ऊतक (तिल्ली या जमा लिम्फ नोड्स) निकालें। निष्फल संदंश का उपयोग ऊतक पर जाल बाँझ नायलॉन का एक वर्ग रखें।
  3. एक सिरिंज सवार के अंगूठे की ओर (3-10 मिलीग्राम) ले लो और धीरे से जाल के खिलाफ ऊतक तोड़। लगभग ऊतक के सभी निलंबन में जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, दो autoclaved पाले सेओढ़ लिया स्लाइड्स के बीच ऊतक जगह है और निलंबन में grinded।
  4. निलंबन ऊपर पिपेट और नीचे एक बार कुछ शेष घुलनशील clumps को तोड़ने के लिए। एक के उद्घाटन पर नायलॉन जाल का एक नया वर्ग टुकड़ा रखें15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और शेष मलबे को हटाने के माध्यम से निलंबन फिल्टर।
  5. दोहराएँ अतिरिक्त लिम्फ नोड और प्लीहा ऊतक के लिए 2-4 कदम।
  6. निलंबन एक 15ml ट्यूब में फ़िल्टर्ड किया गया है एक बार पीबीएस + के साथ ट्यूब के शेष भरने के लिए और एक बार कुछ पलटना। 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 475 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र
  7. प्लीहा कोशिकाओं के लिए, सतह पर तैरनेवाला निम्नलिखित centrifugation के महाप्राण और एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए 1 मिनट के लिए तिल्ली प्रति ठंडा 1X एसीके समाधान के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। फिर, एसीके के शीर्ष पर पीबीएस + के 10 मिलीलीटर जोड़ने ट्यूब पलटना, और सेंट्रीफ्यूज 475 XG 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए
  8. लिम्फ नोड कोशिकाओं के लिए, पीबीएस + की 2ml में सतह पर तैरनेवाला और resuspend aspirate। अगर वांछित इन उनके एसीके lysis और धोने कदम के बाद प्लीहा कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा सकता है।
  9. पीबीएस + का एक और 10 एमएल में splenocytes की centrifugation और resuspend के बाद सतह पर तैरनेवाला aspirate। इस बिंदु पर लिम्फ नोड निलंबन हो सकता है एकतिल्ली निलंबन के शीर्ष पर dded ऊतक पूलिंग छँटाई के लिए आवश्यक है, तो। 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 475 XG पर फिर ट्यूब अपकेंद्रित्र
  10. सेल गोली अब सीडी 4 संवर्धन के लिए तैयार किया जा सकता है। इस कदम प्रदर्शन नहीं किया जाएगा, तो छँटाई तैयारी कदम के लिए आगे बढ़ें।
  11. उच्च गति चुंबकीय सेल छँटाई प्रणाली का उपयोग करते हुए सीडी 4 संवर्धन के लिए, सीडी 4 मोतियों के साथ सेलुलर गोली resuspend। आमतौर पर पीबीएस + 85 μl में पतला मोतियों की 15 μl एक माउस से ऊतकों लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जरूरत के रूप में, मनका मिश्रण की मात्रा को रैंप गोली resuspend, और 4 ओ सी पर 15-30 मिनट के लिए सेते
  12. , पीबीएस + के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 475 XG पर फिर से मलबे, और सेंट्रीफ्यूज को दूर करने के लिए एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में नायलॉन के माध्यम से निलंबन पारित
  13. माउस प्रति पीबीएस + के 100 μl में गोली Resuspend और उच्च गति चुंबकीय सेल छँटाई प्रणाली पर सकारात्मक चयन करने के लिए आगे बढ़ें। एक मैनुअल जुदाई प्रणाली, एफ का उपयोग अगरसंवर्धन के लिए निर्माता के निर्देशों ollow। वैकल्पिक रूप से, FACS बफर में नमूने resuspend: पीबीएस 1mm EDTA (पीएच = 8) और 1% बीएसए, बाँझ फ़िल्टर के साथ।
  14. सकारात्मक अंश निकालें और पीबीएस + की 10ml के साथ फिर से धो लें। समृद्ध सीडी 4 + अंश अब छंटाई के लिए लेबल के लिए तैयार है।

4. छंटनी भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं

  1. पीबीएस CD62L, CD44, CD25, और सीडी 4 के खिलाफ निर्देशित युक्त फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी + के साथ सेल गोली लेबल। तालिका 1 में सूचीबद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो प्रत्येक के लिए dilutions के प्रदान की जाती हैं। धुंधला के लिए, एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μl मात्रा एक माउस से ऊतकों प्रति प्रयोग किया जाता है।
  2. एंटीबॉडी कॉकटेल में गोली Resuspend और अंधेरे में 4 ओ सी पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 4 ओ सी पर पीबीएस + की 10ml और सेंट्रीफ्यूज 475 XG 5 मिनट के लिए के साथ कोशिकाओं को धो लें
  4. फिर से करने के लिए एक और नायलॉन फिल्टर या सेल झरनी टोपी के ऊपर मिश्रण दर्राकिसी भी बचे हुए मलबे चाल है। सेल सॉर्टर के लिए संगत है कि एक ट्यूब में लेबल कोशिकाओं पिपेट। बर्फ पर कोशिकाओं रखें और तरह जब तक प्रकाश से रक्षा की।
  5. एक सेल सॉर्टर पर संग्रह के लिए संगत ट्यूब के तल में पूरा RPMI मीडिया या FBS की 1-2ml pipetting द्वारा संग्रह ट्यूबों तैयार करें।
  6. क्रमबद्ध एक सीडी 4 + CD25 के रूप में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं - CD62L + CD44 - जनसंख्या (चित्रा 2)। पूरा RPMI मीडिया के साथ एकत्र कोशिकाओं को धो लें और ऊपर वर्णित के रूप में अपकेंद्रित्र।
  7. , पूरा RPMI में गोली Resuspend भोले कोशिकाओं की गिनती, और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता समायोजित करें।

5. इन विट्रो भेदभाव की स्थापना

  1. विरोधी CD3 और विरोधी CD28 लेपित प्लेटों के कुओं Aspirate और बाँझ पीबीएस (कोई एफ बी एस) के 1ml के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धोने। 48 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, आरपी के 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में 0.5 मिलीलीटर थालीएमआई। 24 अच्छी तरह प्लेटें, संस्कृति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं RPMI के / कुएं में 1.0 एमएल के लिए।
  2. इस तरह के एक दवा के रूप में एक कारक के प्रभाव के परीक्षण के दौरान या तो पहले, उचित कुओं पदार्थ जोड़ने के लिए, या प्रयोग के आधार पर भेदभाव की प्रक्रिया के बाद यदि। अगला, तदनुसार साइटोकिन्स और अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ संस्कृति मीडिया के पूरक है। Th0: 30 यू / एमएल एचआइएल-2। Th1: 15 एनजी / एमएल rmIL-12, 30 यू / एमएल एचआइएल-2, और 5000 एनजी / एमएल 11B11.Th2: 10 एनजी / एमएल rmIL-4, 30 यू / एमएल एचआइएल-2, 2000 एनजी 37.51 घुलनशील मिलीग्राम /, और 5000 एनजी / एमएल XMG1.2। iTreg: 15 एनजी / एमएल hTGFβ, 30 यू / एमएल एचआइएल-2, 5000 एनजी / एमएल XMG1.2, और 5000 एनजी / एमएल 11B11। Th17: 20 एनजी / एमएल rmIL-6, 3 एनजी / एमएल hTGFβ, 5000 एनजी / एमएल XMG1.2, और 5000 एनजी / एमएल 11B11।
    नोट: ऊपर प्रस्तुत शर्तों भेदभाव प्रयोग (प्रतिनिधि परिणाम खंड) के अंत के रूप में मापा साइटोकाइन उत्पादन अधिकतम करने के लिए इष्टतम होना पाया गया है। हालांकि, प्रत्येक हालत व्यक्ति लेबोरेटरीज (तालिका 2 के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए
  3. पूर्व जीन अभिव्यक्ति और साइटोकाइन उत्पादन के विश्लेषण के लिए डी 4-5 के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 ओ सी पर थाली सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, प्रसार और अंतिम उपज बढ़ाने के लिए नए सिरे से मीडिया के साथ 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए समायोजित, 2 डी के बाद TCR उत्तेजनाओं से कोशिकाओं को हटाने, और नए कुओं (गैर लेपित) में प्लेट। इस मामले में, ताजा ध्रुवीकरण साइटोकिन्स और एंटीबॉडी की जरूरत नहीं हैं लेकिन आईएल -2 के 10 यू / एमएल Th0, Th1, Th2, और iTreg संस्कृतियों के लिए नए मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए।

भेदभाव के 6. विश्लेषण

  1. प्रवाह cytometry द्वारा साइटोकाइन विश्लेषण के लिए, / एमएल ionomycin या एक माइक्रोग्राम प्रति (जैसे एक brefeldin के रूप में एक Golgi अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में 4-6 घंटे के लिए विरोधी CD3 / एमएल तालिका एनजी 10ng / एमएल पीएमए और 1000 के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक restimulate1)। Intracellular साइटोकाइन धुंधला प्रयोग पर निर्भर करता है (चित्रा 3) प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: दाग गैर-वंश विशेष साइटोकिन्स या इस तरह के (नहीं दिखाया गया है) आईएल -4 और IFNγ रूप प्रतिलेखन कारक, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में और भेदभाव दक्षता का एक संकेतक के रूप में हर हालत के लिए Th17 संस्कृतियों के लिए (चित्रा 3),। इसके अलावा, Tregs के पारस्परिक विकास के रूप में Th17 संस्कृतियों के लिए दाग Foxp3 TGFβ के अलावा के साथ हो सकता है।
  2. प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए, साइटोकाइन विशिष्ट एलिसा (चित्रा 3) के द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से और परख से supernatants इकट्ठा। परीक्षण किया जा रहा कारक नियंत्रण के नमूने की तुलना में प्रसार को प्रभावित किया है कि चिंता का विषय है, तो कोशिकाओं, धोया जा सकता है, सामान्यीकृत गिना, और फिर एलिसा assays के लिए supernatants इकट्ठा करने से पहले 24 घंटे के लिए विरोधी CD3 की एक माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ restimulated। एल हो सकता है कि आईएल -4 की स्थिति, कपड़े धोने और restimulating आवश्यक है Th2 से आईएल -4 दूर करने के लिए परख करने की क्रिया हैंप्रारंभिक भेदभाव संस्कृति से eftover।
  3. वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, फसल कोशिकाओं ऊष्मायन अवधि के बाद, धोने, मानक के अनुसार, और विरोधी CD3 की एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कटाई mRNA के लिए पूर्व (चित्रा 3) के साथ 2-6 घंटे के लिए फिर से उत्तेजित।

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Representative Results

गु स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं भेदभाव के विश्लेषण के लिए समय बिंदु टी सेल रिसेप्टर सक्रियण की ताकत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण किया जा रहा है। भेदभाव के 2-3 दिनों के बाद, कोशिकाओं टी सेल प्रसार की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं। कोशिकाओं के व्यापक प्रसार और clumping प्रदर्शन वेल्स की संभावना सबसे अधिक संभावना संस्कृति में चार दिनों के बाद मीडिया निकास होगा, बहिर्जात आईएल -2, ऐसे Th1 और Th2 के रूप में के अलावा पर निर्भर दिन 4. भेदभाव की स्थिति में विश्लेषण के लिए तैयार हो जाएगा। साइटोकाइन उत्पादन बढ़ाने के लिए, थक मीडिया के साथ इस तरह के कुओं ताजा RPMI आईएल -2 को रोकने के साथ मंगाया या गिना और आईएल -2 एक या दो दिन के लिए भेदभाव का विस्तार करने युक्त ताजा RPMI में अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया जा सकता है इस पद्धति का उपयोग।

चित्र 1
Figurपिन नियुक्ति की ई 1. चित्रण। प्लीहा और लिम्फ नोड्स के अलगाव के लिए एक माउस को ठीक (ए) के अलावा अंगों बिखरा हुआ है और एक बाँझ सुई या विच्छेदन पिन के साथ उन्हें ठीक करने के लिए। इस स्थिति से, धीरे से, काटने के बाद (बी)। ठोड़ी को पूंछ से अनुलंबीय फर और त्वचा में कटौती चित्र में दिखाया गया के रूप में लिम्फ नोड्स को बेनकाब करने के अलावा त्वचा में फैल गया। आसानी से इस स्थिति से सुलभ हैं कि लिम्फ नोड्स के स्थानों को चित्र में सूचीबद्ध हैं। तिल्ली सिर्फ जानवर के सही पक्ष पर ribcage के नीचे स्थित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
भोले सीडी 4 के अलगाव के लिए चित्रा 2. प्रतिनिधि छँटाई रणनीति + सेल द्वारा टी कोशिकाओं छँटाई>। ऊपरी बाएँ से शुरू, लिम्फोसाइटों पहली आकार द्वारा gated हैं और फिर स्वेटर कोशिकाओं नक़ल कोशिकाओं से भेदभाव कर रहे हैं। Singlets पर gating सीडी 4 + CD25 + nTregs हैं कि कोशिकाओं की आबादी का पता चलता है। जनसंख्या और फिर क्रमबद्ध भोले (CD62L + CD44 - -) गेट सीडी 4 + CD25 पर प्रेरक / स्मृति से (CD62L - CD44 +) सीडी 4 + कोशिकाओं। बिंदीदार लाइनों अगले साजिश के गेट मूल संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
भेदभाव गु इन विट्रो में निम्नलिखित चित्रा 3. नमूना डेटा। (ए) INTRACTh1, Th2, iTreg से (सीडी 4 + पर gated) ellular साइटोकाइन धुंधला डेटा, और Th17 differentiations। आमतौर पर, इस तरह के Th17 संस्कृतियों के लिए आईएल -4 और IFNγ के रूप में गैर-वंश विशिष्ट साइटोकिन्स, भेदभाव की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए दाग किया जाना चाहिए। (बी) एलिसा डेटा भेदभाव, वाशिंग गु 4 डी, और कोशिकाओं के 24 घंटे के restimulation के साथ निम्न एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / विरोधी CD3 के साथ चार घंटे के लिए 4 डी भेदभाव और restimulation निम्नलिखित वंश विशेष प्रतिलेखन कारक के एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / विरोधी CD3। (सी) वास्तविक समय पीसीआर डेटा। समान भोले टी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए आधार रेखा के रूप में सेवा से सभी जीन मात्रा β-actin और mRNA की अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नीचे 1 तालिका देखें सामग्री तालिका।

अभिकर्मक अनुशंसित अनुमापन रेंज
साइटोकिन्स:
मानव (ज) आईएल -2 5 यू / एमएल - 50 यू / मिलीलीटर
rmIL-4 5 एनजी / एमएल - 30 एनजी / एमएल
rmIL -6 5 एनजी / एमएल - 30 एनजी / एमएल
rmIL-12 10 एनजी / एमएल - 30 एनजी / एमएल
hTGFb (Th17) 0.1 एनजी / एमएल - 5 एनजी / एमएल
hTGFb (iTreg) 5 एनजी / एमएल - 30 एनजी / एमएल
एंटीबॉडी:
2C11 (विरोधी CD3) 500 एनजी / एमएल - 5000 एनजी / एमएल
37.51 (विरोधी CD28) 250 एनजी / एमएल - 2500 एनजी / एमएल
11B11 (विरोधी आईएल -4) 5000 - 10,000 एनजी / एमएल
XMG1.2 (विरोधी IFNg) 5000 - 10,000 एनजी / एमएल


तालिका 2 भेदभाव शर्तों के अनुकूलन के लिए अनुमापन रेंज की सिफारिश की।

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Discussion

तिल्ली भोले गु सेल शामिल हैं, जबकि लिम्फ नोड्स में इस आबादी का अनुपात बहुत अधिक है। ठीक से इस प्रोटोकॉल में लिम्फ नोड्स की पहचान करने और निकालने के लिए विफलता भोले कोशिकाओं के एक गरीब उपज में परिणाम होगा। यह और अधिक वसा ऊतक है कि बड़े चूहों या पुरुष चूहों में विशेष रूप से कठिन हो सकता है। पशु अंगों और त्वचा की चित्रा 1, उचित फिक्सिंग और लगाए में दिखाया गया के रूप में सुलभ बाहरी लिम्फ नोड्स की आसान दृश्य के लिए अनुमति देगा। लिम्फ नोड्स और spleens कार्रवाई कर रहे हैं एक बार, सेल छँटाई एक उच्च शुद्ध भोले सीडी 4 + टी सेल की आबादी प्राप्त करने का पसंदीदा तरीका है। पवित्रता भोले सेल भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित करने से कोशिकाओं गु nTregs या प्रेरक और स्मृति को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। भोले टी कोशिकाओं की एक उच्च उपज प्राप्त करने में कठिनाइयाँ आम तौर पर जुदाई चरणों के दौरान अक्षम ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण या कोशिकाओं के नुकसान की वजह से हैं। उपज बनाने की वृद्धि करने के लिएure बर्फ पर ठंड buffers और incubations का उपयोग कोशिकाओं की प्रक्रिया करने के लिए। इसके अलावा, पहले से सिफारिश की है अभिकर्मकों और जुदाई प्रोटोकॉल के अनुकूलन, संवर्धन और / या छँटाई के दौरान कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए। प्रोटोकॉल चरणों में विभिन्न बिंदुओं पर उल्लेख के रूप में अंत में, भेदभाव शर्तों बड़े पैमाने पर प्रयोग (तालिका 2) के प्रदर्शन से पहले व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

आबादी - चित्रा 2 में दिखाया गया है, भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं को आसानी से nTreg (सीडी 4 + CD25 +) और प्रेरक (सीडी 4 + CD44 + CD62L) से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। छंटनी भी प्लीहा और लिम्फ नोड्स में मौजूद हैं जो कैंपेन्स गु प्रेरक के प्रदूषण को रोकने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीके से एक है। भेदभाव के दौरान Treg संदूषण सक्रियण के दमन के रूप में अच्छी तरह से साइटोकाइन उत्पादन में हो सकता है। में हो सकता है कैंपेन्स गु अन्य प्रेरक का संदूषणवांछित गु प्रजातियों के विकास के लिए निरोधात्मक हैं कि साइटोकिन्स का उत्पादन। छंटनी सुविधा फीस महंगा हो सकता है और कुछ इसे इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में समय छँटाई में कटौती करने के लिए चुंबकीय जुदाई से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए आसान है कि लगता है। एक सॉर्टर के अभाव में, कुछ कंपनियों को अब भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए विशेष रूप से डिजाइन जुदाई किट प्रदान करते हैं। हालांकि, जनसंख्या की पवित्रता हमेशा छाँटे गए नमूनों के समान जुदाई के बाद जाँच की जानी चाहिए। स्मृति / प्रेरक कोशिकाओं की तुलना में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं (CD62L +) के एक कम आवृत्ति की खोज (CD44 -) इस तरह के एक संक्रमण या ट्यूमर के रूप में माउस के साथ एक समस्या का संकेत हो सकता है। इस मामले में कोशिकाओं के प्रयोग के इस प्रकार के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

गु भेदभाव के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए काफी कुछ तरीके हैं। प्रोटीन विश्लेषण पारंपरिक रूप से साइटोकाइन दाग द्वारा किया जाता हैएक विशिष्ट वंश को ध्रुवीकरण किया गया है कि भोले कोशिकाओं के प्रतिशत की एक विचार दे देंगे जो आईएनजी, (चित्रा 3)। एलिसा द्वारा प्रोटीन मात्रा का ठहराव भी साइटोकिन्स की कुल राशि मीडिया में जारी किया जा रहा है निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। हालांकि एलिसा प्रोटीन विश्लेषण के साथ चेतावनी परीक्षण किया जा रहा है एक विशेष कारक प्रसार और अस्तित्व पर एक प्रभाव है अगर प्रयोगात्मक समूहों के बीच तुलना करने के परिणामों के लिए मुश्किल हो सकता है। इस मामले में, साइटोकिन्स उत्पादक कोशिकाओं की कुल संख्या प्रयोग के अंत में समूहों के बीच अलग-अलग हो सकता है। इस प्रकार, सेल गिनती को सामान्य बनाने और समय की एक छोटी अवधि के लिए restimulating (जैसे, 24 घंटे के लिए विरोधी CD3) उचित परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, आईएल -4 Th2 सबसेट की पीढ़ी के लिए एक ध्रुवीकरण कारक के रूप में प्रयोग किया जाता है, इसलिए इन कोशिकाओं, सामान्यीकृत धोया जाना चाहिए, और आईएल-4 के लिए एक एलिसा प्रदर्शन करने के लिए पहले restimulated। वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण च न केवल उपयोगी हैया साइटोकाइन जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण, लेकिन यह भी वंश विशेष प्रतिलेखन कारक के लिए (चित्रा 3)। इस प्रकार, प्रयोग पर निर्भर करता है, गु भेदभाव के प्रभाव को परख करने के लिए विभिन्न तरीके हैं।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा।

Acknowledgments

लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए टेक्सास एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय में चिकित्सा और विज्ञान के रॉसलिंड फ्रैंकलिन विश्वविद्यालय में रेनॉल्ड्स प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, और चेन दांग प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (K22AI104941) से JMR के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete RPMI: Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10 % FBS Life Technologies 26140-079
1000X 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100X Pen/Strep Life Technologies 15140122
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
120 micron nylon mesh Amazon CMN-0120-10YD Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers Fisher 08-771-19 Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer Miltenyi 130-091-221 Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution Miltenyi 130-091-222 Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads Miltenyi 130-049-201
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2 Peprotech 200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4 Peprotech 214-14
rmIL-6 R & D Systems 406-ML-025
rmIL-12 Peprotech 210-12
hTGFb R & D Systems 240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3) BioXcell BE0001-1
37.51 (anti-CD28) BioXcell BE0015-1
11B11 (anti-IL-4) BioXcell BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg) BioXcell BE0055
anti-CD62L-FITC BioLegend 104406 Use at 1:100
anti-CD25-PE BioLegend 102008 Use at 1:400
anti-CD4-PerCP BioLegend 100434 Use at 1:1000
anti-CD44-APC BioLegend 103012 Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA) Sigma-Aldrich P-8139 Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin Sigma-Aldrich I-0634 Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A eBioscience 00-4506-51 Use at 1:1000

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References

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Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse… More

Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J. Vis. Exp. (98), e52739, doi:10.3791/52739 (2015).

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