Introduction
Концепция различных линий или подмножеств CD4 + Т-хелперов (Th) клетки была примерно со второй половины 20-го века 1. Распознавание антигеном в присутствии костимуляторных сигналов приводит в нескольких раундах клеточной пролиферации и дифференцировки в конечном итоге в эффектора Th-клеток. Тип Th клетки, генерируемого в ходе этого процесса зависит от окружающей среды цитокинов, присутствующих во время активации 2. Первоначально наивные Th клетки думал поляризовать в 2 различных линий следующих T-клеточного рецептора (TCR) активации, костимулирующего CD28 перевязки и цитокинов сигнализации. Тип 1-хелперы (Th1) характеризуются эффекторной производства цитокина IFN & gamma; а также их потребности в ИЛ-12 сигнализации в процессе дифференциации 3,4. В конце концов выяснилось, что дифференцированные клетки Th1 имеют генетический профиль, который наиболее отчетливо характеризуется бу выражение T коробки фактора семья транскрипции, Tbx21 (T-бет), который считается мастером регулятором генетической программы Th1 5. Кроме того, ИЛ-12, а также может способствовать IFN & gamma; Т-прогноз выражение 6,7. В иммунного ответа, Th1-клетки играют важную роль в защите организма против внутриклеточных патогенов, а также сильных промоторов аутоиммунного воспалительного процесса. В отличие от этого, тип 2-хелперы (Th2) требуют IL-4 по их развитием и эффекторные цитокины, включая IL-4, IL-5 и IL-13, имеют важное значение для приведения ответов В-клеточные и являются патогенными при аллергии 8, 9. Как Th1 клеток, Th2 клетки были обнаружены, чтобы выразить свою собственную регулятор мастер транскрипции, называют GATA-3 10,11. Интересно, что присутствие поляризующих цитокинов и генерации конкретного Th линии являются антагонистами к развитию других 2,12, предполагая, что только подмножество частности че может стать доминирующим в ходе иммунного ReОтклик.
Поскольку идентификации клонов Th1 и Th2, дальнейшая работа показала, еще более уникальным подмножества Т-хелперных клеток, в том числе фолликулярной помощника (TFH), IL-9-продуцирующих (Th9), и IL-22-продуцирующие (Th22) (последнее рассмотрены в 13). Для целей в пробирке экспериментов дифференциации, этот протокол будет сосредоточена только на два дополнительных Th подмножества, называемые регуляторные Т-клетки (Treg) и Ил-17 по производству CD4 + Т-клетки (TH17). CD25 + регуляторных Т-клеток может происходить естественным (nTreg) в тимусе; Наивные клетки Th также могут быть вызваны (iTreg), чтобы стать регулирования на периферии (обзор 14,15). Оба типа регуляторных Т-клеток выразить характеристика транскрипционный фактор, названный forkhead P3 коробка (FOXP3), которая имеет решающее значение для их эффекторных механизмов подавления, которые включают растворимые противовоспалительное производства посредника, IL-2 потребления, а ячейку контактно-зависимые механизмы 14,15. Отсутствие Foxp3 Результаты выражение в тяжелой, полиорганной аутоиммунных расстройств называется иммунной нарушения, так polyendocrinopathy, энтеропатия, с Х-хромосомой синдром (IPEX), что свидетельствует о критической роли этого Th подмножества в решении воспаление и регулирования периферической толерантности к собственным антигенам 16. В пробирке, наивные CD4 + Т-хелперы до регулировать Foxp3 и стать привержены программы Treg при стимуляции IL-2 и TGF-β 14,15. Там может быть умеренной до значительной пластичности в CD4 + Т-клеточных поколений, особенно при рассмотрении только продукцию цитокинов (обзор в 17,18). Тем не менее, для целей в пробирке протоколов дифференциации, мы будем обсуждать каждое из подмножеств как уникального рода.
Недавно подмножество Th17 клеток, которые производит цитокин IL-17 была определена в качестве уникального линии с про-воспалительных функций, особенно патогенные во время аутоиммунного воспаления 19-21, Th17 клетки экспрессируют уникальный транскрипционный фактор, названный ретиноидов, связанные с гамма-рецептор сирота т (RORγt), который координирует генетическую программу 22 Th17. TGF-beta является важным для генерации Th17 линии через индукции RORγt. Тем не менее, влияние сигналов TGF-beta, как полагают, вызывают только Th17 приверженность при синергизма с IL-6 (обзор в 12). Дальнейшие исследования показали, что множество других сигналов, которые могут положительно регулируют Th17 приверженность, в том числе ИЛ-1β, увеличение натрия и TLR сигнализации 23-26. Другие отчеты предполагают, что патогенные клетки Th17 в естественных условиях являются те, которые фактически обходить сигнализации TGF-beta, а вместо этого полагаются на сочетание ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-23 для их дифференциации 27. Таким образом, Th17 клетки могут быть получены из различных сигнальных путей; для целей настоящего протокола, часто используемых (TGF-beta и IL-6) путь для Th17 коммитированиебудут представлены.
Протоколы дифференцирования, описанные ниже, для всех эффекторных линий зависит от фиксированного антитела, стимулов для TCR и CD28 на протяжении всего хода эксперимента. Тем не менее, другие показали, что TCR-активации с антиген-представляющих клеток 28 или сшивающий анти-CD3 и анти-CD28 антител с антителом хомячка в течение 2 дней 29 также весьма эффективным средством индукции генерацию различных Th подмножеств. Протокол, представленные здесь основывается на ранее сообщалось о способах выделения мышиных CD4 + Т-клеток из вторичных лимфоидных органов 30 и генерации клетки Th17 31. Одним из основных отличий является то, что этот протокол основан на использовании клеточного сортера, чтобы изолировать наивных CD4 + Т-клеток от лимфоидных тканей. Тем не менее, многие компании сейчас предлагают для экспресс разделения, который может обогатить для простых CD4 + Т-клеток, которые могут быть в состоянии обойти требование пили сортировки в зависимости от эксперимента. Методы и реагенты, представленные в этом протоколе то, что мы обычно используем и нахожу, чтобы быть наиболее эффективным. Однако, имейте в виду, что альтернативные реагенты и методологии существуют для многих из шагов, представленных ниже, и это до индивидуального лаборатории, чтобы определить, что будет работать лучше для своих целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры выполняются с использованием протоколов, утвержденных в офисе окружающей среды и безопасности в Розалинд Франклин университета медицины и науки. C57BL / 6 мышей (полученных от NCI), используемый для этого протокола были размещены под конкретного патогена условиях, и все эксперименты на животных проводились с использованием протоколов, утвержденных Комитетом Уходу за животными и использование (IACUC) в то Розалинд Франклин университет медицины и Наука.
1. Подготовка инструментов, расходных материалов, а Реагенты
- Пальто 48-а и 24-луночные планшеты с анти-CD3 и анти-CD28 (таблица 1) в стерильном PBS, накрыть крышкой и заверните в парафильмом для предотвращения испарения и загрязнения, а затем инкубируют O / N на 4 ° С за день до T изолятор. Кроме того, пальто скважин 1 ч при 37 о С. Выполните условия Th0, Th1, Th2, и iTreg путем нанесения как анти-CD3 и анти-CD28 на 1 мкг / мл 0,5-1 мл доОбъем Таль (48-луночный планшет). Для Th17, мы, как правило, покрытие анти-CD3 на 2 мкг / мл и анти-CD28 на 1 мкг / мл.
Примечание: Мы обнаружили, что более низкая концентрация анти-CD3 является оптимальным для генерации Th1, Th2, и iTreg то время как более высокая концентрация анти-CD3 является оптимальным для генерации Th17. Таким образом, анти-CD3 и анти-CD28 концентрации следует титровать и оптимизирована для отдельных лабораторий (таблица 2). - Стерилизовать набор рассечение инструментов (ножницы и щипцы) в автоклаве или дезинфицирующим раствором. Трубка или маленький стакан, содержащий 70% этанола будут необходимы для быстрого стерилизации инструментов между вскрытия. Наконец, распылитель, содержащий 70% этанола будет необходимо для стерилизации поверхности мыши до вскрытия.
- Подготовка рассечение поверхности, обернув плоский кусок пенопласта или пробковая в алюминиевой фольги. Режущий булавки или иглы используются для фиксации животных на месте.
- Готовить блюда или пластин для сбора TiОПРОСЫ. Если объединение ресурсов тканей, отдельных 60mm блюда, содержащие 3 мл стерильного PBS + 1% FBS (PBS +) для селезенки и лимфатических узлов тканей достаточно. Если сохранение ткани из отдельных мышей по отдельности, подготовить 24-луночный планшет, содержащий 1 мл PBS + в нужное количество скважин.
- Подготовьте полный RPMI носитель для культуры клеток и предварительной тепло перед использованием (Таблица 1).
Примечание: Мы обычно используют RPMI, но и другие средства, такие как IMDM и DMEM может быть столь же эффективным или выше в зависимости от лаборатории и эксперимента. - Сокращение 2х2 см квадраты нейлоновой сеткой с размером пор 120 мкм и автоклав для стерилизации (таблица 1).
- Дополнительно: при использовании высокоскоростной магнитной ячейки системы сортировки, такие как AutoMACS для обогащения CD4 + клеток, предварительно теплой проточной и промывки буферы в C на водяной бане 37 O, чтобы предотвратить повреждение машины.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащение рекомендуется увеличить выход сортировки и сократить время сортировки.
- Всестадии получения, за исключением того, для вскрытия, должны быть выполнены в стерильной капот культуры ткани.
2. Выделение лимфатических узлов и селезенки у мышей
- Эвтаназии необходимое количество животных с использованием институционально-утвержденный технику. Используйте C57BL / 6 самок мышей, возраст 5-10 WKS, из-за их высокой процентной наивных Т-клеток и нижней части тела жиром по сравнению с мужчинами или старых мышей.
Примечание: клетки, полученные от мышей-самцов будет выполнять так же в пробирке и этапы протокола остаются теми же. Самок мышей, 5-10 нед старые, как правило, дают 3-6 х 10 6 наивных CD4 + Т-клеток на мышь. Однако, используя различные штаммы мышей может повлиять на урожайность и производительность. Например, клетки от мышей C57BL / 6 лучше для генерации Th1 клеток, а клетки мышей Balb.c лучше для генерации клеток Th2. - Распространение конечности животного и закрепите их на месте, как показано на рисунке 1. Вырезать кожи длинойitudinally из ануса к подбородку, стараясь при этом не проколоть более глубокие ткани.
- Распространение открыть кожу щипцами и закрепить кожу в месте, чтобы обеспечить свободный доступ к лимфатических узлов, как показано на рисунке 1.
- Урожай доступные лимфатических узлов точках, указанных на рисунке 1. Схватив лимфатический узел с парой щипцов при отделении ткани с другой парой щипцов позволит для легкого удаления. Поместите ткань в коллекции блюдо.
- Урожай селезенки от местоположения, показанного на фиг.1. В этом случае, осторожно резки в брюшину необходимо получить доступ к селезенке. Поместите ткань в коллекции блюдо.
- Повторите процедуру, если больше ткани будут собраны. В противном случае перейдите к следующему шагу. В этот момент, не выполнять все остальные шаги на льду до обшивки из Т-клеток после сортировки.
3. Ткань Обработка и CD4 + Обогащение
- Процесс лимфатические узлы и селезенку в различных блюд, чтобы увеличить выход как препараты клеток лимфатических узлов не требуют эритроцитов лизис, которые могут привести к незначительным лейкоцитов смерти. Таким образом, следующие шаги описывают способ обработки селезенки и лимфатических узлов населения отдельно с последующим объединения до маркировки для сортировки.
- Снимите ткань (селезенка или объединенного лимфатические узлы) в чашке сбора и места в новом 60 мм блюдо с 3 мл PBS +. Поместите квадрат стерильной нейлоновой сетки над ткани с использованием стерильных щипцов.
- Возьмите большой палец сторону поршня шприца (3-10 мл) и осторожно разбить ткань от сетки. Почти все ткани должны идти в суспензии. Кроме того, поместите ткань между двумя автоклавированна матовых горок и измельчают в суспензии.
- Внесите подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить оставшиеся растворимые скопления. Вставьте новую квадратный кусок нейлоновой сетки на открытии15 мл коническую трубку и фильтр суспензии через, чтобы удалить оставшиеся обломки.
- Повторите шаги 2-4 для дополнительной лимфатического узла и селезенки ткани.
- После того, как суспензию фильтруют был в 15 мл пробирку заполнить остальную часть трубы с PBS + и инвертировать несколько раз. Центрифуга клетки при 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Для клеток селезенки, аспирата супернатант После центрифугирования и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл охлажденного льдом 1X ACK раствора на селезенке в течение 1 мин для лизиса эритроцитов. Затем добавляют 10 мл PBS + в верхней части ACK, инвертировать трубку и центрифуги 475 мкг в течение 5 мин при 4 о С.
- Для клеток лимфатических узлов, аспирация супернатант и ресуспендируют в 2 мл PBS +. При желании они могут быть объединены с клеток селезенки после их лизиса АСК и стадии промывки.
- Аспирата супернатант после центрифугирования спленоцитов и ресуспендируют в другом 10 мл PBS +. В этот момент лимфатических узлов подвески может бытьdded в верхней части суспензии селезенки, если ткань объединение требуется для сортировки. Центрифуга трубки снова в 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Осадок клеток теперь могут быть подготовлены для CD4 обогащения. Если этот шаг не будет выполнена, переходите к сортировке, подготовке.
- Для CD4 обогащения с использованием высокоскоростной магнитной системы сортировки клеток, ресуспендируют клеточной шарик бисером CD4. Обычно 15 мкл из бисера разводят в 85 мкл PBS + используется для обозначения тканей от 1 мыши. Нарастить объемы из бисера смеси, когда необходимо, ресуспендируют осадок, и инкубировать в течение 15-30 мин при 4 ° С.
- Промыть клеток с 10 мл PBS +, проходить через суспензию нейлона в новую пробирку 15 мл для удаления мусора, и центрифуга снова в 475 мкг в течение 5 мин при 4 о С.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS + на мышь и перейти к позитивной селекции на высокой скорости сортировочной системы магнитной ячейки. При использовании ручную систему разделения, Follow инструкциям производителя для обогащения. Кроме того, ресуспендируют образцов в FACS буфере: PBS с 1 мМ ЭДТА (рН = 8) и 1% BSA, стерильно фильтруют.
- Снимите положительная дробь и мыть снова 10 мл PBS +. Обогащенный CD4 + фракция теперь готов быть помечены для сортировки.
4. Сортировка наивного CD4 + Т-клетки
- Этикетка осадок клеток с PBS + люминесцентные ртутьсодержащие антитела, направленные против CD62L, CD44, CD25 и CD4. При использовании антител, перечисленных в таблице 1, для каждого разведения предусмотрены. Для окрашивания, объем 100 мкл коктейля антител используется в тканях от одной мыши.
- Ресуспендируют осадок в коктейль антител и инкубировать в течение 15-30 мин при 4 ° С в темноте.
- Вымойте клеток с 10 мл PBS + и центрифуги 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Пропускают смесь через другую нейлоновый фильтр или сотовый фильтра крышку, чтобы повторноперемещать любые остатки мусора. Пипетки меченых клеток в пробирку, который совместим для клеточного сортера. Держите клетки на льду и защищенном от света месте, пока в этом роде.
- Подготовка сбора трубки с помощью пипетки 1-2 мл RPMI полных сред или FBS в нижней части трубок, совместимых для сбора на клеточного сортера.
- Сортировать наивные CD4 + Т-клетки, как CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - население (рис 2). Промыть Собранные клетки с полным RPMI среде и центрифуги, как описано выше.
- Ресуспендируют гранул в полной среде RPMI, рассчитывать наивной клетки, и регулировать концентрацию до 1 × 10 6 клеток / мл.
5. Настройка В пробирке Дифференциация
- Аспирируйте скважин пластин, покрытых анти-CD3 и анти-CD28 и мыть каждую лунку с 1 мл стерильной PBS (без FBS). Для 48-луночных планшетах, пластины 0,5 × 10 6 клеток / лунку в 0,5 мл RPMI. Для 24-луночных планшетах, культуры 1 х 10 6 клеток / лунку в 1,0 мл RPMI.
- Если тестирование влияния фактора, такого как препарат добавить вещество в соответствующие лунки либо до, во время или после процесса дифференцировки в зависимости от эксперимента. Далее, дополнить питательных сред с цитокинами и блокирующих антител соответственно. Th0: 30 Ед / мл ГИП-2. Th1: 15 нг / мл rmIL-12, 30 ед / мл ГИП-2 и 5000 нг / мл 11B11.Th2: 10 нг / мл rmIL-4, 30 ед / мл ГИП-2, 2000 нг / мл растворимого 37,51, и 5000 нг / мл XMG1.2. iTreg: 15 нг / мл hTGFβ, 30 ед / мл ГИП-2, 5000 нг / мл XMG1.2 и 5000 нг / мл 11B11. Th17: 20 нг / мл rmIL-6, 3 нг / мл hTGFβ, 5000 нг / мл XMG1.2 и 5000 нг / мл 11B11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, представленные выше, являются оптимальными для максимизации продукцию цитокинов, измеренная в конце дифференциации эксперимента (Представитель Результаты разделе). Тем не менее, каждое условие должно быть оптимизировано для отдельных лабораторий (таблица 2 - Инкубируйте планшет при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 4-5 d до анализа экспрессии генов и продукции цитокинов. С другой стороны, удалить клетки от стимулов TCR после 2 дней, доводили до 1 × 10 6 клеток / мл свежей средой и пластины в новых скважин (не покрытой оболочкой), чтобы повысить пролиферацию и конечный выход. В этом случае, свежие поляризационные цитокины и антитела не нужны, но должны быть добавлены к новым медиа 10 U / мл IL-2 в течение Th0, Th1, Th2, и iTreg культур.
6. Анализ дифференциации
- Для анализа цитокинов с помощью проточной цитометрии, рестимулировать каждую лунку с 10 нг / мл РМА и 1000 нг / мл иономицина или 1 мкг / мл анти-CD3 в течение 4-6 ч в присутствии ингибитора Гольджи, таких как брефелдин (табл1). Выполните внутриклеточный окрашивание цитокинов в зависимости от эксперимента (рис 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно без Lineage конкретных цитокины или факторы транскрипции, такие как IL-4 (не показан) и IFN & gamma (рис 3) для Th17 культур, для каждого состояния в качестве отрицательного контроля и в качестве показателя эффективности дифференциации. Кроме того, пятно Foxp3 для Th17 культур, как обратной разработки регуляторных Т-клеток может происходить с добавлением TGF-beta. - Для белка количественного, собирать супернатанты из каждой лунки и анализе путем цитокин-специфический ELISA (рис 3). Если есть опасение, что коэффициент тестируемого повлияло пролиферацию по сравнению с контрольными образцами, клетки могут быть промыты, подсчитывали, нормализованное, а затем повторно стимулировали 1 мкг / мл анти-CD3 в течение 24 ч до сбора супернатантов для ИФА. Если опробования IL-4 с Th2 условия, стиральная и restimulating необходимо удалить IL-4, которые могут быть лeftover от начальной дифференцировки культуры.
- Для анализа экспрессии генов с ПЦР в реальном времени, урожай клеток после инкубационного периода, мыть, нормализуют, и вновь стимулировать 2-6 ч с 1 мкг / мл анти-CD3 до уборки мРНК (рис 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Момент времени для анализа дифференциации может изменяться в зависимости от состояния Th быть проверены, а также прочности активации Т-клеточного рецептора. После 2-3 дней дифференциации, клетки могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, чтобы определить степень пролиферации Т-клеток. Скважины, обладающие обширным пролиферацию и слипания клеток, скорее всего, будет готов для анализа на 4 день условиях дифференцировки, опираясь на добавлением экзогенного IL-2, такие как Th1 и Th2, скорее всего, исчерпывают носитель после 4 дней в культуре. Чтобы максимизировать производство цитокинов, таких скважин с истощенных средах может быть пополнена свежей RPMI, содержащей IL-2, или подсчитывают и повторно высевали при 1 × 10 6 клеток на лунку в свежей среде RPMI, содержащей IL-2, чтобы расширить дифференциацию на другой день или два с помощью этого метода.
Figurе 1. Иллюстрация размещения булавку, чтобы исправить мышь для выделения селезенки и лимфатических узлов. () Распространение конечности друг от друга и закрепите их с помощью стерильной иглы или вскрытия булавки. С этой позиции, вырезать мех и кожу в продольном направлении от хвоста до подбородка. (B) После резки, аккуратно развести кожу на части, чтобы разоблачить лимфатические узлы, как показано на рисунке. Места расположения лимфатических узлов, которые легко доступны из этого положения приведены на рисунке. Селезенка находится прямо под грудной клеткой с правой стороны животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Представитель сортировки стратегия для выделения наивного CD4 + Т-клеток сортировки клеток. Начиная с верхнего левого угла, лимфоциты первый закрытый по размеру, а затем синглет клетки отличить от дублета клеток. Память на синглетами показывает население CD4 + CD25 + клеток, которые nTregs. Ворота на CD4 + CD25 - популяции, а затем сортировать наивной (CD62L + CD44 -) от исполнительного / памяти (CD62L - CD44 +) CD4 + клеток. Пунктирные линии показывают ворота происхождение следующей участка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. выборочных данных после в пробирке Th дифференциации. () IntracДанные ellular окрашивания цитокинов (закрытых на CD4 +) от Th1, Th2, iTreg и Th17 дифференциации. Как правило, не-предшественники специфических цитокинов, таких как IL-4 и IFN & gamma для Th17 культур, должны быть окрашены, чтобы определить качество дифференциации. Данных (B), ELISA следующие четыре D Th дифференцировки, мойки, и 24 ч повторной стимуляции клеток с 1 мкг / мл анти-CD3. (С) ПЦР в реальном времени данных клона конкретных факторов транскрипции следующих 4 дней дифференцировку и рестимуляцию в течение 4 ч с 1 мкг / мл анти-CD3. Все генные величины были нормализованы к выражению β-актина и мРНК из недифференцированных наивные Т-клетки служат в качестве основы для генной экспрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Таблица 1. См материалы Таблица ниже.
| Реагент | Рекомендуемая титрования Диапазон |
| Цитокины: | |
| Человек (ч) IL-2 | 5 ед / мл - 50 Ед / мл |
| rmIL-4 | 5 нг / мл - 30 нг / мл |
| rmIL-6 | 5 нг / мл - 30 нг / мл |
| rmIL-12 | 10 нг / мл - 30 нг / мл |
| hTGFb (Th17) | 0,1 нг / мл - 5 нг / мл |
| hTGFb (iTreg) | 5 нг / мл - 30 нг / мл |
| Антитела: | |
| 2C11 (анти-CD3) | 500 нг / мл - 5000 нг / мл |
| 37,51 (анти-CD28) | 250 нг / мл - 2500 нг / мл |
| 11B11 (анти-IL-4) | 5000 - 10000 нг / мл |
| XMG1.2 (анти-IFNg) | 5000 - 10000 нг / мл |
Таблица 2. Рекомендуемые титрования диапазон для оптимизации дифференциации условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как селезенка содержит наивные Th клетки, доля этой группы населения в лимфатических узлах гораздо выше. Неправильное выявление и устранение лимфатических узлов в этом протоколе приведет к плохим выходом наивных клеток. Это может быть особенно трудно у пожилых мышей и мышей-самцов, которые имеют более жировой ткани. Как показано на фиг.1, соответствующую фиксации и закреплению конечностей животного и кожи позволит легче визуализации доступных наружных лимфатических узлов. После того, как лимфатические узлы и селезенка, обрабатываются, сортировка клеток является предпочтительным методом получения высокоочищенного наивным CD4 + Т-клеточной популяции. Чистота имеет решающее значение для предотвращения nTregs или эффектора и память Th клеток из влияния на наивный процессы дифференцировки клеток. Трудности в получении высоких урожаев наивных Т-клеток, как правило, вызваны неэффективной сбора и обработки или потери клеток тканей во время стадий разделения. Для повышения урожайности макияж SЮр обрабатывать клетки с использованием холодных буферы и инкубации на льду. Кроме того, чтобы предотвратить потерю клеток в процессе обогащения и / или сортировки, оптимизации реагентов и протоколов разделения Рекомендуется заранее. И, наконец, как уже упоминалось в различных точках этапов протокола, условия дифференциации должны быть оптимизированы для отдельных лабораторий перед выполнением больших масштабах экспериментов (таблица 2).
Как показано на рисунке 2, наивные CD4 + Т-клетки могут быть легко отличить от nTreg (CD4 + CD25 +) и эффектов (CD4 + CD44 + CD62L -) населения. Сортировка является одним из самых надежных способов предотвращения загрязнения эффекторных Th подмножеств, которые также существуют в селезенке и лимфатических узлах. Загрязнение Treg при дифференциации может привести к подавлению активации, а также продукции цитокинов. Загрязнение другой эффектор Th подмножеств может привести кпродукция цитокинов, которые ингибируют развитие нужных Th линий. Сортировка объекта сборы могут быть дорогими, а некоторые считают, что легче для обогащения CD4 + Т-клеток магнитной сепарации, чтобы сократить время на сортировку, как описано в данном протоколе. В отсутствие сортировщика, некоторые компании сейчас предлагают наборы разделения, разработанные специально для изоляции наивных CD4 + Т-клеток. Тем не менее, чистота населения всегда должны быть проверены после отделения, аналогично отсортированных образцов. Нахождение низкой частоте наивных CD4 + Т-клеток (CD62L +) по сравнению с памяти / эффекторных клеток (CD44 -) может указывать на проблемы с помощью мыши, такие как инфекции или опухоли. В этом случае клетки не должны использоваться для этого типа эксперимента.
Есть довольно много способов, чтобы определить эффективность Th дифференциации. Анализ Белок традиционно осуществляется цитокинов пятноING, которая даст представление о процентах наивных клеток, которые были поляризованного к определенному роду (рис 3). Количественную оценку белка в ELISA также полезным инструментом для определения общей суммы цитокинов выбрасывается в средствах массовой информации. Предостережение с анализом ELISA белка, однако, что сравнение результатов между экспериментальными группами может быть трудно, если определенный фактор проходят испытания оказывает влияние на пролиферацию и выживание. В этом случае общее число клеток, продуцирующих цитокины могут быть разными между группами в конце эксперимента. Таким образом, нормализации подсчет клеток и restimulating в течение короткого периода времени (например, анти-CD3 в течение 24 ч), необходимо получить соответствующие результаты. Кроме того, ИЛ-4 используется в качестве поляризующей фактора для генерации множества Th2, так что эти клетки должны быть вымыты, нормализованное, и повторно стимулировали до выполнения ELISA для IL-4. Анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени полезно не только Fили анализ транскрипции генов цитокинов, но также и для клона конкретных факторов транскрипции (фиг.3). Таким образом, в зависимости от эксперимента, существуют различные способы анализа эффективности Th дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Рейнольдса, при Розалинд Франклин университета медицины и науки, а также лабораторию Чен Донг в Университете Техаса MD Anderson онкологическом центре для оптимизации этого протокола. Эта работа была поддержана грантом на JMR из Национального института здоровья (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
