Introduction
Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 + T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 e siècle 1. Reconnaissance de l'antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l'environnement de cytokines présentes lors de l'activation 2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TCR) d'activation, co-stimulation CD28 ligation et la signalisation des cytokines. 1 des cellules auxiliaires de type Th1 () sont caractérisées par leur production de la cytokine effectrice IFNy ainsi que leur exigence pour l'IL-12 au cours de la signalisation de 3,4 processus de différenciation. Finalement, il a été découvert que les cellules Th1 différenciées ont un profil génétique qui se caractérise plus distinctement by l'expression de la boîte de T facteur de transcription de la famille, Tbx21 (T-bet), qui est considéré comme le régulateur maître du programme génétique Th1 5. En outre, l'IL-12 ainsi que IFN peut favoriser l'expression T-bet 6,7. Dans la réponse immunitaire, les cellules Th1 sont importants pour la défense de l'hôte contre les pathogènes intracellulaires ainsi que des promoteurs forts de l'inflammation auto-immune. En revanche, les cellules de type 2 auxiliaires (Th2) nécessitent l'IL-4 pour leur développement et leur cytokines effectrices, y compris l'IL-4, IL-5 et IL-13, sont importantes pour entraîner des réponses de lymphocytes B et sont pathogènes dans l'allergie 8, 9. Semblables à des cellules Th1, Th2 ont été trouvés pour exprimer leur propre régulateur maître de transcription, appelé GATA-3 10,11. Fait intéressant, la présence de cytokines polarisantes et la génération d'une lignée Th spécifique sont antagonistes à l'élaboration d'autres 2,12, ce qui suggère que seul un sous-ensemble particulier Th peut devenir dominante au cours d'une re immunitaireréponse.
Depuis l'identification des lignées Th1 et Th2, d'autres travaux ont démontré sous-ensembles encore plus unique de cellules T auxiliaires, y compris folliculaire aide (TFH), IL-9-production (Th9), et IL-22-production (TH22) (récemment en revue dans 13). Aux fins d'expériences in vitro de différenciation, ce protocole se concentrer uniquement sur deux sous-ensembles Th supplémentaires, appelés cellules T régulatrices (Treg) et les cellules T CD4 + IL-17-production (Th17). cellules T régulatrices CD25 + peuvent se produire naturellement (nTreg) dans le thymus; cellules Th naïves peuvent également être induites (iTreg) pour devenir réglementaire dans la périphérie (revue dans 14,15). Les deux types de Tregs expriment un facteur de transcription caractéristique, appelé boîte forkhead P3 (Foxp3), ce qui est essentiel pour leurs mécanismes de suppression effectrices qui incluent la production soluble anti-inflammatoire médiateur, IL-2 la consommation, et la cellule mécanismes de contact dépendant 14,15. Le manque de Foxp3 résultats d'expression dans un grave, plusieurs organes trouble auto-immune appelés dysrégulation immunitaire, polyendocrinopathie, entéropathie, le syndrome lié à l'X (IPEX), démontrant le rôle critique de ce sous-ensemble Th dans la résolution de l'inflammation et de réglementer la tolérance périphérique aux antigènes du soi 16. In vitro, les cellules T helper CD4 + naïfs jusqu'à régulent Foxp3 et adhérer au programme Treg lors de la stimulation par l'IL-2 et TGF-β 14,15. Il peut être modérée à la plasticité considérable lignées de cellules T CD4 +, en particulier lorsque l'on considère que la production de cytokines (revue dans 17,18). Toutefois, pour les fins de protocoles in vitro de différenciation, nous allons discuter chaque sous-ensemble comme une lignée unique.
Récemment, un sous-ensemble de cellules Th17 qui produit la cytokine IL-17 a été identifié comme une lignée unique avec des fonctions pro-inflammatoires qui sont particulièrement pathogène pendant une inflammation auto-immune 19-21. Th17 cellules expriment un facteur de transcription unique appelé liés rétinoïde-récepteur orphelin gamma t (RORγt) qui coordonne le programme génétique 22 Th17. TGFß est important pour la génération de la lignée Th17 par l'induction de RORγt. Cependant, on croit l'effet de la signalisation TGF pour induire seul engagement sur Th17 synergie avec l'IL-6 (revue dans 12). D'autres études ont montré qu'une variété d'autres signaux qui peuvent réguler positivement l'engagement Th17, y compris l'IL-1β, l'augmentation de sodium et de signalisation TLR 23-26. D'autres rapports ont suggéré que les cellules Th17 pathogènes in vivo sont ceux qui contournent effectivement signalisation TGFß et se appuient sur une combinaison de IL-1, IL-6, IL-23 et de 27 leur différenciation. Ainsi, les cellules Th17 peuvent être dérivées d'une variété de voies de signalisation; aux fins de ce protocole, l'couramment utilisé (TGFß et de l'IL-6) voie d'un engagement de la lignée Th17sera présenté.
Les protocoles décrits ci-dessous de différenciation pour toutes les lignées effectrices repose sur l'anticorps fixe comme stimuli pour le TCR et CD28 pendant toute la durée de l'expérience. Cependant, d'autres ont démontré que l'activation du TCR avec des cellules présentatrices d'antigène 28 ou de reticulation anti-CD3 et anti-CD28 avec un anticorps de hamster pendant 2 jours 29 sont également des moyens très efficaces pour induire la production de divers sous-ensembles Th. Le protocole présenté ici se appuie sur les méthodes précédemment rapportées pour isoler des cellules T CD4 + murines des organes lymphoïdes secondaires 30 et générer des cellules Th17 31. Une différence majeure est que ce protocole repose sur l'utilisation d'un trieur de cellules pour isoler les cellules T CD4 + naïfs provenant de tissus lymphoïdes. Cependant, de nombreuses entreprises offrent maintenant des kits de séparation rapides qui peuvent enrichir des cellules naïves T CD4 +, qui peuvent être en mesure de contourner l'exigence fou le tri en fonction de l'expérience. Les méthodes et les réactifs présentés dans ce protocole sont ce que nous utilisons régulièrement et de trouver pour être le plus efficace. Cependant, gardez à l'esprit que les réactifs et les méthodes alternatives existent pour la plupart des étapes présentées ci-dessous et ce est au laboratoire individu de déterminer ce qui fonctionnera le mieux pour leurs fins.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en utilisant les protocoles approuvés par le bureau de la santé et de la sécurité de l'environnement à l'Université Franklin Rosalind de médecine et des sciences. C57BL / 6 (acheté chez NCI) utilisé pour ce protocole ont été logés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en utilisant des protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) au Franklin Université Rosalind de médecine et Science.
1. Préparation des instruments, des fournitures et réactifs
- Manteau de 48 puits ou à 24 puits avec des plaques anti-CD3 et anti-CD28 (Tableau 1) dans PBS stérile, couvrir et envelopper dans du parafilm pour éviter l'évaporation et la contamination, puis incuber O / N à 4 o C le jour avant T isolement des cellules. Alternativement, revêtir les puits 1 h à 37 o C. Effectuer conditions Th0, Th1, Th2, et en revêtant la fois iTreg anti-CD3 et anti-CD28 à 1 pg / ml dans 0,5 à 1 ml dele volume tal (plaque 48 puits). Pour Th17, nous typiquement couche anti-CD3 à 2 ug / ml et anti-CD28 à 1 ug / ml.
REMARQUE: Nous avons trouvé qu'une concentration inférieure anti-CD3 est optimale pour la génération Th1, Th2, et iTreg alors qu'une concentration plus élevée anti-CD3 est optimale pour la génération Th17. Ainsi, l'anti-CD3 et anti-CD28 concentrations doivent être titrés et optimisés pour les laboratoires individuels (tableau 2). - Stériliser un ensemble d'outils de dissection (des ciseaux et des pinces) par une solution autoclave ou désinfectant. Un tube ou petit bécher contenant 70% d'éthanol seront nécessaires pour la stérilisation rapide d'outils entre les dissections. Enfin, un flacon pulvérisateur contenant 70% d'éthanol sera nécessaire pour la stérilisation de la surface de la souris avant la dissection.
- Préparer une surface de dissection en enroulant un morceau plat de styromousse ou de liège dans une feuille d'aluminium. Épingles ou des aiguilles de dissection sont utilisés pour fixer l'animal en place.
- Préparer des plats ou des plaques de collecte de tiquest. Si les tissus de mise en commun, 60mm plats séparés contenant 3 ml de solution stérile PBS + 1% de FBS (PBS +) pour les tissus de la rate et des ganglions lymphatiques est suffisante. Si gardant tissus provenant de souris individuelles séparées, préparer un 1ml plaque de 24 puits contenant de PBS + dans le nombre souhaité de puits.
- Préparer du milieu RPMI complet pour la culture cellulaire et pré-chaud avant utilisation (tableau 1).
NOTE: Nous utilisons régulièrement RPMI mais d'autres médias tels que IMDM et DMEM peut être tout aussi efficace ou supérieure selon le laboratoire et l'expérience. - Couper des carrés de 2x2 cm nylon engrènent avec une taille de pores de 120 um et autoclave pour stériliser (tableau 1).
- Facultatif: si vous utilisez la cellule magnétique à haute vitesse système de tri comme autoMACS pour l'enrichissement de cellules CD4 +, la course pré-chaud et le rinçage tampons C dans un bain d'eau à 37 o pour éviter d'endommager la machine.
- NOTE: L'enrichissement est recommandé d'augmenter le rendement de tri et de diminuer le temps de tri.
- Tousétapes de préparation, à l'exception de dissection, doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile.
2. Isolement des ganglions lymphatiques et la rate de souris
- Euthanasier le nombre requis d'animaux en utilisant une technique institutionnellement approuvé. Utilisez C57BL / 6 souris femelles, l'âge 5-10 semaines, en raison de leur pourcentage élevé de cellules T naïves et graisse du bas du corps en comparaison aux hommes ou à des souris âgées.
REMARQUE: Les cellules dérivées de souris mâles se effectuer de façon similaire in vitro et les étapes du protocole restent les mêmes. Des souris femelles, âgées de 5 à 10 semaines, donne habituellement 3-6 x 10 6 cellules naïves T CD4 + par souris. Cependant, en utilisant différentes souches de souris peuvent affecter le rendement et la performance. Par exemple, des cellules provenant de souris C57BL / 6 sont meilleurs pour générer des cellules Th1 tandis que les cellules provenant de souris Balb.c sont meilleurs pour générer des cellules Th2. - Répartir les membres de l'animal et les épingler en place comme le montre la figure 1. Couper la peau à longitudinally de l'anus vers le menton tout en faisant attention à ne pas percer des tissus plus profonds.
- Déployez la peau avec une pince et la broche de la peau en place pour permettre un accès facile aux ganglions lymphatiques comme le montre la figure 1.
- Récolter les ganglions lymphatiques accessibles depuis les emplacements indiqués sur la figure 1. Saisir le ganglion lymphatique avec une paire de pinces pendant que le tissu de séparation avec une autre paire de pinces permet un retrait facile. Placez le tissu dans le plat de collecte.
- Récolter la rate à partir de l'emplacement représenté sur la figure 1. Dans ce cas, la découpe soigneuse dans le péritoine est nécessaire pour accéder à la rate. Placez le tissu dans un plat de collecte.
- Répétez la procédure si d'autres tissus seront récoltés. Procéder autrement pour les prochaines étapes. À ce stade, effectuer toutes les étapes restantes sur la glace jusqu'à ce que le placage des cellules T après le tri.
3. Traitement des tissus et CD4 + Enrichissement
- Traiter les ganglions lymphatiques et la rate dans différents plats pour augmenter le rendement de préparations de cellules ganglionnaires ne nécessitent pas la lyse des érythrocytes, ce qui peut entraîner la mort de leucocytes mineur. Par conséquent, les étapes ci-dessous décrivent un procédé pour traiter des populations de rate et de ganglions lymphatiques puis en combinant séparément avant l'étiquetage pour le tri.
- Retirer le tissu (la rate ou des ganglions lymphatiques communs) de la boîte de collecte et dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant 3 ml de PBS +. Placer un carré de nylon stérile maillage sur le tissu en utilisant des pinces stériles.
- Prenez le côté du pouce d'un piston de la seringue (3-10 ml) et casser doucement le tissu contre la maille. Presque tous les tissus devrait aller en suspension. Sinon, placez le tissu entre deux lames dépolies autoclaves et broyé en suspension.
- Introduire à la pipette la suspension de haut en bas à quelques reprises pour briser les mottes solubles restantes. Placez un nouveau carré de filet de nylon sur l'ouverture d'une15 ml de tube conique et filtrer la suspension à travers pour éliminer les débris restants.
- Répétez les étapes 2-4 pour ganglionnaire supplémentaires et le tissu splénique.
- Une fois que la suspension a été filtrée dans un tube de 15ml remplir le reste du tube avec du PBS + et retournant plusieurs fois. Centrifuger les cellules à 475 g pendant 5 min à 4 o C.
- Pour les cellules spléniques, aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml d'une solution glacée ACK par rate 1X pendant 1 min pour lyser les érythrocytes. Ensuite, ajoutez 10 ml de PBS + sur le dessus de l'ACK, inverser le tube et centrifuger 475 g pendant 5 min à 4 o C.
- Pour les cellules de ganglions lymphatiques, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS +. Si on le désire ceux-ci peuvent être combinés avec les cellules spléniques après leur lyse ACK et l'étape de lavage.
- Aspirer le surnageant après centrifugation des splénocytes et remettre en suspension dans 10 ml de PBS +. A ce stade, la suspension de ganglion lymphatique peut être undded au-dessus de la suspension de rate si la mise en commun des tissus est nécessaire pour le tri. Centrifuger le tube à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C.
- Le culot de cellules peut alors être préparé pour l'enrichissement CD4. Si cette étape ne sera pas exécutée, passer aux étapes de préparation de tri.
- Pour l'enrichissement CD4 en utilisant le système de tri cellulaire magnétique à haute vitesse, remettre en suspension le culot cellulaire avec des billes CD4. Typiquement 15 ul de billes dilué dans 85 pi de PBS + est utilisé pour étiqueter les tissus de 1 souris. Montée en puissance du volume de mélange de perles au besoin, remettre le culot, et incuber pendant 15-30 min à 4 o C.
- Laver les cellules avec 10 ml de PBS +, passer la suspension à travers nylon dans un nouveau tube de 15 ml pour enlever les débris, et centrifuger à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C.
- Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS par souris + et procéder à une sélection positive sur le système de tri à haute vitesse cellule magnétique. Si l'on utilise un système de séparation manuelle, fuivez les instructions du fabricant pour l'enrichissement. En variante, remettre en suspension les échantillons dans du tampon FACS: PBS avec 1 mM d'EDTA (pH = 8) et BSA à 1%, stérilisée par filtration.
- Retirez la fraction positive et laver de nouveau avec 10 ml de PBS +. La fraction enrichie en cellules CD4 + est maintenant prêt à être étiqueté pour le tri.
4. cellules Tri Naïf T CD4 +
- Marquer le culot de cellules avec du PBS + contenant des anticorps fluorescents dirigés contre CD62L, CD44, CD25, CD4 et. Si l'on utilise les anticorps énumérés dans le tableau 1, pour chacune des dilutions sont fournis. Pour la coloration, un volume de 100 pl de cocktail d'anticorps est utilisé par les tissus d'une souris.
- Reprendre le culot de cocktail d'anticorps et incuber pendant 15-30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec 10 ml de PBS et centrifuger + 475 g pendant 5 min à 4 o C.
- Passez le mélange sur un autre capuchon de filtre en nylon ou un tamis cellulaire à nouveaudéplacer tout débris. Pipeter des cellules marquées dans un tube qui est compatible pour le trieur de cellules. Gardez cellules sur la glace et à l'abri de la lumière jusqu'à la sorte.
- Préparer des tubes de prélèvement par aspiration de 1-2 ml du milieu RPMI complet ou de FBS dans le fond de tubes compatibles pour la collecte sur un trieur de cellules.
- Trier les cellules naïves T CD4 + en tant que CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - population (Figure 2). Laver les cellules recueillies avec du milieu RPMI complet et centrifuger comme décrit ci-dessus.
- Reprendre le culot dans RPMI complet, compter les cellules naïves, et ajuster la concentration de 1 x 10 6 cellules / ml.
5. Configuration de la différenciation in vitro
- Aspirer les puits des plaques revêtues anti-CD3 et anti-CD28 et laver chaque puits avec 1 ml de PBS stérile (pas de FBS). Pour les plaques à 48 puits, la plaque 0,5 x 10 6 cellules / puits dans 0,5 ml de RPMI. Pour les plaques à 24 puits, la culture 1 x 10 6 cellules / puits dans 1,0 ml de RPMI.
- Si tester l'influence d'un facteur tel qu'un médicament ajouter la substance dans les puits appropriés, soit avant, pendant ou après le processus de différenciation en fonction de l'expérience. Ensuite, compléter le milieu de culture avec des cytokines et des anticorps de blocage en conséquence. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, 30 U / ml de hIL-2, et 5 000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / ml 37,51 soluble, et 5 000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11.
REMARQUE: Les conditions présentées ci-dessus ont été trouvés être optimale pour maximiser la production de cytokines tel que mesuré à la fin de l'expérience de différentiation (section des résultats représentatifs). Cependant, chaque condition doit être optimisée pour les laboratoires individuels (tableau 2 - Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4-5 D avant l'analyse de l'expression génétique et la production de cytokines. Alternativement, éliminer les cellules des stimuli TCR après 2 d, ajustée à 1 x 10 6 cellules / ml avec un milieu frais, et la plaque dans de nouveaux puits (non-couché) pour améliorer la prolifération et le rendement final. Dans ce cas, les cytokines polarisantes frais et les anticorps ne sont pas nécessaires, mais 10 U / ml d'IL-2 devraient être ajoutés aux nouveaux médias pour Th0, Th1, Th2 et cultures iTreg.
6. Analyse de la différenciation
- Pour l'analyse des cytokines par cytométrie de flux, restimuler chaque puits avec 10 ng / ml de PMA et 1 000 ng / ml d'ionomycine ou 1 pg / ml anti-CD3 pendant 4-6 heures en présence d'un inhibiteur de Golgi comme brefeldine A (Tableau1). Effectuer une coloration de cytokine intracellulaire en fonction de l'expérience (figure 3).
REMARQUE: Teinture des cytokines ou des facteurs de transcription, comme l'IL-4 (non représenté) et non-IFNy spécifique lignée (figure 3) pour les cultures Th17, pour chaque état en tant que témoins négatifs et comme un indicateur de l'efficacité de la différenciation. En outre, la tache de Foxp3 cultures Th17 que le développement réciproque des Treg peut se produire avec l'ajout de TGFß. - Pour la quantification des protéines, de recueillir les surnageants provenant de chaque puits de dosage et spécifique à une cytokine par ELISA (figure 3). Si l'on craint que le facteur mis à l'essai a influencé la prolifération par rapport aux échantillons de contrôle, les cellules peuvent être lavées, comptées, normalisée, puis restimulées avec 1 ug / ml d'anti-CD3 pour 24 h avant de recueillir surnageants pour les tests ELISA. Si le dosage de l'IL-4 de type Th2 conditions, le lavage et restimulating est nécessaire d'éliminer l'IL-4 qui peut être leftover partir de la culture initiale de différenciation.
- Pour l'analyse de l'expression du gène par PCR en temps réel, les cellules de récolte après la période d'incubation, laver, normaliser et pour stimuler la re-2-6 h avec 1 pg / ml d'anti-CD3 avant la récolte de l'ARNm (figure 3).
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Representative Results
Le point de temps pour l'analyse de la différenciation peut varier en fonction de l'état en cours de test Th, ainsi que la force de l'activation du récepteur de cellule T. Après 2-3 jours de différenciation, les cellules peuvent être visualisées par microscopie optique afin de déterminer l'étendue de la prolifération des lymphocytes T. Wells présentant vaste prolifération et l'agglutination des cellules sera probablement prêt pour l'analyse au jour 4. conditions de différenciation reposant sur l'addition de IL-2 exogène, comme Th1 et Th2, sera probablement épuiser les médias après 4 jours de culture. Afin de maximiser la production de cytokines, ces puits avec les médias épuisés peuvent être reconstituées avec du RPMI frais contenant IL-2 ou comptées et ré-étalées à 1 x 10 6 cellules par puits dans du RPMI frais contenant IL-2 d'étendre la différenciation pour un autre jour ou deux en utilisant cette méthode.
Figure 1. Illustration du placement de broches pour fixer une souris pour l'isolement des ganglions lymphatiques et la rate. (A) Diffuser les membres à part et les fixer avec une aiguille stérile ou une broche de dissection. De cette position, couper la fourrure et la peau longitudinalement à partir de la queue au menton. (B) Après la coupe, étendez-là délicatement la peau en dehors pour exposer les ganglions lymphatiques, comme indiqué dans l'image. Les emplacements des ganglions lymphatiques qui sont facilement accessibles à partir de cette position sont répertoriés dans l'image. La rate est situé juste sous la cage thoracique sur le côté droit de l'animal. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentant stratégie de tri pour l'isolement de cellules CD4 + naïfs Cellules T par tri cellulaire. A partir de la partie supérieure gauche, les lymphocytes sont d'abord déclenchés par la taille, puis les cellules singlet sont discriminés à partir de cellules de doublets. Crénelage sur singulets révèle une population de cellules CD4 + CD25 + qui sont nTregs. Porte sur le CD4 + CD25 - la population et puis trier naïve (CD62L + CD44 -) de la / mémoire effecteurs (CD62L - CD44 +) CD4 Les cellules +. Les lignes pointillées indiquent l'origine de la parcelle prochaine porte. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Données d'échantillons in vitro suivant Th différenciation. (A) Intracdonnées ellular de coloration de cytokine (gated sur CD4 +) à partir de Th1, Th2, iTreg, et différenciations Th17. En général, les cytokines spécifiques non-lignée, telles que IL-4 et d'IFNy pour cultures Th17, doivent être colorées pour déterminer la qualité de la différenciation. Données (B) suivant ELISA Th 4 d différenciation, de lavage, et 24 h restimulation avec des cellules données 1 pg / ml d'anticorps anti-CD3. (C) PCR en temps réel des facteurs propres à la lignée transcription suivants différenciation 4 d et restimulation pendant 4 h avec 1 pg / ml d'anticorps anti-CD3. Toutes les quantités de gènes ont été normalisées à l'expression de la β-actine et l'ARNm à partir de cellules T naïves indifférenciées servent de base de référence pour l'expression des gènes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Voir tableau des matériaux ci-dessous.
| Réactif | Gamme Titration recommandée |
| Cytokines: | |
| Humain (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antibodies: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5,000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5000 - 10 000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5000 - 10 000 ng / ml |
Tableau 2. Titration valeurs recommandées pour l'optimisation des conditions de différenciation.
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Discussion
Bien que la rate contient des cellules Th naïves, la proportion de cette population dans les ganglions lymphatiques est beaucoup plus élevé. L'incapacité d'identifier correctement et enlever les ganglions lymphatiques dans ce protocole se traduira par un mauvais rendement des cellules naïves. Cela peut être particulièrement difficile dans les souris des souris mâles âgés ou qui ont plus de tissus gras. Comme le montre la figure 1, une fixation correcte et piégeage des membres et de la peau animale permettra de faciliter la visualisation des ganglions lymphatiques extérieures accessibles. Une fois que les ganglions lymphatiques et les rates sont traitées, tri cellulaire est le procédé préféré d'obtention d'une population hautement purifiée de cellules T CD4 + naïves. La pureté est critique pour prévenir ou nTregs effecteur et de la mémoire de cellules Th influencer le processus de différenciation des cellules naïves. Les difficultés à obtenir un rendement élevé de cellules T naïves sont généralement provoquées par collecte de tissu et le traitement inefficace ou perte de cellules pendant les étapes de séparation. Pour augmenter le rendement de maquillageure de traiter les cellules en utilisant des tampons froids et incubations sur la glace. En outre, pour éviter la perte de cellules lors de l'enrichissement et / ou le tri en optimisant les réactifs et protocoles de séparation préalable est recommandée. Enfin, comme mentionné à divers points dans les étapes du protocole, les conditions de différenciation doivent être optimisés pour les laboratoires individuels avant d'effectuer des expériences à grande échelle (tableau 2).
Comme le montre la Figure 2, les cellules T CD4 + naïves peuvent être facilement distingués des nTreg (CD4 + CD25 +) et effecteur (CD4 + CD44 + CD62L -) populations. Le tri est l'un des moyens les plus fiables pour prévenir la contamination des sous-ensembles Th effecteur, qui existent aussi dans les ganglions lymphatiques et la rate. Treg contamination au cours de la différenciation peut entraîner la suppression de l'activation ainsi que la production de cytokines. Contamination d'autres sous-ensembles Th effecteur peuvent entraînerla production de cytokines qui sont des inhibiteurs pour le développement de lignées Th souhaités. Tri des frais d'établissement peuvent être coûteux et certains trouvent qu'il est plus facile pour enrichir les cellules T CD4 + par séparation magnétique pour réduire le temps de tri telle que décrite dans ce protocole. En l'absence d'une trieuse, certaines entreprises offrent maintenant des kits de séparation spécialement conçus pour l'isolement de cellules T CD4 + naïfs. Cependant, la pureté de la population doit toujours être vérifiée après la séparation, similaire aux échantillons triés. Le constat d'une faible fréquence de cellules T CD4 + naïfs (CD62L +) par rapport à la mémoire cellules / effectrices (CD44 -) peut indiquer un problème avec la souris, comme une infection ou une tumeur. Dans ce cas, les cellules ne devraient pas être utilisés pour ce type d'expérience.
Il ya assez peu de moyens pour déterminer l'efficacité de la différenciation Th. L'analyse des protéines est traditionnellement effectuée par cytokine tachetion, ce qui donnera une idée du pourcentage de cellules naïves qui ont été polarisé à une lignée spécifique (figure 3). Quantification des protéines par ELISA est aussi un outil utile pour déterminer le montant total des cytokines libérées dans les médias. La mise en garde avec ELISA analyse des protéines est bien que la comparaison des résultats entre les groupes expérimentaux peuvent être difficiles si un facteur particulier à l'essai a une influence sur la prolifération et la survie. Dans ce cas, le nombre total de cellules produisant des cytokines peuvent être différentes entre les groupes à la fin de l'expérience. Ainsi, la normalisation du nombre de cellules et restimulating pendant une courte période de temps (par exemple, anti-CD3 pendant 24 h) est nécessaire pour obtenir des résultats appropriés. En outre, l'IL-4 est utilisé comme un facteur de polarisation pour la génération du sous-ensemble Th2, de sorte que ces cellules doivent être lavés, normalisée, et restimulées avant d'effectuer une analyse ELISA pour IL-4. analyse de l'expression génique par PCR en temps réel est utile non seulement fou l'analyse de la transcription des gènes des cytokines, mais également pour des facteurs de transcription spécifique de la lignée (figure 3). Ainsi, en fonction de l'expérience, il ya différentes façons de doser l'efficacité de différenciation Th.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Reynolds au Rosalind Franklin Université de médecine et des sciences, et le laboratoire Chen Dong à l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center pour l'optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de JMR de la National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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