Introduction
Het concept van de verschillende geslachten of subsets van CD4 + T-helper (Th) cellen is al sinds de tweede helft van de 20 e eeuw 1 geweest. Erkenning van verwant antigeen in de aanwezigheid van co-stimulerende signalen resulteert in verschillende rondes van cellulaire proliferatie en de uiteindelijke differentiatie naar effector Th cellen. Het type van de cel die tijdens dit proces is afhankelijk van het cytokine milieu aanwezig tijdens activering 2. Aanvankelijk werden naïeve Th-cellen vermoedelijk polariseren in 2 verschillende lineages na T cel receptor (TCR) activatie costimulatoire CD28 ligatie, en cytokine signalering. Type 1 helpercellen (Th1) worden gekenmerkt door hun effector productie van het cytokine IFNy en hun behoefte aan IL-12 signalering tijdens het differentiatieproces 3,4. Uiteindelijk werd ontdekt dat gedifferentieerde Th1 cellen een genetisch profiel meest kenmerkend wordt gekarakteriseerd by de expressie van het T-box familie transcriptiefactor Tbx21 (T-bet), die als de regulering van het Th1 genetische programma 5. Bovendien, IL-12 en IFNy kan bevorderen T-bet-expressie 6,7. In de immuunrespons, Th1 cellen zijn belangrijk voor de afweer tegen intracellulaire pathogenen en sterke promoters van auto-ontsteking. Daarentegen type 2 helper cellen (Th2) vereist IL-4 voor hun ontwikkeling en effector cytokinen, zoals IL-4, IL-5 en IL-13, zijn belangrijk voor het besturen B-cel responsen en pathogeen allergie 8, 9. Vergelijkbaar met Th1-cellen, werden Th2-cellen gevonden om hun eigen meester transcriptionele regulator te uiten, genoemd GATA-3 10,11. Interessant is dat de aanwezigheid van polariserende cytokinen en het genereren van een specifieke Th lijn zijn antagonistisch voor de ontwikkeling van andere 2,12 suggereert dat slechts een bepaald Th subgroep dominant kan worden tijdens een immuunrespons rerespons.
Aangezien de selectie van de Th1 en Th2 lineages, verder werk nog unieker subsets van T-helpercellen, waaronder folliculaire helper (TFH), IL-9-producerende (Th9) en IL-22-producerende (Th22) (onlangs aangetoond beoordeeld in 13). Voor de in vitro differentiatie experimenten dit protocol alleen richten op twee extra Th subsets, zogenaamde regulatoire T-cellen (Treg) en IL-17 producerende CD4 + T-cellen (Th17). CD25 + regulerende T-cellen kan natuurlijk (nTreg) in de thymus voorkomt; naïeve Th-cellen kunnen worden geïnduceerd (iTreg) de regelgeving in de periferie (beoordeeld in 14,15) worden. Beide Tregs drukken een karakteristiek transcriptiefactor, genaamd forkhead box P3 (Foxp3), die essentieel is voor de onderdrukking effector mechanismen oplosbare anti-inflammatoire mediator productie, IL-2 consumptie en cel contact-afhankelijke mechanismen 14,15 omvatten. Het gebrek aan foxp3 de expressie leidt tot een ernstige meerdere organen autoimmuun afwijking genoemd immuun ontregeling, polyendocrinopathy, enteropathie, X-gebonden syndroom (IPEX), waaruit de kritische rol van deze Th subset oplossen ontsteking en reguleren perifere tolerantie voor zelf-antigenen 16. In vitro naïeve CD4 + T-helpercellen up-reguleren Foxp3 en worden toegewijd aan het Treg programma bij stimulatie met IL-2 en TGF-β 14,15. Er kan matig aanzienlijke plasticiteit in CD4 + T-cellijnen zijn vooral voor de bespreking slechts cytokineproductie (beoordeeld in 17,18). Voor de toepassing van in vitro differentiatie protocollen zullen we bespreken elke subset als uniek afstamming.
Onlangs is een subset van Th17 cellen die de IL-17 cytokine productie werd geïdentificeerd als een unieke lijn met pro-inflammatoire functies die bijzonder pathogene auto-inflammatie tijdens 19-21. Th17 cellen brengen een unieke transcriptiefactor, genaamd-retinoid gerelateerde weesreceptor gamma t (RORγt) dat de Th17 genetische programma 22 coördineert. TGFp is belangrijk voor het genereren van Th17 lijn door de inductie van RORγt. Echter, het effect van TGFP signalering aangenomen alleen Th17 engagement induceren bij synergizing met IL-6 (besproken in 12). Verdere studies hebben aangetoond dat een verscheidenheid van andere signalen die positief kan regelen Th17 engagement, waaronder IL-1β, verhoogde natrium- en TLR signalering 23-26. Andere rapporten hebben gesuggereerd dat de pathogene Th17 cellen in vivo zijn degenen die daadwerkelijk omzeilen TGFp signalering en erop te vertrouwen een combinatie van IL-1, IL-6 en IL-23 voor hun differentiatie 27. Aldus kan Th17 cellen afgeleid van een verscheidenheid van signaaltransductiewegen; voor de toepassing van dit protocol, de algemeen gebruikte (TGF en IL-6) route voor Th17 lineage inzetzal worden gepresenteerd.
De differentiatie protocollen hieronder beschreven voor effector lineages voert vaste antilichaam stimuli voor de TCR en CD28 gedurende het gehele verloop van het experiment. Echter, hebben anderen aangetoond dat TCR activering met antigeen presenterende cellen 28 of verknoping anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen met hamster antilichaam gedurende 2 dagen 29 zijn ook zeer effectief middel induceren van de productie van verschillende subsets Th. De hier gepresenteerde protocol gebaseerd op eerder gerapporteerde methoden voor het isoleren van muizen-CD4 + T-cellen van secundaire lymfoïde organen 30 en het genereren Th17 cellen 31. Een belangrijk verschil is dat dit protocol gebaseerd op het gebruik van een cell sorter om naïeve CD4 + T-cellen geïsoleerd uit lymfoïde weefsels. Veel bedrijven bieden nu snelle scheiding kits die kunnen verrijken naïeve CD4 + T-cellen, die in staat zijn om de vereiste f omzeilenof sorteren afhankelijk van het experiment. De methoden en reagentia die in dit protocol zijn wat we routinematig gebruiken en vind het meest effectief te zijn. Echter, in gedachten houden dat alternatieve reagentia en methodologieën bestaan voor veel van de stappen die hieronder gepresenteerd en het is aan de individuele lab om te bepalen wat het beste werkt voor hun doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures worden uitgevoerd met behulp van protocollen door het kantoor van milieu, gezondheid en veiligheid op het Rosalind Franklin University of Medicine and Science goedgekeurd. C57BL / 6 muizen (gekocht van NCI) gebruikt voor dit protocol werden gehuisvest onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, en alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd met behulp van protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd op de Rosalind Franklin Universiteit van Geneeskunde en wetenschap.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Supplies, en reagentia
- Coat 48 putjes of 24 putjes met anti-CD3 en anti-CD28 (Tabel 1) in steriele PBS, deksel en verpakken in parafilm verdamping en besmetting te voorkomen, en vervolgens geïncubeerd O / N bij 4 ° C de dag voordat T celisolatie. Als alternatief jas putten 1 uur bij 37 o C. Voer Th0, Th1, Th2 en iTreg omstandigheden door bekleding zowel anti-CD3 en anti-CD28 bij 1 ug / ml in 0,5-1 mlTal volume (48-well plaat). Voor Th17, wij doorgaans laag anti-CD3 bij 2 ug / ml en anti-CD28 bij 1 ug / ml.
OPMERKING: Wij hebben gevonden dat een lagere anti-CD3 concentratie optimaal voor Th1, Th2 en iTreg, terwijl ze een hogere anti-CD3 concentratie optimaal voor Th17 genereren. Daarom moet anti-CD3 en anti-CD28 concentraties worden getitreerd en geoptimaliseerd voor elk laboratorium (tabel 2). - Steriliseren een set van dissectie instrumenten (schaar en pincet) door autoclaaf of desinfecterende oplossing. Een buis of een klein bekerglas met 70% ethanol nodig zal zijn voor snelle sterilisatie van instrumenten tussen dissecties. Uiteindelijk zal een spuitfles met 70% ethanol nodig voor het steriliseren van het oppervlak van de muis vóór versnijding.
- Bereid een dissectie oppervlak door het wikkelen van een plat stuk piepschuim of prikbord in aluminiumfolie. Opheldering pinnen of naalden worden gebruikt om het dier vast te zetten.
- Bereiden gerechten of platen voor het verzamelen van tissues. Als het bundelen van weefsels, aparte 60mm gerechten met 3 ml steriele PBS + 1% FBS (PBS +) voor de milt en lymfeklieren weefsels is voldoende. Als het houden van weefsels van individuele muizen scheiden, bereiden een 24-wells plaat met 1 ml PBS + in het gewenste aantal putten.
- Bereid compleet RPMI media voor celkweek en pre-warm voor gebruik (tabel 1).
OPMERKING: We routinematig gebruik RPMI maar andere media zoals IMDM en DMEM kunnen even effectief of hoger afhankelijk van het laboratorium en het experiment. - Cut 2x2 cm vierkantjes van nylon gaas met 120 urn poriegrootte en autoclaaf te steriliseren (tabel 1).
- Optioneel: als u de high-speed magnetische cel sorteersysteem zoals AutoMACS voor CD4 + cel verrijking, pre-warm stromend en spoelen buffers in een 37 o C waterbad om schade aan de machine te voorkomen.
- OPMERKING: verrijking wordt aanbevolen om het sorteren opbrengst verhogen en de sorteertijd.
- Allebereidingsstappen, behalve dissectie, moet worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap.
2. Isolatie van de lymfeklieren en de milt van Muizen
- Euthanaseren het gewenste aantal dieren met een institutioneel goedgekeurd techniek. Gebruik C57BL / 6 vrouwelijke muizen, 5-10 weken oud, vanwege hun hoge percentage naïeve T-cellen en minder lichaamsvet in vergelijking met mannen of oudere muizen.
OPMERKING: Cellen afkomstig van mannelijke muizen zullen ook optreden in vitro en het protocol stappen blijven dezelfde. Vrouwelijke muizen, 5-10 weken oud, zal typisch opbrengst 3-6 x 10 6 naïeve CD4 + -T-cellen per muis. Echter, kunnen volgens verschillende muizenstammen opbrengst en prestaties beïnvloeden. Bijvoorbeeld, cellen van C57BL / 6 muizen zijn beter voor het genereren van Th1 cellen terwijl cellen van Balb.c muizen zijn beter voor het genereren van Th2 cellen. - Spreid de poten van het dier en zet ze op hun plaats zoals getoond in figuur 1. Snijd de huid langeitudinally van de anus tot aan de kin, terwijl dat evenwel niet tot diepere weefsel te doorboren.
- Spreid de huid met tang geopend en speld de huid in plaats gemakkelijke toegang tot lymfeklieren mogelijk zoals weergegeven in figuur 1.
- Oogst de toegankelijke lymfeknopen van de in figuur 1 plaatsen. Grijpen de lymfeklier met een pincet terwijl scheiden weefsel met een pincet is gemakkelijk te verwijderen. Plaats het weefsel in de opvangschaaltje.
- Oogst de milt van de in figuur 1 plaats. In dit geval wordt het nauwkeurig snijden in het peritoneum die de bereikbaarheid van de milt te winnen. Plaats het weefsel in een verzameling schotel.
- Herhaal deze procedure als er meer weefsels zal worden geoogst. Anders gaat u verder met de volgende stappen. Op dit moment voert alle overige stappen op ijs tot de beplating van de T-cellen na sortering.
3. Weefsel bewerken en CD4 + Verrijking
- Verwerk de lymfeklieren en milt verschillende gerechten op het rendement lymfeknoop cel preparaten erytrocyten lysis vereisen, wat kan resulteren in kleine leukocyten dood verhogen. Daarom is de volgende stappen beschrijven een werkwijze voor het verwerken milt en lymfeklieren populaties afzonderlijk gevolgd door het combineren vóór labeling voor het sorteren.
- Verwijder het weefsel (milt of gepoolde lymfeklieren) uit de collectie schaaltje en plaats in een nieuwe 60 mm schotel met 3 ml PBS +. Plaats een vierkant van steriele nylon met een gesteriliseerde pincet gaas over het weefsel.
- Neem de duim zijde van een zuiger (3-10 ml) en voorzichtig smash het weefsel tegen het gaas. Vrijwel alle weefsels moet gaan in suspensie. Als alternatief kunt u het weefsel tussen twee geautoclaveerd mat glijbanen en vermalen tot schorsing.
- Pipet de schorsing op en neer een paar keer te breken van de resterende oplosbare bosjes. Plaats een nieuw vierkant stuk nylon gaas over de opening van een15 ml conische buis en filtreer de suspensie door de resterende vuil te verwijderen.
- Herhaal stap 2-4 voor extra lymfeklieren en milt weefsel.
- Wanneer de opschorting is gefilterd in een 15 ml buis vul de rest van de buis met PBS + en meerdere malen zwenken. Centrifugeer de cellen bij 475 g gedurende 5 min bij 4 ° C
- Voor de miltcellen, zuig de supernatant na centrifugeren en resuspendeer de celpellet in 1 ml ijskoude 1X ACK oplossing per milt gedurende 1 min erytrocyten te lyseren. Voeg vervolgens 10 ml PBS + bovenop de ACK, draai de buis en centrifugeer 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C
- Voor lymfkliercellen, zuig de supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS +. Desgewenst kunnen deze worden gecombineerd met de miltcellen na ACK lysis en wasstap.
- Zuig de supernatant na centrifugeren van de splenocyten en resuspendeer in een 10 ml PBS +. Op dit punt kan de lymfeklier schorsing eenT OEGEVOEGDE bovenop de milt suspensie als weefsel pooling vereist voor het sorteren. Centrifugeer de buis opnieuw bij 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C
- De celpellet kan nu worden voorbereid CD4 verrijking. Als deze stap niet wordt uitgevoerd, ga dan naar het sorteercentrum voorbereiding stappen.
- Voor CD4 verrijking met behulp van de high-speed magnetische cel sorteersysteem, resuspendeer de cellulaire pellet met CD4 kralen. Typisch 15 gl kralen verdund in 85 pi PBS + wordt gebruikt om de weefsels label van 1 muis. Ramp het volume van de kraal mengsel behoefte, resuspendeer de pellet en incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C
- Was de cellen met 10 ml PBS +, passeert de suspensie door nylon in een nieuwe buis van 15 ml om vuil en centrifugeer opnieuw bij 475 xg verwijderen gedurende 5 minuten bij 4 ° C
- Resuspendeer de pellet in 100 ul PBS + per muis en ga verder met positieve selectie op de high-speed magnetische cel sorteersysteem. Bij gebruik van een handmatige scheiding systeem, folg de instructies van de fabrikant voor verrijking. Alternatief resuspendeer de monsters in FACS buffer: PBS met 1 mM EDTA (pH = 8) en 1% BSA, steriel-gefiltreerd.
- Verwijder de positieve fractie en was opnieuw met 10 ml PBS +. De verrijkte CD4 + fractie is nu klaar voor het sorteren worden geëtiketteerd.
4. sorteren Naïeve CD4 + T-cellen
- Label de celpellet met PBS + met fluorescente antilichamen gericht tegen CD62L, CD44, CD25 en CD4. Bij gebruik van de in tabel 1 vermelde antilichamen, worden verdunningen voor elk ontvangen. Voor kleuring wordt een volume van 100 ul van het antilichaam cocktail gebruikt per weefsel van een muis.
- Resuspendeer de pellet in antilichaam cocktail en incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met 10 ml PBS + en centrifugeer 475 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C
- Passeert het mengsel over een ander nylon filter of cel zeefdop opnieuwbewegen overgebleven puin. Pipetteer de gelabelde cellen in een buis die geschikt voor de cel sorter is. Houd cellen op ijs en beschermd tegen het licht tot de soort.
- Bereid verzamelbuizen pipetteren 1-2 ml van volledig RPMI media of FBS onder in buizen geschikt voor het verzamelen van een celsorteerder.
- Sorteer de naïeve CD4 + T-cellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - populatie (Figuur 2). Was de verzamelde cellen met volledige RPMI media en centrifugeren zoals boven beschreven.
- Resuspendeer de pellet in volledige RPMI, tellen de naïeve cellen, en de concentratie aan te passen aan 1 x 10 6 cellen / ml.
5. Opstellen van de in vitro differentiatie
- Zuig de putjes van de anti-CD3 en anti-CD28 beklede platen en wassen elk putje met 1 ml steriele PBS (zonder FBS). Voor 48-well platen, plaat 0,5 x 10 6 cellen / putje in 0,5 ml RPMI. Voor 24-well platen, cultuur 1 x 10 6 cellen / putje in 1,0 ml RPMI.
- Bij het testen van de invloed van een factor zoals een geneesmiddel voeg de stof de geschikte putjes vóór, tijdens of na het differentiatieproces afhankelijk van het experiment. Vervolgens vullen de cultuur media met cytokines en blokkerende antilichamen dienovereenkomstig. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2, en 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml oplosbaar 37,51, en 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 en 5000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 en 5000 ng / ml 11B11.
Opmerking: De hierboven weergegeven omstandigheden werden optimaal gevonden voor het maximaliseren cytokineproductie gemeten aan het einde van de differentiatie experiment (Representatieve resultaten sectie) zijn. Wel moet elke voorwaarde worden geoptimaliseerd voor elk laboratorium (tabel 2 - Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-5 dagen voorafgaand aan de analyse van genexpressie en cytokineproductie. Als alternatief, verwijder de cellen van de TCR stimuli na 2 d, aangepast tot 1 x 10 6 cellen / ml met vers medium, en de plaat in nieuwe putten (niet-gecoat) om proliferatie en uiteindelijke opbrengst te verbeteren. In dit geval wordt vers polariserende cytokines en antilichamen niet noodzakelijk maar 10 U / ml IL-2 zou nieuwe media worden toegevoegd Th0, Th1, Th2 en iTreg culturen.
6. Analyse van differentiatie
- Voor cytokine analyse door flowcytometrie, restimulate elk putje met 10 ng / ml PMA en 1000 ng / ml ionomycine of 1 ug / ml anti-CD3 gedurende 4-6 uur in de aanwezigheid van een golgi remmer zoals Brefeldine A (Tabel1). Voer intracellulaire cytokine kleuring afhankelijk van het experiment (figuur 3).
OPMERKING: Stain niet-afstammings-specifieke cytokinen of transcriptiefactoren, zoals IL-4 (niet getoond) en IFNy (Figuur 3) voor Th17 culturen voor elke voorwaarde als negatieve controles en als indicator van differentiatie efficiency. Bovendien kunnen vlekken Foxp3 voor Th17 culturen als de reciproke ontwikkeling van Tregs optreden met de toevoeging van TGFp. - Voor eiwit kwantificering, verzamel de supernatanten van elk putje en assay van cytokine-specifieke ELISA (figuur 3). Als er bezorgdheid dat de factor geteste proliferatie beïnvloed vergeleken met controlemonsters, kunnen de cellen worden gewassen, geteld, genormaliseerd en vervolgens opnieuw gestimuleerd met 1 ug / ml anti-CD3 gedurende 24 uur voor het verzamelen van supernatanten van ELISA assays. Bij testen IL-4 van Th2 omstandigheden wassen en restimulating moet IL-4 verwijdert die liter wordeneftover vanaf de eerste differentiatie cultuur.
- Voor analyse van genexpressie door real time PCR, oogst cellen na de incubatieperiode, wassen, normaliseren en opnieuw gestimuleerd voor 2-6 uur met 1 ug / ml anti-CD3 voor het oogsten mRNA (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De tijd voor de analyse van differentiatie kan variëren naargelang de Th aandoening en getest als de sterkte van T-cel receptor activatie. Na 2-3 dagen van differentiatie, kunnen cellen worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie om de mate van T-celproliferatie. Wells vertonen uitgebreide proliferatie en klontering van cellen zal waarschijnlijk klaar voor analyse op dag 4. Differentiation voorwaarden beroep op de toevoeging van exogeen IL-2, zoals Th1 en Th2, de media waarschijnlijk uitgeput na 4 dagen in kweek. Cytokine productie te maximaliseren, kunnen dergelijke putjes uitgeputte media aangevuld met vers RPMI bevattende IL-2 of geteld en opnieuw uitgeplaat bij 1 x 10 6 cellen per putje in vers RPMI bevattende IL-2 bij de differentiatie verlengen andere dag of twee met deze methode.
Figure 1. Illustratie van pin plaatsing om een muis vast te stellen voor de isolatie van milt en lymfeklieren. (A) Spreid de benen uit elkaar en zet ze vast met een steriele naald of dissectie pin. Vanuit deze positie, snijd de vacht en de huid in de lengte van de staart tot aan de kin. (B) Na het snijden, zachtjes verspreid de huid uit elkaar om de lymfeklieren bloot, zoals getoond in de afbeelding. De locaties van de lymfeklieren die gemakkelijk toegankelijk zijn vanuit deze positie worden weergegeven in de afbeelding. De milt ligt net onder de ribbenkast aan de rechterkant van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve sorteren strategie voor het isoleren van naïeve CD4 + T-cellen door celsortering. Vanaf linksboven, lymfocyten worden eerst gated op grootte en dan singlet cellen worden onderscheiden van een doublet cellen. Gating op singlets onthult een populatie van CD4 + CD25 + cellen die zijn nTregs. Poort aan de CD4 + CD25 - bevolking en dan soort naïeve (CD62L + CD44 -) van de effector / geheugen (CD62L - CD44 +) CD4 + cellen. Gestippelde lijnen geven de poort oorsprong van de volgende plot. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Voorbeeld data na in vitro Th differentiatie. (A) Intracellular cytokine kleuring gegevens (gated op CD4 +) van Th1, Th2, iTreg en Th17 differentiaties. Typisch non-lineage specifieke cytokinen, zoals IL-4 en IFNy voor Th17 culturen worden gekleurd om de kwaliteit van de differentiatie bepalen. (B) ELISA gegevens na 4 d Th differentiatie, wassen en 24 uur herstimulatie cellen met 1 ug / ml anti-CD3. (C) Realtime PCR-gegevens van afstammings-specifieke transcriptiefactoren volgende 4 d differentiatie en herstimulatie gedurende 4 uur met 1 ug / ml anti-CD3. Alle gen hoeveelheden werden genormaliseerd om de expressie van β-actine en mRNA van ongedifferentieerde naïeve T-cellen dienen als de basis voor genexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1. Zie Materialen tabel.
| Reagens | Aanbevolen titratie Range |
| Cytokines: | |
| Human (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antilichamen: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37.51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5000 - 10.000 ng / ml |
Tabel 2. Titratie aanbevolen bereik voor de optimalisatie van differentiatie voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de milt bevat naïeve Th-cellen, het aandeel van deze populatie in lymfeklieren veel hoger. Niet lymfeklieren goed te identificeren en verwijderen dit protocol zal resulteren in een slechte opbrengst van naïeve cellen. Dit kan in oudere muizen of mannelijke muizen die meer vetweefsel bijzonder moeilijk. Zoals getoond in figuur 1, stevige bevestiging en pinning van de ledematen en dierlijke huid zal gemakkelijker visualisatie van de buitenzijde toegankelijke lymfeknopen. Zodra lymfeklieren en milt worden verwerkt celsortering is de geprefereerde methode om een sterk gezuiverde naïeve CD4 + T-celpopulatie. Zuiverheid is van cruciaal belang voor nTregs of effector en geheugen Th-cellen voorkomen dat het beïnvloeden van de naïeve celdifferentiatie proces. Moeilijkheden bij het verkrijgen van een hoge opbrengst van naïeve T-cellen worden meestal veroorzaakt door inefficiënte weefsel inzameling en verwerking of verlies van cellen tijdens de scheiding stappen. Om de opbrengst make s verhogenure om de cellen te verwerken met behulp van koude buffers en incubatie op ijs. Bovendien, om verlies van cellen tijdens verrijking en / of sorteren voorkomen optimaliseren reagentia en scheiding protocollen vooraf wordt aanbevolen. Tenslotte, zoals vermeld op verschillende punten in het protocol stappen differentiatie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor elk laboratorium voordat grootschalige experimenten (Tabel 2).
Zoals getoond in figuur 2, naïeve CD4 + T-cellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van de nTreg (CD4 + CD25 +) en effector (CD4 + CD44 + CD62L -) populaties. Sorteren is een van de meest betrouwbare manier om verontreiniging van effector Th subsets voorkomen, die eveneens in de milt en lymfeklieren. Treg besmetting tijdens de differentiatie kan leiden tot onderdrukking van activatie en cytokine productie. Besmetting van andere effector Th subsets kan resulteren inde productie van cytokines die remmend zijn voor de ontwikkeling van gewenste Th geslachten zijn. Sorteerinrichting kosten kan duur zijn en sommigen vinden dat het gemakkelijker te verrijken voor CD4 + T-cellen door magnetische scheiding bezuinigen op sorteertijd zoals beschreven in dit protocol. Bij afwezigheid van een sorteerder, sommige bedrijven bieden nu scheiding kits speciaal ontworpen voor de isolatie van naïeve CD4 + T-cellen. De zuiverheid van de populatie moet altijd gecontroleerd na scheiding Soortgelijke gesorteerd monsters. De vondst van een lage frequentie van naïeve CD4 + T-cellen (CD62L +) in vergelijking met het geheugen / effector cellen (CD44 -) een probleem met de muis aangeven zoals een infectie of tumor. In dit geval de cellen niet worden gebruikt voor dit type experiment.
Er zijn heel wat manieren om de effectiviteit van Th differentiatie te bepalen. Eiwit analyse wordt traditioneel uitgevoerd door cytokine vleking, die een beeld van het percentage naïeve cellen die zijn gepolariseerd om een specifieke lijn geeft (figuur 3). Eiwit kwantificering door ELISA is ook een nuttig instrument om te bepalen van de totale hoeveelheid cytokinen vrijkomen in de media. Het nadeel met ELISA eiwitanalyse echter dat vergelijking van de resultaten tussen experimentele groepen moeilijk kan zijn als een bepaalde factor getest heeft invloed op proliferatie en overleving. In dit geval kan het totale aantal cellen die cytokines verschillend tussen groepen aan het einde van het experiment. Aldus normaliseren het celgetal en restimulating voor een korte periode (bijvoorbeeld anti-CD3 gedurende 24 uur) moeten passende resultaten te verkrijgen. Bovendien, IL-4 wordt gebruikt als een polariserend element voor het genereren van de Th2 deelverzameling, zodat deze cellen worden gewassen, genormaliseerd en opnieuw gestimuleerd voor het uitvoeren van een ELISA voor IL-4. Genexpressie analyse van real-time PCR is niet alleen nuttig fof de analyse van cytokine gentranscriptie, maar ook afstammings-specifieke transcriptiefactoren (figuur 3). Dus, afhankelijk van het experiment, zijn er verschillende manieren om de effectiviteit van de Th differentiatie te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle leden van de Reynolds lab aan Rosalind Franklin Universiteit van Geneeskunde en Wetenschap, en de Chen Dong lab aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center bedanken voor de optimalisatie van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan JMR van de National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
