Introduction
별개의 계통 또는 CD4 + T 도우미의 부분 집합의 개념 (목) 세포는 20 세기 한 후반 이후 주변왔다. 세포 증식 및 세포 목 이펙터로 최종 분화의 여러 라운드에서 공동 자극 신호 결과의 존재 동족 항원의 인식. 이 과정에서 생성되는 토륨 셀의 유형이 활성화 중에 본 사이토킨 환경에 의존한다. 우선, 토륨 나이브 T 세포는 세포 수용체 (TCR) 활성화, 보조 자극 CD28 결찰 및 사이토 카인이 다음과 같은 별개의 신호 계통에 편광 생각되었다. 1 형 헬퍼 세포 (TH1)는 사이토킨 IFNγ 그들의 이펙터 생산뿐만 아니라 분화 과정 중에 3,4- IL-12 시그널링 그들의 요건을 특징으로한다. 결국 차별화 된 Th1 세포가 가장 특유 B를 특징으로하는 유전 적 프로파일이 발견되었다Y TH1 유전 적 프로그램 (5)의 마스터 조절기 간주되는 T 상자 가족의 전사 인자의 발현, Tbx21 (T-내기). 또한, IL-12뿐만 아니라 IFNγ로는 T-내기 식 6, 7을 홍보 할 수 있습니다. 면역 응답하여, Th1 세포는 세포 내 병원체뿐만 아니라자가 면역 염증 강한 프로모터 대 숙주 방어에 중요하다. 대조적으로, 2 형 헬퍼 세포 (은 Th2)은 그 개발 IL-4 및 IL-4, IL-5 포함한 효과기 사이토킨, 및 IL-13을 요구, B 세포 반응을 구동하기위한 중요하고 알레르기 8 병원성, 9. Th1 세포와 마찬가지로,은 Th2 세포가 자신의 마스터의 전사 조절을 표현하는 것으로하고, GATA-3 10,11 불린다. 흥미롭게도, 편광 사이토 카인의 존재 및 특정 목 혈통의 생성은 특정 토륨 서브셋 동안 재 면역 우성 될 수 있음을 시사 2,12 등의 개발 반목sponse.
TH1 Th2에 계통의 식별 이후, 추가 작업은 최근 모낭 도우미 (TFH), (TH9) IL-9-생산 및 IL-22 생산 (Th22) (포함 T 헬퍼 세포의 더욱 부분 집합을 보여 주었다 ) 13에서 검토. 체외 분화 실험의 목적을 위해,이 프로토콜은 조절 T 세포 (TREG) 및 IL-17을 생산하는 CD4 + T 세포 (Th17)를 지칭 단에 두 개의 추가 서브 세트들을 토륨 초점을 맞출 것이다. CD25 + T 조절 세포는 흉선에서 자연적 (nTreg)가 발생할 수있다; 순진 목 세포는 (14, 15에서 검토) 주변의 규제가 될 (iTreg)을 유도 할 수있다. Tregs 두 가지 유형의 특성 전사 인자가, 용해성 항염 매개체 생산, IL-2 소모 및 셀 접촉 의존적 메커니즘 (14,15)을 포함하는 그들의 이펙터 억제 메카니즘에 중요 forkhead 상자 P3 (Foxp3를)를라고 표현한다. Foxp의 부족심각한, 다기관자가 면역 질환에서 3 식 결과는 면역 조절 장애, polyendocrinopathy, 장 질환이라, 염증을 해결하고 자기에 주변 내성을 조절하는이 목 부분 집합의 중요한 역할을 보여주는 X-연결 증후군 (IPEX)는 16 항원. 시험 관내에서, 순진한 CD4 + T 헬퍼 세포는 Foxp3의를 상향 조절하고 IL-2와 14, 15을 TGF-β가 함께 자극에 TREG 프로그램에 최선을 다하고된다. (17, 18에서 검토) 만 사이토 카인 생성을 고려할 때, 특히 CD4 + T 세포 계통 상당한 가소성 중등도가있을 수있다. 그러나, 체외 분화 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 고유 혈통 각 서브셋을 논의한다.
최근, IL-17 사이토 카인을 생산 Th17 세포의 서브 세트는자가 면역 염증 19-21 중 특히 병원성 염증성 기능 고유 혈통로 확인되었다. Th17 세포 고유의 전사 인자를 발현, 유전자 Th17 프로그램 (22)을 좌표로 불리는 관련 레티노이드 고아 수용체 감마 t (RORγt). TGFβ는 RORγt의 유도를 통해 Th17 계보의 생성에 중요합니다. 그러나, TGFβ 신호의 효과는 (12에서 검토) IL-6와 Th17 synergizing에 약속을 유도하는 것으로 여겨진다. 또한 연구는 다른 긍정적 인 IL-1β를 포함, Th17 약속을 조절할 수있는 신호 증가 나트륨 및 TLR의 다양한 23 ~ 26 신호 것으로 나타났습니다. 다른보고는 생체 내에서 병원성 Th17 세포가 실제로 TGFβ 신호 우회 것들 대신 분화 27 IL-1, IL-6, IL-23의 조합에 의존한다고 제안했다. 따라서, Th17 세포 신호 전달 경로의 다양한로부터 유도 될 수있다; Th17 계통에 대한 약속이 프로토콜의 목적을 위해, 일반적으로 사용되는 (TGFβ 및 IL-6) 통로표시됩니다.
모든 이펙터 계통에 대한 설명 분화 프로토콜은 실험의 전 과정에 걸쳐 TCR와 CD28에 대한 자극으로 고정 된 항체에 의존한다. 그러나, 다른 보여준 그 항원 제시 세포가 28 또는 가교 항 CD3 및 햄스터 항체와 항 CD28 항체 이일 29은 다양한 토륨 서브 세트의 생성을 유도하는 매우 효과적인 수단과 TCR 활성화. 여기에 제시된 프로토콜은 Th17 세포 31 차 림프 기관 (30)로부터 쥐의 CD4 + T 세포를 분리하고 생성 이전에보고 된 방법에 작성합니다. 하나의 주요 차이점은이 프로토콜은 림프 조직으로부터 나이브 CD4 + T 세포를 분리하는 셀 소터의 사용에 의존한다는 것이다. 그러나 많은 기업들이 이제 요구 사항 F를 우회 할 수있다, 순진한 CD4 + T 세포에 대한 풍요롭게 빠른 분리 키트를 제공또는 정렬 실험에 따라. 방법과이 프로토콜에서 제시 시약은 우리가 일상적으로 사용하고 가장 효과가 무엇을 발견한다. 그러나, 대체 시약 및 방법은 아래에 제시된 많은 단계를 위해 존재한다는 것을 명심하고 자신의 목적을 위해 최선을 작동합니다 어떤 결정하기 위해 개별 실험실에 달려있다.
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Protocol
모든 실험 절차는 의학 및 과학의 로잘린 프랭클린 대학 환경 보건과 안전의 사무실에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용 (NCI에서 구입) C57BL / 6 마우스는 무균 상태에서 보관하고, 모든 동물 실험은 의학의 로잘린 프랭클린 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행 하였다 과학.
악기, 소모품 및 시약 1. 준비
- 항 CD3 및 안티 CD28와 코트 48 웰 또는 24 웰 플레이트 (표 1) 멸균 PBS, 커버 및 파라 필름으로 포장 증발과 오염을 방지하고 T 전날 C O를 4에서 O / N을 배양하기 세포 격리. 37 O C.에서 또는 코트 우물 1 시간 로 0.5-1 ml의 1μg / ㎖에서 항 CD3, 항 CD28 모두 코팅함으로써 TH0, TH1,은 Th2 및 iTreg 조건을 수행탈 볼륨 (48 웰 플레이트). Th17를 들어, 우리는 일반적으로 코트 항 CD3 1 ㎍ / ㎖의에서 ml의 항 CD28 2 ㎍ /에서.
참고 : 우리는 더 높은 항 CD3 농도가 Th17 생성을위한 최적의 상태에서 더 낮은 항 CD3 농도가 TH1,은 Th2 및 iTreg 생성을위한 최적의 것으로 나타났습니다. 따라서, 항 CD3, 항 CD28 농도는 적정 개별 실험실 (표 2)에 대해 최적화되어야한다. - 오토 클레이브 또는 소독제 용액 해부 도구 (가위와 집게) 세트를 소독. 튜브 또는 70 % 에탄올을 포함하는 작은 비커 해부 도구 사이의 빠른 멸균 필요할 것이다. 마지막으로, 70 % 에탄올을 함유하는 스프레이 병 해부 전에 마우스의 표면을 살균 필요할 것이다.
- 알루미늄 호일의 평면 스티로폼 조각 또는 코르크를 포장하여 절개면을 준비합니다. 해부 핀이나 바늘 장소에서 동물을 고정하는 데 사용됩니다.
- TI의 수집을 위해 요리 또는 접시를 준비ssues. 풀링 조직의 경우, 3ml를가 포함 된 별도의 60mm 요리 멸균 PBS + 비장과 림프절 조직에 대한 FBS (PBS +)이 충분 1 %. 개인 마우스의 유지 조직을 분리하는 경우, 우물의 원하는 번호에 PBS +의 24 웰 플레이트 포함하여 1ml를 준비합니다.
- 사용하기 전에 세포 배양 및 사전 따뜻한 대한 완전한 RPMI 미디어를 준비합니다 (표 1).
참고 : 우리는 일상적으로 RPMI를 사용하지만 이러한 IMDM과 DMEM와 같은 다른 미디어가 동일한 효과 또는 실험실과 실험에 따라 우수한 될 수있다. - 나일론의 사각형 살균 120 μm의 공경 압력솥 메쉬 컷 × 2 cm (표 1).
- 선택 : CD4 + 세포 농축, 프리 러닝 따뜻한 autoMACS으로 선별 시스템 고속 자성 세포를 사용하여 기계의 손상을 방지하기 위해 37 O C 물욕 버퍼를 세정하는 경우.
- 참고 : 농축이 분류 수율을 높이고 시간을 정렬 감소하는 것이 좋습니다.
- 모든제조 단계는 해부 제외한 멸균 조직 배양 후드에서 수행되어야한다.
마우스에서 림프절과 비장 2. 분리
- 제도적 승인 기술을 사용하여 동물의 필요 매수를 안락사. 때문에 남성에 비해 나이브 T 세포와 하체 지방의 높은 비율에 이상 마우스에 C57BL / 6 암컷 마우스, 연령 5-10 WKS을 사용합니다.
주 : 수컷 마우스 유래의 세포를 시험관 내에서 유사하게 수행하고, 상기 프로토콜 단계는 동일하게 유지. 5-10 주령 된 암컷 마우스는, 일반적으로 마우스 당 3-6 × 106 나이브 CD4 + T 세포를 수득한다. 그러나 마우스 사용하여 다른 균주 수율 및 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예컨대, C57BL / 6 마우스의 세포 Balb.c 생쥐에서 세포의 Th2 세포를 생성하기위한 더 좋은 반면 Th1 세포를 생성하기위한 더 낫다. - 사지 동물의 확산 및도 1에 도시 된 바와 같이 장소에 고정. 오랫동안 피부를 잘라조심 itudinally 턱 항문에서 동안하지 깊은 조직에 구멍을합니다.
- 확산은 집게로 피부를 열고도 1에 도시 된 바와 같이 림프절에 쉽게 접근 할 수있게하는 장소에서 피부를 고정.
- 도 1에 도시 된 위치에서 액세스 림프절 수확. 포셉 쌍 림프절 잡는 포셉 다른 쌍의 조직을 분리하여 쉽게 제거 할 수있다. 컬렉션 접시에 조직을 배치합니다.
- 도 1에 도시 된 위치에서 비장을 수확.이 경우, 복막 조심 절삭 비장에 액세스하는데 필요하다. 컬렉션 접시에 조직을 배치합니다.
- 더 많은 조직이 수확 될 경우 절차를 반복합니다. 그렇지 않으면 다음 단계로 진행합니다. 이 시점에서, 정렬 후 T 세포의 도금 할 때까지 얼음 상에 남아있는 모든 단계를 수행한다.
3. 조직 처리 및 CD4 + 심화
- 작은 백혈구 사망을 초래할 수있다 적혈구 용해를 필요로하지 않는 림프절 세포 제제 등의 수율을 높이기 위해 다른 요리의 림프절과 비장을 처리합니다. 따라서, 다음 단계가 별도로 정렬 라벨링 전에 조합 하였다 비장 및 림프절 개체군 처리 방법을 설명한다.
- PBS + 3 ㎖를 포함하는 새로운 60mm 접시에 수집 요리와 장소에서 조직 (비장 또는 풀링 림프절)를 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 조직을 통해 메쉬 멸균 나일론의 사각형을 배치합니다.
- 주사기 플런저의 엄지 손가락 쪽 (3-10 ml)에 타고 부드럽게 메시에 대한 조직을 분쇄. 거의 조직의 모든 현탁액에 가야한다. 또한, 두 개의 멸균 된 프로스트 슬라이드 사이에 조직을 배치하고 현탁액에 고요.
- 서스펜션 최대 피펫 몇 번 아래로 남아있는 수용성 덩어리를 분쇄 할 수 있습니다. 의 입구에 나일론 메쉬의 새로운 사각형 조각을 배치15ml의 원뿔형 튜브 및 잔여 파편을 제거하기 통해 현탁액을 필터.
- 반복하여 림프절과 비장 조직에 대해 2-4 단계를 반복합니다.
- 현탁액을 15 ㎖ 튜브로 여과 한 후 PBS +와 튜브의 나머지를 채우고 몇 번 반전. C. O 4에서 5 분 동안 475 XG에 세포를 원심 분리기
- 비장 세포의 경우, 다음의 원심 분리 상층 액을 흡인 및 적혈구를 용해시키기 위해 1 분 동안 비장 당 빙냉 1X ACK 용액 1 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁. 그 다음, ACK의 상부에 PBS + 10를 가하여 튜브를 반전 및 원심 XG 475 4 O C.에서 5 분간
- 림프절 세포, PBS + 2 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 흡인. 원하는 경우 이들 ACK들은 용해 및 세척 단계 이후에 비장 세포와 결합 될 수있다.
- PBS +의 또 다른 10ml에 비장 세포의 원심 분리에 resuspend 후에 뜨는을 대기음. 이 시점에서 림프절 정지가 될 수 있습니다비장 현탁액 위에 dded 티슈 풀링 정렬에 필요한 경우. C. O 4에서 5 분 동안 475 XG 다시 튜브를 원심
- 세포 펠렛은 이제 CD4 농축을 위해 준비 될 수있다. 이 단계를 수행하지 않을 경우, 정렬 준비 단계로 진행합니다.
- 고속 자기 세포 선별 시스템을 사용하여 CD4를 들어 농축, CD4 구슬 세포 펠렛을 재현 탁. 일반적으로 PBS + 85 μL에 희석 구슬의 15 μl를 1 마우스에서 조직에 라벨을 사용한다. 필요에 따라, 비드 혼합물의 부피 진입로 펠렛을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 내지 30 O 분간 부화
- , PBS + 10 mL로 세포를 씻어 O 4 ℃에서 5 분 동안 475 XG 다시 파편, 및 원심 분리기를 제거하기 위해 15 ㎖의 새로운 튜브에 나일론 통해 현탁액 합격
- 마우스 당 PBS의 + 100 ㎕의 펠렛을 재현 탁하고 고속 자기 세포 분류 시스템에 긍정적 인 선택으로 진행합니다. 수동 분리 시스템, F를 사용하면농축 제조업체의 지침을 ollow. 대안 적으로, FACS 완충액에서 재현 탁 샘플 : PBS를 1mM EDTA (PH = 8), 1 % BSA, 멸균 여과로.
- 긍정적 인 부분을 제거하고 PBS + 10ml의 다시 씻는다. 풍부한 CD4 + 분율은 지금 정렬에 표시 할 준비가되어 있습니다.
4. 정렬 나이브 CD4 + T 세포
- PBS는 CD62L, CD44, CD25, CD4 및 대항 함유 형광 항체 +를 세포 펠렛 레이블. 표 1에 열거 된 항체를 사용하는 경우, 각각의 희석 물이 제공된다. 염색의 경우, 항체 칵테일 100 ㎕의 부피는 한 마우스에서 조직 당 사용된다.
- 항체 칵테일 펠렛을 재현 탁하고 어두운 4 O C에서 15 ~ 30 분 동안 품어.
- 4 O ℃에서 PBS + 10ml의 원심 분리기 475 XG 5 분으로 세포를 씻으
- 다시 다른 나일론 필터 또는 셀 스트레이너 캡을 통해 혼합물 전달남은 파편을 이동합니다. 셀 소터에 대한 호환되는 튜브로 표지 된 세포를 피펫. 얼음에 세포를 유지하고 정렬 될 때까지 빛으로부터 보호.
- 셀 소터에 수집 호환 튜브의 하단에 전체 RPMI 미디어 또는 FBS의 1-2ml을 피펫 팅에 의해 수집 튜브를 준비합니다.
- 정렬 CD4 + CD25과 순진한 CD4 + T 세포 - CD62L + CD44 - 인구 (그림 2). 전체 RPMI 매체와 수집 된 세포를 씻으 전술 한 바와 같이 원심 분리기.
- 완전 RPMI에서 펠렛을 재현 탁 순진한 세포를 계산하고, 1 × 10 6 세포 / ml로 농도를 조절합니다.
5. 체외 분화 설정
- 항 CD3 및 안티 CD28 코팅 된 플레이트의 우물을 기음과 멸균 PBS (NO FBS) 1ml를 잘 각을 씻는다. 48- 웰 플레이트, RP 0.5 × 106 세포 / 웰에서 0.5 ml의 판형MI. 24 웰 플레이트, 문화 1 × 10 6 세포 RPMI의 / 웰에 1.0 ml의하십시오.
- 이러한 약물로서 인자의 영향을 테스트하기 전에 중 어느 적절한 웰에 물질을 추가하거나, 실험에 따라 분화 처리 후의 경우. 다음에, 따라서 사이토 카인 및 차단 항체로 배양 배지를 보충. TH0 : 30 U / ㎖ 된 hIL-2. TH1 : 15 NG / ㎖ rmIL-12, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 5000 및 NG / ㎖ 11B11.Th2 : 10 NG / ㎖ rmIL-4, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 2000 NG 37.51 수용성 ㎖ /, 5000 NG / ㎖ XMG1.2. iTreg : 15 NG / ㎖ hTGFβ, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 5000 NG / ㎖ XMG1.2, 5000 NG / ㎖ 11B11. Th17 : 20 NG / ㎖ rmIL-6, 3 NG / ㎖ hTGFβ, 5000 NG / ㎖ XMG1.2, 5000 NG / ㎖ 11B11.
주의 : 위에서 제시된 조건은 분화 실험 (대표 결과 부)의 끝에서 측정 한 사이토 카인 생성을 최대화하기위한 최적 인 것으로 밝혀졌다. 그러나 각 개개의 실험실 조건 (표 2에 최적화되어야 - 종래 유전자 발현 및 사이토 카인 생성의 분석 4-5 d 내지 5 % CO 2와 37 ℃로 플레이트를 인큐베이션. 대안 적으로, 확산 및 최종 수율을 향상시키기 위해 신선한 매체와 함께 1 × 106 세포 / ml로 조정 한 후 2 일 TCR 자극으로부터 세포를 제거하고, 새로운 웰 (비 코팅)에 접시. 이 경우, 편광 신선한 시토 킨 및 항체가 필요하지 않지만이 IL-10 U / ㎖의 TH0, TH1,은 Th2 및 iTreg 새로운 배양 배지에 첨가되어야한다.
분화 6. 분석
- 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 분석을 위해, / ㎖ 또는 1 μg의 이오 노마 이신 (예로서 brefeldin 골지체 억제제의 존재 하에서 4-6 시간 동안 항 CD3 / ㎖ 표 ng를 10ng / ㎖ PMA 및 1000으로 각 웰을 restimulate1). 세포 내 사이토 카인 염색법 실험에 따라 (그림 3)을 수행합니다.
주 : 얼룩 비 혈통 특정 사이토킨 또는 (도시되지 않음) IL-4 및 IFNγ와 같은 전사 인자, 음성 대조군으로서 분화 효율의 지표로서 각 조건 Th17 배양 용 (도 3). 또한, Tregs의 상호 개발과 같은 Th17 문화에 대한 얼룩은 Foxp3는 TGFβ의 추가로 발생할 수 있습니다. - 단백질 정량, 사이토 카인 특정 ELISA (그림 3)에 의해 각 웰과 분석의 상층 액을 수집합니다. 테스트되는 요인 대조 시료에 비해 증식 영향을 미쳤다 우려가있는 경우, 세포는, 세정 수, 정규화 계산하고 ELISA 분석을 위해 상등액을 수집하기 전에 24 시간 동안 항 CD3 1 ㎍ / ㎖로 재 자극. L 될 수 있다는 조건 IL-4, 세탁 restimulating 필요한은 Th2로부터는 IL-4를 제거하는 경우 시금초기 분화 문화 eftover.
- 실시간 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 수확 세포는 잠복기 후에, 세척 정상화 및 항 CD3 1 ㎍ / ml의 수확의 mRNA에 앞서 (도 3)으로 2-6 시간 동안 다시 자극한다.
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Representative Results
토륨 조건에 따라 달라질 수 분화 분석 시점은 T 세포 수용체 활성화의 강도뿐만 아니라 테스트되는. 분화 2-3 일 후, 세포를 T 세포 증식의 범위를 결정하기 위해 광학 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 세포의 광범위한 확산과 응집을 전시 웰스 가장 가능성이 가능성이 문화 4 일 후에 미디어를 배출합니다, 외인성 IL-2, 같은 TH1과은 Th2 등의 추가에 의존하는 일 4. 분화 조건에서 분석을위한 준비가 될 것입니다. 사이토 카인 생산을 극대화하기 위해, 지친 미디어와 같은 우물 신선한 RPMI는 IL-2를 포함하는 보충 또는 계산 및 IL-2는 또 다른 하루 이틀의 차별화를 확장 포함 신선한 RPMI 잘 당 1 × 10 6 세포에 다시는 도금 될 수있다 이 방법을 사용.
Figur핀 위치의 전자 1. 그림. 비장과 림프절의 분리를 위해 마우스를 고정 (A) 떨어져 사지를 확산하고 멸균 바늘 또는 해부 핀을 고정합니다. 이 위치에서, 부드럽게, 절단 후 (B). 턱에 꼬리를 세로 방향으로 털과 피부를 잘라 그림과 같이 림프절을 노출 떨어져 피부를 확산. 쉽게 위치에서 액세스 할 수있는 림프절의 위치는 그림에 나와 있습니다. 비장은 단지 동물의 오른쪽에있는 갈비뼈 아래에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
순진한 CD4의 분리 그림 2. 대표 정렬 전략 + T 세포에 의한 세포 분류>. 좌측 위로부터 시작하여, 림프구 제 크기 게이팅 된 후 세포 중항 이중선 세포로부터 구별하게된다. 단봉에 게이팅 CD4 + CD25 + nTregs있는 세포의 인구를 보여준다. 인구 다음 종류의 순진한 (CD62L + CD44 - -) 게이트 CD4 + CD25의 이펙터 / 메모리에서 (CD62L - CD44 +) CD4 + 세포. 점선 다음 플롯의 게이트 원점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
차별화 목 체외에서 다음과 같은 그림 3. 샘플 데이터입니다. (A) INTRACTH1,은 Th2, iTreg 발 (CD4 +에 게이트) ellular 싸이토카인 염색 데이터, Th17의 분화. 전형적으로, 이러한 Th17 배양에 대한 IL-4, IFNγ 비 혈통 특정 사이토 카인은, 분화의 품질을 결정하기 위해 염색한다. (B) ELISA 데이터는 분화, 세정 토륨 4 D, 및 세포의 24 시간에 restimulation 함께 다음 1 ㎍ / ㎖의 항 CD3과 함께 4 시간 동안 4 D 분화 및 restimulation 따라 계통 특이 전사 인자의 1 ㎍ / ㎖의 항 CD3. (C) 실시간 PCR 데이터. 미분화 나이브 T 세포는 유전자 발현의 기준 역할에서 모든 유전자 수량은 β-액틴과의 mRNA의 발현을 정상화했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아래 표 1 참조 자료 표.
| 시약 | 권장 적정 범위 |
| 사이토 카인 : | |
| 인간 (H) IL-2 | 5 U / ㎖ - 50 U / ㎖ |
| rmIL-4 | 5 NG / ㎖ - 30 NG / ㎖ |
| rmIL-6 | 5 NG / ㎖ - 30 NG / ㎖ |
| rmIL-12 | 10 NG / ㎖ - 30 NG / ㎖ |
| hTGFb (Th17) | 0.1 NG / ㎖ - 5 NG / ㎖ |
| hTGFb (iTreg) | 5 NG / ㎖ - 30 NG / ㎖ |
| 항체 : | |
| 2C11 (항 CD3) | 500 NG / ㎖ - 5,000 ng를 / ㎖ |
| 37.51 (항 CD28) | 250 NG / ㎖ - 2,500 ng를 / ㎖ |
| 11B11 (항 IL-4) | 5,000 - 10,000 ng를 / ㎖ |
| XMG1.2 (안티 IFNg) | 5,000 - 10,000 ng를 / ㎖ |
표 2는 차별화 조건의 최적화를위한 적정 범위를 추천합니다.
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Discussion
비장은 순진한 목 세포를 포함하는 동안, 림프절이 인구의 비율이 훨씬 높다. 제대로이 프로토콜에 림프절을 식별하고 제거하지 않으면 순진한 세포의 수율이 열악 발생합니다. 이것은 더 많은 지방 조직이 나이가 마우스 또는 수컷 마우스에서 특히 어려울 수 있습니다. 동물의 사지와 피부의 그림 1, 적절한 고정 및 피닝 (pinning)에 나타낸 바와 같이 접근 외부 림프절 쉽게 시각화 수 있습니다. 림프절 및 비장이 처리되면, 셀 정렬은 고순도 나이브 CD4 + T 세포 집단을 수득하는 바람직한 방법이다. 순도는 나이브 세포 분화 과정에 영향을 미치는 세포로부터 또는 토륨 nTregs 이펙터와 메모리를 방지하는 것이 중요하다. 나이브 T 세포의 높은 수율을 얻는데 어려움 통상 분리 단계 동안 비효율적 조직 수집 및 프로세싱 또는 세포의 손실에 의해 야기된다. 항복 메이크들 늘리려면URE 얼음에 감기 인큐베이션 완충제를 사용하여 셀을 처리한다. 또한, 미리 추천 시약 및 분리 프로토콜을 최적화 농축 및 / 또는 분류 동안 세포 손실을 방지한다. 프로토콜 단계의 곳곳에서 언급 한 바와 같이 마지막으로, 분화 조건이 대규모 실험을 (표 2)를 수행하기 전에 개별 실험실을 위해 최적화되어야한다.
개체군 -도 2에 도시 된 바와 같이, 나이브 CD4 + T 세포는 쉽게 nTreg (CD4 + CD25 +) 이펙터 (CD4 + CD44 + CD62L)로부터 구별 될 수있다. 정렬은 또한 비장과 림프절에 존재하는 서브 세트 Th이 이펙터의 오염을 방지하기 위해 가장 신뢰할 수있는 방법 중 하나이다. 분화 동안 TREG 오염 활성화의 억제뿐만 아니라 사이토 카인 생산의 원인이 될 수 있습니다. 이 발생할 수 있습니다 집합 목 기타 이펙터의 오염원하는 토륨 계통의 발전 저해 사이토 카인의 생산. 정렬 시설 비용은 높을 수 있으며 일부는이 프로토콜에 설명 된대로 시간을 정렬 줄이기 위해 자기 분리에 의해 CD4 + T 세포에 대한 풍부하기 쉽습니다. 소터가 없으면, 어떤 회사들은 지금 나이브 CD4 + T 세포의 분리를 위해 특별히 설계된 분리 키트를 제공한다. 그러나, 인구의 순도는 항상 정렬 샘플 유사한 분리 후에 확인해야한다. 메모리 / 이펙터 세포에 비해 나이브 CD4 + T 세포 (CD62L +)의 저주파의 발견 (CD44은 -) 등의 감염이나 종양 같은 마우스에 문제가 있음을 나타낼 수있다. 이 경우 세포는 이런 유형의 실험에 사용되어서는 안된다.
목 차별화의 효과를 결정하기 위해 꽤 몇 가지 방법이 있습니다. 단백질 분석은 전통적 사이토 카인 염색에 의해 수행된다특정 계보에 편광 된 순진한 세포의 비율의 아이디어를 줄 것이다 ING, (그림 3). ELISA에 의해 정량 단백질은 사이토 카인의 총량이 매체에 방출되는 결정하는 유용한 도구이다. 비록 ELISA 단백질 분석과주의 할 점은 시험되는 특정 요소 증식 및 생존에 영향을 미치는 경우 실험군 간의 비교 결과가 어려울 수도 있다는 것이다. 이 경우, 사이토킨을 생산하는 세포의 총 수는 실험의 끝에서 그룹간에 상이 할 수있다. 따라서, 세포 수를 정규화하고 잠시 동안 restimulating (예, 24 시간 동안 항 CD3)이 적절한 결과를 얻을 필요가있다. 또한, IL-4의 Th2 서브 세트의 생성을위한 편광 인자로서 사용되므로, 이러한 세포는 정규화 세정되어야하며, IL-4에 대한 ELISA를 수행하기 전에 재 자극. 실시간 PCR에 의한 유전자 발현 분석에서 F뿐만 아니라 유용또는 사이토 카인 유전자 전사의 분석뿐만 아니라, 계통 특이 전사 인자에 대한 (도 3). 그러므로, 실험에 따라, 토륨 분화의 효과를 분석하는 방법은 다양하다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜의 최적화를 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에서 의학 및 과학의 로잘린 프랭클린 대학의 레이놀즈 랩의 모든 구성원, 그리고 첸 동 연구소에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원 (K22AI104941)에서 JMR에 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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