Introduction
הרעיון של שושלות או תת קבוצות של עוזר CD4 + T מובחנים תאים (ה ') כבר בסביבות מאז שלהי המאה ה -20 1. הכרה של אנטיגן המקור בנוכחות תוצאות אותות costimulatory בכמה סבבים של התרבות תאים וההתמיינות הסופית למפעיל Th תאים. סוג Th תא שנוצר במהלך תהליך זה תלוי בסביבת ציטוקינים נוכחת במהלך ההפעלה 2. בתחילה, תאי Th נאיביים נחשבו ללקטב לתוך 2 שושלות שונות הבאים קולט תא T הפעלה (TCR), קשירת CD28 costimulatory, ואיתות ציטוקינים. תאים מסוג 1 עוזר (Th1) מתאפיינים בייצור שלהם מפעיל של ציטוקינים IFNγ כמו גם הדרישה שלהם לאיתות IL-12 במהלך 3,4 תהליך ההתמיינות. סופו של דבר התברר שיש לי תאי Th1 מובחנים פרופיל גנטי שמאופיין ב מובהק ביותרy הביטוי של גורם שעתוק משפחת תיבת T, Tbx21 (T-הימור), הנחשב לרגולטור הראשי של התכנית הגנטית Th1 5. יתר על כן, IL-12, כמו גם IFNγ יכול לקדם את ביטוי T-הימור 6,7. בתגובה החיסונית, תאי Th1 חשובים להגנה מפני פתוגנים המארח תאיים, כמו גם יזמים חזקים של דלקת אוטואימונית. בניגוד לכך, תאים מסוג 2 עוזר (Th2) דורשים IL-4 לפיתוחם וציטוקינים מפעיל שלהם, כולל IL-4, IL-5, ו- IL-13, הם חשובים לנהיגת תגובות תא B והם פתוגניים באלרגיה 8, 9. בדומה לתאי Th1, תאי Th2 נמצאו להביע רגולטור תעתיק הורים שלהם, כינה Gata-3 10,11. מעניין לציין, כי הנוכחות של ציטוקינים קיטוב והדור של שושלת Th ספציפית הם עוינות להתפתחותם של אחרים 2,12, המצביע על כך רק קבוצת משנה Th מסוימת עשויה להיות דומיננטית במהלך מחדש חיסוניsponse.
מאז זיהוי של שושלות Th1 וTh2, עבודה נוספת הוכיחה עוד יותר ייחודי תת קבוצות של תאי T helper, כוללים עוזר זקיקים (TFH), IL-9-ייצור (Th9), וIL-22-ייצור (Th22) (לאחרונה בביקורת ב- 13). לצורך ניסויי בידול במבחנה, פרוטוקול זה יתמקד רק בשני תת Th נוסף, המכונה תאי T רגולטורים (Treg) וIL-ייצור-17 תאי CD4 + T (TH17). CD25 + תאי T רגולטורים יכולים להתרחש באופן טבעי (nTreg) בבלוטת התימוס; תאי Th נאיביים יכולים להיות גם מושרה (iTreg) להפוך לרגולציה בפריפריה (שנסקרה ב14,15). שני הסוגים של Tregs להביע גורם שעתוק אופייני, כינה P3 forkhead התיבה (Foxp3), שהוא קריטי למנגנוני דיכוי מפעיל שלהם הכוללים ייצור אנטי דלקתי מסיס מתווך, IL-2 הצריכה, ותא מנגנוני קשר תלוי 14,15. חוסר Foxp3 תוצאות ביטוי בהפרעה אוטואימונית חמורה, רב-איבר כינו dysregulation חיסוני, polyendocrinopathy, enteropathy, תסמונת X-צמוד (אייפקס), הממחישה את התפקיד הקריטי של קבוצת משנה Th זה בפתרון דלקת והסדרת סובלנות היקפית לעצמי אנטיגנים 16. במבחנה, תאי CD4 + T helper נאיביים להסדיר את-Foxp3 ולהיות מחויבים לתכנית Treg על גירוי עם IL-2 וTGF-β 14,15. ייתכן שיש מתון לפלסטיות רבה בשושלות תאי CD4 + T, במיוחד כאשר בוחנים ייצור ציטוקינים רק (שנסקר ב17,18). עם זאת, למטרות פרוטוקולי בידול במבחנה, נדונונו בכל תת-קבוצה כשושלת ייחודית.
לאחרונה, קבוצת משנה של תאי TH17 שמייצר ציטוקינים IL-17 זוהתה כשושלת ייחודית עם פונקציות פרו-דלקתיות הבמיוחד פתוגניים בדלקת אוטואימונית 19-21. תאי TH17 להביע גורם שעתוק ייחודי, t גמא קולט היתום הקשורות retinoid מכונה (RORγt) המרכז את התכנית הגנטית TH17 22. TGFβ חשוב לדור של שושלת TH17 דרך האינדוקציה של RORγt. עם זאת, ההשפעה של איתות TGFβ הוא האמין כדי לגרום רק מחויבות TH17 על synergizing עם IL-6 (הנסקרת ב 12). מחקרים נוספים הראו כי מגוון רחב של אותות אחרים שיכולה באופן חיובי להסדיר את מחויבות TH17, כולל IL-1β, נתרן מוגבר, וTLR איתות 23-26. דיווחים אחרים לא הציעו כי תאי TH17 פתוגניים in vivo הם אלה שלמעשה לעקוף איתות TGFβ ובמקום להסתמך על שילוב של IL-1, IL-6, IL-23 והבידול שלהם 27. כך, תאי TH17 ניתן לגזור ממגוון רחב של מסלולי איתות; מסלול למטרות פרוטוקול זה, משמש בדרך כלל-(TGFβ וIL-6) למחויבות שושלת TH17יוצג.
פרוטוקולי הבידול מתוארים להלן לכל שושלות מפעיל מסתמך על נוגדנים קבועים כגירויים לTCR וCD28 במהלך הקורס כולו של הניסוי. עם זאת, אחרים הראו כי הפעלת TCR עם תאי מציגי אנטיגן 28 או אנטי-CD3 ונוגדנים נגד CD28 עם נוגדן אוגר cross-linking במשך 2 ימים 29 גם אמצעי היעיל ביותר לגרימת הדור של תת Th השונים. הפרוטוקול המובא כאן מתבסס על שיטות שדווחו בעבר לבידוד תאי CD4 + T עכבריים מאיברי הלימפה משניים 30 ויצירת תאי TH17 31. אחד הבדלים עיקריים הוא שפרוטוקול זה מסתמך על השימוש בסדרן תא לבודד תאי CD4 + T נאיביים מרקמות הלימפה. עם זאת, חברות רבות מציעות כעת ערכות הפרדה מהירות שיכול להעשיר לתאי CD4 + T הנאיבי, שייתכן שתוכל לעקוף את דרישת fאו מיון בהתאם לניסוי. השיטות וחומרים הכימיים שהוצגו בפרוטוקול זה מה שאנחנו משתמשים באופן שיגרתי ולמצוא להיות היעיל ביותר. עם זאת, יש לזכור כי חומרים כימיים ושיטות אלטרנטיביים קיימות עבור רבים מהצעדים שיוצגו להלן וזה תלוי למעבדה בודדת כדי לקבוע מה יעבוד הכי טוב למטרות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי מבוצעים תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי משרד בריאות הסביבה והבטיחות באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע. C57BL / 6 עכברים (שנרכשו מNCI) המשמשים לפרוטוקול זה שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל הניסויים בבעלי החיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ו מדע.
1. הכנה של מכשירים, ציוד, וריאגנטים
- צלחות מעיל 48 היטב או 24 גם עם אנטי CD3 ואנטי CD28 (טבלה 1) בPBS סטרילי, מכסים ולעטוף בparafilm על מנת למנוע אידוי וזיהום, ולאחר מכן דגירה O / N ב 4 o C היום לפני T תא בידוד. לחלופין, h 1 בארות מעיל ב 37 o C. בצע תנאי Th0, Th1, Th2, וiTreg על ידי ציפוי שני אנטי-CD3 ואנטי-CD28 ב1μg / מיליליטר ב0.5-1 מ"ל לטל נפח (צלחת 48-היטב). לTH17, אנחנו בדרך כלל מעיל אנטי-CD3 ב2 מיקרוגרם / מיליליטר ואנטי-CD28 ב1 מיקרוגרם / מיליליטר.
הערה: מצאנו כי ריכוז אנטי-CD3 נמוך הוא אופטימלי עבור דור Th1, Th2, וiTreg תוך ריכוז אנטי-CD3 גבוה יותר הוא אופטימלי עבור דור TH17. לפיכך, יש טיטרציה אנטי-CD3 וריכוזים אנטי CD28 ומותאם למעבדות בודדות (טבלה 2). - לעקר סט של כלים לנתיחה (מספריים ומלקחיים) על ידי פתרון החיטוי או חומר חיטוי. צינור או כוס קטנה המכילה 70% אתנול יהיה צורך העיקור מהיר של כלים בין ניתוחים. לבסוף, בקבוק תרסיס המכיל 70% אתנול יהיה צורך לחיטוי את פני השטח של העכבר לפני הנתיחה.
- הכן משטח לנתיחה על ידי לפפה חתיכה שטוחה של קלקר או לוח שעם ברדיד אלומיניום. סיכות או מחטים לנתח משמשות כדי לתקן את בעלי החיים במקום.
- להכין מאכלים או צלחות לאיסוף tissues. אם רקמות איגום, 60mm מנות נפרדות המכילות 3ml של סטרילית PBS + 1% FBS (PBS +) לרקמות טחול ובלוטות לימפה הוא מספיק. אם רקמות שמירה מעכברים בודדים להפריד, להכין 1ml צלחת 24-המכיל גם של PBS + במספר הרצוי של בארות.
- הכן תקשורת RPMI מלא לתרבית תאים וטרום חם לפני השימוש (טבלה 1).
הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי RPMI אבל מדיה אחרת כגון IMDM וDMEM עשויה להיות יעילה באותה מידה או מעולה בהתאם למעבדה והניסוי. - סנטימטר Cut 2x2 ריבועים של רשת ניילון עם גודל נקבובית 120 מיקרומטר וחיטוי לעקר (טבלת 1).
- אופציונאלי: אם משתמש בתא המגנטי במהירות הגבוהה מיון מערכת כגון autoMACS להעשרת תאי CD4 +, ריצה טרום חמה ושטיפת מאגרים באמבט מים C 37 o כדי למנוע נזק למכונה.
- הערה: העשרה מומלץ להגדיל את התשואה ולהקטין מיון מיון זמן.
- כלצעדי הכנה, פרט לנתיחה, צריכים להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות.
2. בידוד של בלוטות לימפה וטחול מעכברים
- להרדים את המספר הדרוש של בעלי חיים באמצעות טכניקה שאושרה על-מוסדי. השתמש C57BL / 6 נקבות עכברים, גיל 5-10 wks, בשל אחוז הגבוה שלהם של תאי T נאיביים ושומן בגוף נמוך יותר בהשוואה לגברים או לעכברים מבוגרים.
הערה: תאים שנלקחו מעכברים ממין זכר יהיו לבצע באופן דומה במבחנה והצעדים הפרוטוקול יישארו זהים. נקבות עכברים, ישנים 5-10 wks, בדרך כלל יניבו 3-6 x 10 6 תאי CD4 + T נאיביים לכל עכבר. עם זאת, זנים השונים של עכברים באמצעות עלולים להשפיע על תשואה וביצועים. לדוגמא, תאים מעכברי C57BL / 6 הם טובים יותר ליצירת תאי Th1 תוך תאים מעכברי Balb.c טובים יותר ליצירת תאי Th2. - מורחים את הגפיים של בעלי החיים ולהצמיד אותם במקום, כפי שמוצג באיור 1. חותך את העור ארוךitudinally מפי הטבעת לסנטר והקפד לא לנקב רקמות עמוקות יותר.
- התפשטות לפתוח את העור עם מלקחיים ולהצמיד את העור במקום לאפשר גישה קלה לבלוטות הלימפה, כפי שמוצגת באיור 1.
- לקצור את בלוטות לימפה נגישות מהמקומות שמוצגים באיור 1. תופסת הבלוטה לימפה עם זוג המלקחיים תוך הפרדת רקמות עם עוד זוג המלקחיים תאפשר להסרת קלה. הנח את הרקמה בצלחת האוסף.
- לקצור את הטחול מהמיקום שמוצג באיור 1. במקרה זה, יש צורך בחיתוך זהיר להצפק כדי לקבל גישה לטחול. הנח את הרקמה בצלחת אוסף.
- חזור על התהליך אם יותר רקמות תהיה לקצור. אחרת להמשיך לשלבים הבאים. בשלב זה, לבצע את כל השלבים הנותרים על קרח עד הציפוי של תאי T לאחר המיון.
3. עיבוד רקמות וCD4 + העשרה
- לעבד את בלוטות הלימפה וטחול במנות שונות כדי להגדיל את התשואה וההכנות בלוטה לימפה תא אינו דורשות תמוגה כדורית אדומה, אשר עלול לגרום למוות לויקוציטים קטין. לכן, בשלבים הבאים מתארים שיטה לעיבוד אוכלוסיות טחול ובלוטות לימפה בנפרד ואחריו שילוב לפני תיוג למיון.
- להסיר את הרקמה (טחול או בלוטות לימפה ותקווינה) מצלחת האוסף ומניחים בצלחת 60 מ"מ חדשה המכילה 3 מיליליטר של PBS +. הנח זווית של ניילון סטרילי רשת על הרקמות באמצעות מלקחיים מעוקרים.
- קח את צד האגודל של בוכנת מזרק (3-10 מיליליטר) ובעדינות לנפץ את הרקמה נגד הרשת. כמעט כל הרקמה צריך ללכת להשעיה. לחלופין, הנח את הרקמה בין שתי שקופיות חלבית autoclaved וחרק להשעיה.
- פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את הגושים מסיסים שנותרו. מניחים חתיכה מרובעת חדשה של רשת ניילון על הפתיחהצינור חרוטי 15 מ"ל ולסנן את ההשעיה דרך להסיר את הפסולת שנותרה.
- חזור על שלבים 2-4 לבלוטה לימפה נוספת ורקמת טחול.
- ברגע שההשעיה סוננה לתוך צינור 15 מ"ל למלא את שארית הצינור עם PBS + ולהפוך כמה פעמים. צנטריפוגה התאים ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C.
- לתאי טחול, לשאוב צנטריפוגה הבאה supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח פתרון 1X ACK לטחול דקות 1 לlyse אריתרוציטים. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS + על גבי ACK, להפוך את הצינור, ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C.
- לתאי בלוטה לימפה, לשאוב supernatant וגלול ב2ml של PBS +. אם ארצה ניתן לשלב הבאים עם תאי הטחול לאחר תמוגה ACK שלהם ושלב כביסה.
- לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה של splenocytes וגלול בעוד 10 מיליליטר של PBS +. בשלב זה ההשעיה בלוטות לימפה יכולה להיותdded על גבי ההשעיה הטחול אם נדרש איגום רקמה למיון. צנטריפוגות הצינור שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C.
- התא גלולה עכשיו יכול להיות מוכן להעשרת CD4. אם שלב זה לא יבוצע, להמשיך לשלבי הכנת המיון.
- להעשרת CD4 באמצעות מערכת מיון תא המגנטית במהירות הגבוהה, resuspend גלולה הסלולרי עם חרוזים CD4. בדרך כלל 15 μl של חרוזים מדוללים ב -85 μl של PBS + משמש לתייג רקמות מהעכבר 1. כבש את הנפח של תערובת חרוז לפי צורך, resuspend גלולה, ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C.
- לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS +, להעביר את ההשעיה דרך ניילון לתוך צינור 15 מיליליטר חדש כדי להסיר שאריות, וצנטריפוגות שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C.
- Resuspend גלולה ב+ של PBS לכל עכבר 100 μl ולהמשיך לבחירה חיובית על מערכת תא מגנטי במהירות הגבוהה מיון. אם אתם משתמשים במערכת הפרדה ידנית, וollow הוראות היצרן להעשרה. לחלופין, resuspend הדגימות במאגר FACS: PBS עם 1 המ"מ EDTA (pH = 8) ו -1% BSA, מסונן סטרילי.
- הסר את החלק החיובי ולשטוף שוב עם 10 מ"ל של PBS +. חלק CD4 + המועשר מוכן להיות מתויג למיון עכשיו.
4. תאי המיון הנאיביים CD4 + T
- תווית התא גלולה עם PBS + נוגדני ניאון מכילים מכוונים נגד CD62L, CD44, CD25, וCD4. אם באמצעות הנוגדנים המופיעים בטבלה 1, דילולים עבור כל מסופקים. עבור מכתים, 100 μl נפח של הקוקטייל של הנוגדנים משמש לרקמות מעכבר אחד.
- Resuspend גלולה בקוקטייל של נוגדנים ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C בחושך.
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS + ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C.
- להעביר את התערובת מעל מכסה מסנן ניילון או מסננת תא אחר מחדשלהעביר כל שאריות פסולת. פיפטה התאים שכותרתו לתוך צינור שתואם לסדרן התא. שמור את התאים על קרח ומוגן מפני האור עד הסוג.
- הכן צינורות אוסף ידי pipetting 1-2ml של תקשורת RPMI מלאה או FBS לתוך החלק התחתון של צינורות תואמים לאוסף על סדרן תא.
- מיין תאי CD4 + T הנאיביים כCD4 + CD25 - CD62L + CD44 - אוכלוסייה (איור 2). שוטף את התאים שנאספו עם תקשורת RPMI מלאה ו צנטריפוגות כמתואר לעיל.
- Resuspend גלולה בRPMI המלא, לספור את התאים הנאיביים, ולהתאים את הריכוז עד 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
5. הגדרת הבידול במבחנה
- לשאוב את הבארות של הצלחות המצופים אנטי CD3 ואנטי CD28 ולשטוף היטב עם כל 1ml של PBS סטרילי (לא FBS). לצלחות 48-היטב, צלחת 0.5 x 10 6 תאים / גם ב 0.5 מיליליטר של RPMI. לצלחות 24 גם, תרבות 1 x 10 6 תאים / גם ב1.0 מיליליטר של RPMI.
- אם בודק את ההשפעה של גורם כגון סמים להוסיף חומר לבארות המתאימות גם לפני, במהלך או אחרי תהליך ההתמיינות בהתאם לניסוי. בשלב הבא, להשלים את תרבות התקשורת עם ציטוקינים ונוגדני חסימה בהתאם. Th0: 30 U / ml Hil-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml Hil-2, ו5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml Hil-2, 2,000 ng / ml המסיס 37.51, וng 5000 / XMG1.2 מיליליטר. iTreg: 15-2 Hil, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml ng / ml 11B11. TH17: 20 / מיליליטר rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng ng / ml 11B11.
הערה: התנאים שהוצגו לעיל נמצאו אופטימלי למקסם את ייצור ציטוקינים כפי שנמדד בסוף ניסוי הבידול (סעיף נציגי תוצאות). עם זאת, כל מצב צריך להיות מותאם למעבדות (טבלה 2 בודדות - דגירה את הצלחת על C 37 o עם 5% CO 2 4-5 ד לפני הניתוח של ביטוי גנים וייצור ציטוקינים. לחלופין, להסיר את התאים מגירויי TCR לאחר 2 ד, מותאם ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם תקשורת טרי, וצלחת בבארות חדשות (לא מצופה) כדי לשפר את ההתפשטות ותשואה סופית. במקרה זה, ציטוקינים קיטוב טריים ונוגדנים אינם נחוצים, אבל 10 U / ml של IL-2 יש להוסיף לאמצעי תקשורת החדש לTh0, Th1, Th2, ותרבויות iTreg.
6. ניתוח של בידול
- לניתוח ציטוקינים על ידי cytometry זרימה, restimulate היטב עם כל 10ng / ml PMA ו1,000 ng / ml ionomycin או טבלה / מיליליטר אנטי-CD3 במשך 4-6 שעות בנוכחות מעכב Golgi כגון brefeldin (1 מיקרוגרם1). לבצע מכתים ציטוקינים תאיים תלוי בניסוי (איור 3).
הערה: כתם שאינה שושלת ספציפית ציטוקינים או גורמי שעתוק, כגון IL-4 (לא מוצגים) וIFNγ (איור 3) לתרבויות TH17, לכל מצב כפקדים שליליים וכמדד ליעילות בידול. יתר על כן, Foxp3 כתם לתרבויות TH17 כפיתוח ההדדי של Tregs עלול להתרחש בתוספת TGFβ. - לכימות חלבון, לאסוף supernatants מכל assay היטב ועל ידי ציטוקינים ספציפיים ELISA (איור 3). אם קיים חשש שהגורם נבדק השפיע שגשוג בהשוואה לדגימות בקרה, ניתן לכבס את התאים, נספרו, מנורמל, ולאחר מכן restimulated עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 במשך 24 שעות לפני איסוף supernatants למבחני ELISA. אם מנסה לאמוד IL-4 מTh2 תנאים, כביסה וrestimulating יש צורך להסיר IL-4 שעשויות להיות leftover מתרבות הבידול הראשונית.
- לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת, תאי קציר לאחר תקופת הדגירה, לשטוף, לנרמל, ולעורר מחדש במשך 2-6 שעות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 לפני mRNA קציר (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנקודה לניתוח הבידול יכול להשתנות בהתאם למצב Th הזמן נבדק, כמו גם את הכוח של הפעלת קולטן תא T. לאחר 2-3 ימים של בידול, ניתן דמיינו תאים על ידי מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את מידת התפשטות תאי T. ולס מציג התפשטות ויצירת גושים נרחבות של תאים יהיה ככל הנראה מוכן לניתוח ביום 4. תנאי בידול להסתמך על התוספת של IL-2 החיצוני, כגון Th1 וTh2, סביר להניח שממצה את התקשורת לאחר 4 ימים בתרבות. על מנת למקסם את ייצור ציטוקינים, כגון בארות עם תקשורת מותשת יכולות להתחדש עם RPMI הטרי המכיל IL-2 או לספור מחדש מצופים ב1 x 10 6 תאים לכל גם בRPMI הטרי המכילים IL-2 להאריך את הבידול ליום או ימים אחר שימוש בשיטה זו.
Figurאיור 1. הדואר של מיקום סיכה לתקן עכבר לבידוד של בלוטות לימפה וטחול. () מורחים את האיברים בנפרד ולתקן אותם בעזרת מחט סטרילית או סיכה לנתיחה. מתוך עמדה זו, לחתוך את הפרווה ועור longitudinally מהזנב לסנטר. (ב) לאחר החיתוך, בעדינות להפיץ את העור מלבד לחשוף את בלוטות לימפה כפי שמוצג בתמונה. המקומות של בלוטות הלימפה שנגישות בקלות מעמדה זו מופיעים בתמונה. הטחול נמצא ממש מתחת לבית החזה בצד ימין של החיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אסטרטגית איור 2. נציג מיון לבידוד של CD4 + הנאיבי T תאים על ידי מיון תא. החל מהפינה השמאלית העליונה, לימפוציטים הם מגודרים ראשון לפי גודל ולאחר מכן תאי גופייה מופלים מתאי כפיל. Gating על singlets מגלה אוכלוסייה של CD4 + CD25 + תאים שnTregs. השער בCD4 + CD25 - האוכלוסייה ולאחר מכן סוג נאיבי (CD62L + CD44 -) מהמפעיל / הזיכרון (CD62L - CD44 +) CD4 + תאים. קווים מקווקווים מציינים את מקור השער של העלילה הבאה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. נתונים לדוגמא הבאים במבחנה Th בידול. () Intrac נתוני מכתים ציטוקינים ellular (נשלטים על CD4 +) מTh1, Th2, iTreg, ובידול TH17. בדרך כלל, ציטוקינים ספציפיים שאינה שושלת, כגון IL-4 וIFNγ לתרבויות TH17, צריכים להיות מוכתמים כדי לקבוע את האיכות של הבידול. נתונים (B) ELISA הבאים 4 ד ה בידול, כביסה, ו -24 restimulation שעות של תאים עם נתונים 1 מיקרוגרם / מיליליטר זמן אנטי-CD3. (C) ריאל PCR של גורמי שעתוק שושלת ספציפית הבאים בידול 4 ד וrestimulation לג 4 עם אנטי-CD3 1 מיקרוגרם / מיליליטר. כל כמויות הגן היו מנורמלות הביטוי של β-אקטין וmRNA מתאי T נאיביים מובחנים לשמש כבסיס לביטוי גנים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1. ראה חומרי טבלה שלהלן.
| מֵגִיב | טווח טיטרציה מומלץ |
| ציטוקינים: | |
| IL-2 האנושי (ח) | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (TH17) | 0.1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| נוגדנים: | |
| 2C11 (אנטי-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37.51 (אנטי CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (אנטי-IL-4) | 5000 - 10,000 ng / ml |
| XMG1.2 (אנטי-IFNg) | 5000 - 10,000 ng / ml |
טבלה 2. מומלצת טווח טיטרציה לאופטימיזציה של תנאי בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד הטחול מכיל תאי Th נאיביים, חלקם של אוכלוסייה זו בבלוטות לימפה הוא הרבה יותר גבוה. הכישלון לזהות כראוי ולהסיר בלוטות לימפה בפרוטוקול זה יגרום לתשואה ירודה של תאים נאיביים. זה יכול להיות קשה במיוחד בעכברים מבוגרים או עכברי זכרים שיש לי רקמת שומן יותר. כפי שניתן לראות באיור 1, תיקון ראוי וענידה של הגפיים בעלי החיים והעור יאפשר להדמיה קלה יותר של בלוטות לימפה החיצונית נגישות. ברגע שבלוטות הלימפה וטחול מעובדים, מיון תא הוא השיטה המועדפת להשגת אוכלוסיית תא נקיה במיוחד נאיבית CD4 + T. טוהר הוא קריטי כדי למנוע nTregs או מפעיל וזיכרון Th תאים מהשפעה על תהליך התמיינות תאים הנאיבי. קשיים בהשגת תשואה גבוהה של תאי T נאיביים נגרמים בדרך כלל על ידי אוסף רקמות לא יעיל ועיבוד או אובדן של תאים במהלך שלבי ההפרדה. כדי להגדיל את התשואה של איפוריור לעבד את התאים באמצעות מאגרים וincubations קרים על קרח. יתר על כן, על מנת למנוע אובדן של תאים בהעשרה ו / או מיון, אופטימיזציה של חומרים כימיים ופרוטוקולי הפרדה מראש מומלץ. לבסוף, כאמור בנקודות שונות בשלבי הפרוטוקול, תנאי בידול צריכים להיות מותאמים למעבדות בודדות לפני ביצוע ניסויים בקנה מידה גדולים (טבלה 2).
כפי שניתן לראות באיור 2, ניתן בקלות להבחין בתאי CD4 + T נאיביים מnTreg (CD4 + CD25 +) והמפעיל (CD4 + CD44 + CD62L -) האוכלוסיות. מיון הוא אחת הדרכים הכי אמינות על מנת למנוע זיהום של מפעיל Th תת, שקיימות גם בבלוטות לימפה וטחול. זיהום Treg במהלך הבידול עלול לגרום לדיכוי של הפעלה, כמו גם ייצור ציטוקינים. זיהום של מפעיל אחר Th תת עלול לגרום להייצור של ציטוקינים המוגבלים לפיתוח של שושלות Th רצויים. דמי מתקן מיון יכולים להיות יקרים וחלק מוצאים שזה קל יותר להעשרה לתאי CD4 + T על ידי הפרדה מגנטית כדי לצמצם את זמן מיון כפי שתואר בפרוטוקול זה. בהעדר סדרן, כמה חברות מציעות כעת ערכות הפרדה שתוכננו במיוחד עבור הבידוד של תאי CD4 + T נאיביים. עם זאת, את הטוהר של האוכלוסייה תמיד צריך להיבדק לאחר הפרדה, דומה לדוגמאות מסודרים. הממצא של תדירות נמוכה של תאי CD4 + T נאיביים (CD62L +) בהשוואה לתאי זיכרון / מפעיל (CD44 -) עשוי להצביע על בעיה בעכבר, כגון זיהום או גידול. במקרה זה לא אמורים לשמש את התאים לסוג זה של ניסוי.
יש לא מעט דרכים כדי לקבוע את היעילות של Th בידול. ניתוח חלבון מתבצע באופן מסורתי על ידי כתם ציטוקיניםing, אשר ייתן רעיון של אחוז התאים הנאיביים שכבר מקוטב לשושלת ספציפית (איור 3). כימות חלבון על ידי ELISA היא גם כלי שימושי כדי לקבוע את הסכום הכולל של ציטוקינים ששוחרר לתקשורת. האזהרה עם ניתוח חלבון ELISA אף הוא כי תוצאות השוואה בין קבוצות ניסוי עלולות להיות קשות אם גורם מסוים שנבדק יש השפעה על שגשוג והישרדות. במקרה זה, את המספר הכולל של תאים מייצרים ציטוקינים עשוי להיות שונה בין קבוצות בסוף הניסוי. לפיכך, נרמול ספירת התאים וrestimulating לתקופה קצרה של זמן (למשל, אנטי-CD3 במשך 24 שעות) הוא הכרחי כדי להשיג תוצאות מתאימות. יתר על כן, IL-4 משמש כגורם קיטוב עבור הדור של קבוצת משנה Th2, כך שהתאים אלה חייבים להיות שטף, מנורמלים, וrestimulated קודם לביצוע ELISA לIL-4. ניתוח ביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת הוא שימושי לא רק fאו הניתוח של שעתוק הגנים ציטוקינים, אלא גם לגורמי שעתוק שושלת ספציפית (איור 3). לכן, בהתאם לניסוי, יש דרכים שונות לassay את האפקטיביות של Th בידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ריינולדס באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע, ומעבדת חן דונג באוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson לאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק לJMR מהמכונים הלאומי לבריאות (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
