Introduction
Konseptet med distinkte linjer eller undergrupper av CD4 + T helper (Th) celler har eksistert siden siste del av det 20. århundre en. Anerkjennelse av beslektet antigen i nærvær av ko-stimulerende signaler resulterer i flere runder med cellulær proliferasjon og den endelige differensiering til effektor Th-celler. Typen av Th-celle generert i løpet av denne prosessen er avhengig av cytokin miljø tilstede under aktiveringen 2. I begynnelsen var naive Th-celler tenkt å polar inn to distinkte linjene følgende T-celle reseptor (TCR) aktivisering, kostimulerende CD28 ligation, og cytokin signalering. Type 1-hjelperceller (Th 1) er kjennetegnet ved deres effektor produksjon av IFNy cytokin, så vel som deres krav for IL-12 signalisering i løpet av differensieringsprosessen 3,4. Til slutt ble det oppdaget at differensierte Th1-celler har en genetisk profil som er mest karakteristiske preget by uttrykk for T boksen familie transkripsjonsfaktor, Tbx21 (T-bet), som regnes som hoved regulator av Th1 genetisk program 5. Videre kan IL-12, så vel som IFNy fremmer T-bet ekspresjon 6,7. I immunrespons, Th1-celler er viktige for verten forsvar mot intracellulære patogener samt sterke arrangører av autoimmun betennelse. I motsetning til dette, type 2-hjelperceller (Th2) krever IL-4 for deres utvikling og deres effektor cytokiner, inkludert IL-4, IL-5 og IL-13, er viktig for å drive B-celle responser og er patogene i allergi 8, 9. I likhet med Th1-celler, ble Th2-celler funnet å uttrykke sin egen herre transkripsjonell regulator, betegnes GATA-3 10,11. Interessant, tilstedeværelse av polariserende cytokiner og generering av en bestemt Th avstamning er antagonistisk til utvikling av andre, 2,12, noe som tyder på at bare en bestemt Th undergruppe kan bli dominerende under en immungjenrespons.
Etter identifikasjon av Th1 og Th2-cellelinjer, har ytterligere arbeid vist enda mer unik undergrupper av T-hjelperceller, inkludert follikulær hjelper (TFH), IL-9-produserende (Th9), og IL-22-produksjon (Th22) (nylig anmeldt i 13). Ved anvendelse av in vitro differensiering eksperimenter, vil denne protokollen fokusere ytterligere bare på to Th undergrupper, betegnet regulatoriske T-celler (treg) og IL-17-produksjon av CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriske T-celler kan skje naturlig (nTreg) i thymus; naive Th-celler kan også fremkalles (iTreg) til å bli regulatorisk i periferien (anmeldt i 14,15). Begge typer Tregs uttrykke et karakteristisk transkripsjonsfaktor betegnet gaffelhodeboks P3 (foxp3), som er avgjørende for deres effektor undertrykkingsmekanismer som omfatter oppløselige anti-inflammatorisk mediator produksjon, IL-2-forbruk, og celle-kontakt-avhengige mekanismer 14,15. Mangelen på Foxp3 uttrykk gir en alvorlig, multi-organ autoimmun lidelse kalt immunfeilregulering, polyendocrinopathy, enteropati, X-bundet syndrom (IPEX), demonstrere kritisk rolle denne Th undergruppe i å løse betennelse og regulere perifer toleranse for selv antigener 16. In vitro, naive CD4 + T-hjelperceller oppregulerer foxp3 og bli forpliktet til treg programmet ved stimulering med IL-2 og TGF-β 14,15. Det kan være moderat til stor plastisitet i CD4 + T-celle-cellelinjer, spesielt når man vurderer bare cytokinproduksjon (oversikt i 17,18). Men i forbindelse med in vitro differensiering protokoller, vi skal diskutere hver undergruppe som en unik avstamning.
Nylig ble en undergruppe av Th17-celler som produserer IL-17 cytokin identifisert som et unikt avstamning med proinflammatoriske funksjoner som er særlig patogene under autoimmun inflammasjon 19-21. Th17 celler uttrykker en unik transkripsjonsfaktor, kalt retinoid relaterte foreldreløs reseptor gamma t (RORγt) som koordinerer Th17 genetisk program 22. TGFp er viktig for generering av Th17 avstamning gjennom induksjon av RORγt. Imidlertid er effekten av TGFp signale antas å bare indusere Th17 satsing på synergizing med IL-6 (anmeldt i 12). Videre studier har vist at en rekke andre signaler som positivt kan regulere Th17 engasjement, inkludert IL-1β, økt natrium og TLR signale 23-26. Andre rapporter har antydet at de patogene Th17-celler in vivo, er de som faktisk omgår TGFp signalering og i stedet stole på en kombinasjon av IL-1, IL-6 og IL-23 for 27 deres differensiering. Således kan Th17-celler være avledet fra en rekke forskjellige signalveier; for anvendelsen av denne protokollen, vanlig brukte (TGFp og IL-6) veien for Th17 avstamning engasjementvil bli presentert.
Differensieringen protokollen beskrevet under for alle effektor linjene er avhengig av fast antistoff som stimuli for TCR og CD28 gjennom hele løpet av eksperimentet. Men andre har vist at TCR aktivering med antigen-presenterende celler 28 eller tverrbinding anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer med hamster-antistoff i 2 dager, 29 er også svært effektivt middel for å indusere dannelsen av forskjellige Th-undergrupper. Protokollen presenteres her bygger på tidligere rapporterte metoder for å isolere murine CD4 + T-celler fra sekundære lymfoide organer 30 og generere Th17 celler 31. En hovedforskjell er at denne protokollen er avhengig av bruk av en cellesorterer å isolere naive CD4 + T-celler fra lymfevev. Men mange bedrifter nå tilby raske separasjons kits som kan berike for naive CD4 + T-celler, som kan være i stand til å omgå kravet feller sortering, avhengig av forsøket. De fremgangsmåter og reagenser som er presentert i denne protokollen er det vi rutinemessig bruk, og finner for å være den mest effektive. Men husk at alternative reagenser og metoder finnes for mange av trinnene som presenteres nedenfor, og det er opp til den enkelte lab for å finne ut hva som fungerer best for deres formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer utføres ved hjelp av protokoller godkjent av kontoret of Environmental Health and Safety ved Rosalind Franklin medisinske og vitenskapelige universitet. C57BL / 6 mus (kjøpt fra NCI) som brukes for denne protokollen ble plassert under bestemte patogenfrie forhold, og alle dyreforsøk ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Rosalind Franklin medisinske og vitenskap.
1. Klargjøring av instrumenter, rekvisita, og reagenser
- Belegge 48-brønners eller 24-brønners plater med anti-CD3 og anti-CD28 (tabell 1) i steril PBS, dekselet og pakk i parafilm for å forhindre fordamping og forurensning, og deretter inkuberes O / N ved 4 ° C dagen før T celleisolasjon. Alternativt frakk brønner 1 time ved 37 o C. Utføre Th0, TM1, TM2, og iTreg betingelser ved å belegge både anti-CD3 og anti-CD28 ved 1 ug / ml i 0,5 til 1 ml tiltal volum (48-brønns plate). For Th17, vi vanligvis belegge anti-CD3 ved 2 ug / ml, og anti-CD28 ved 1 ug / ml.
NB: Det er funnet at en lavere anti-CD3-konsentrasjonen er optimal for Th1, Th2, og iTreg generasjon, mens en høyere anti-CD3-konsentrasjonen er optimal for Th17 generasjon. Således bør anti-CD3 og anti-CD28-konsentrasjoner titreres og optimaliseres for individuelle laboratorier (tabell 2). - Sterilisere et sett av disseksjon verktøy (saks og tang) av autoklav eller desinfeksjonsmiddel. Et rør eller et lite begerglass inneholdende 70% etanol, vil være nødvendig for rask sterilisering av verktøy mellom dissections. Endelig vil en sprayflaske inneholdende 70% etanol være nødvendig for sterilisering av overflaten på mus før disseksjon.
- Forberede en disseksjon overflate ved å pakke en flat stykke isopor eller korktavle i aluminiumsfolie. Dissekere pinner eller nåler brukes til å fikse dyret på plass.
- Forberede retter eller plater for innsamling av tissues. Hvis pooling vev, separate 60 mm skåler inneholdende 3 ml steril PBS + 1% FBS (PBS +) for milt og lymfeknute vev er tilstrekkelig. Dersom holde vev fra individuelle mus skille, forberede en 24-brønns plate som inneholder 1 ml PBS + i ønsket antall brønner.
- Forbered fullstendig RPMI media for cellekultur, og pre-varme før bruk (tabell 1).
MERK: Vi rutinemessig bruker RPMI men andre medier som IMDM og DMEM kan være like effektive eller bedre avhengig av lab og eksperimentet. - Snitt 2x2 cm kvadrater av nylon mesh med en 120 um porestørrelse og autoklav for å sterilisere (tabell 1).
- Valgfritt: Hvis du bruker høyhastighets magnetisk celle sorteringssystem som autoMACS for CD4 + celle berikelse, pre-rennende, varmt og skylling buffere i en 37 o C vannbad for å unngå skade på maskinen.
- MERK: Enrichment anbefales å øke sorteringsutbytte og redusere sortering tid.
- Altfremstillingstrinn, med unntak av disseksjon, bør utføres i en steril vevskultur hette.
2. Isolering av lymfeknuter og milt fra Mus
- Avlive den nødvendige antall dyr med et institusjonelt-godkjent teknikk. Bruk C57BL / 6 hunnmus, alder 5-10 wks, på grunn av sin høye andel av naive T-celler og underkroppen fett i forhold til hanner eller til eldre mus.
MERK: Celler som stammer fra hannmus vil utføre tilsvar in vitro og protokoll trinnene forblir den samme. Hunnmus, 5-10 wks gamle, vil typisk gi 3-6 x 10 6 naive CD4 + T celler per mus. Imidlertid kan ved hjelp av ulike stammer av mus påvirke avkastning og ytelse. For eksempel kan celler fra C57BL / 6-mus er bedre for generering av Th1-celler, mens celler fra mus Balb.c er bedre for generering av Th2-celler. - Spre lemmer av dyret og feste dem på plass som vist i figur 1. Skjær huden lengeitudinally fra anus til haken samtidig være forsiktig for ikke å punktere dypere vev.
- Spread åpne huden med pinsett og pin huden på plass for å gi enkel tilgang til lymfeknuter som vist i figur 1.
- Høste tilgjengelige lymfeknuter fra de som er vist i figur 1 steder. Griper lymfeknute med en pinsett mens skille vev med en annen pinsett vil tillate for enkel fjerning. Plasser vev i samlingen fatet.
- Høste milten fra plasseringen vist i figur 1. I dette tilfelle er imidlertid skjæring i peritoneum nødvendig for å få tilgang til milten. Plasser vev i en samling tallerken.
- Gjenta prosedyren dersom flere vev vil bli slaktet. Ellers går du videre til neste trinn. På dette punkt utfører alle de gjenværende trinn på is inntil den plettering av T-celler etter sortering.
3. Tissue Processing og CD4 + Enrichment
- Behandle lymfeknuter og milt i forskjellige retter å øke utbyttet som lymfeknutecellepreparater ikke krever erytrocytt lyse, noe som kan føre til mindre leukocytt død. Derfor, kan fremgangsmåten beskriver en metode for behandling av milt og lymfeknute populasjoner separat etterfulgt ved å kombinere før merking for sortering.
- Ta av vev (milt eller sammenslåtte lymfeknuter) fra samlingen tallerken og legg i en ny 60 mm fatet inneholder 3 ml PBS +. Plasser et torg i steril nylon mesh over vev ved hjelp av steriliserte tang.
- Ta tommelen side av en sprøytestempelet (3-10 ml) og forsiktig knuse vevet mot nettingen. Nesten alt av vevet bør gå i suspensjon. Alternativt kan man legge vev mellom to autoclaved frostet lysbilder og slipt til suspensjon.
- Pipetter suspensjon opp og ned et par ganger for å bryte opp de resterende løselige klumper. Plasser en ny firkantet stykke nylonnetting over åpningen av en15 ml konisk rør og filtrere suspensjonen gjennom for å fjerne gjenværende rester.
- Gjenta trinn 2-4 for ytterligere lymfeknute og splenic vev.
- Når suspensjonen er blitt filtrert i et 15 ml rør fylle resten av røret med PBS + og invertere et par ganger. Sentrifuger cellene ved 475 x g i 5 min ved 4 o C.
- For miltceller, aspirere supernatanten etter sentrifugering, og cellepelleten suspenderes i 1 ml iskald 1X ACK-løsning per milt i 1 min for å lysere erytrocytter. Deretter legge til 10 ml PBS + på toppen av ACK, Snu røret, og sentrifuger 475 xg i 5 min ved 4 o C.
- For lymfeknuteceller, aspirere supernatanten og resuspender i 2 ml PBS +. Om ønsket kan disse kombineres med miltceller etter deres ACK lyse og vasketrinn.
- Aspirere supernatanten etter sentrifugering av splenocyttene og resuspender i ytterligere 10 ml PBS +. På dette punktet lymfeknute suspensjon kan være endded på toppen av miltsuspensjon hvis vev pooling er nødvendig for sortering. Sentrifuger i røret igjen ved 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- Cellepelleten kan nå være forberedt på CD4 berikelse. Hvis dette ikke vil bli utført, fortsett til sorterings forberedelse trinn.
- For CD4 anrikning ved hjelp av høyhastighets-magnetisk cellesortering system, resuspender den cellulære pelleten med CD4-perler. Typisk 15 ul av perler fortynnet i 85 ul PBS + brukes til å merke vev fra en mus. Rampen opp volumet av perleblanding som trengs, resuspender pelleten, og inkuberes i 15-30 min ved 4 o C.
- Vask cellene med 10 ml PBS +, passerer suspensjonen gjennom nylon inn i et nytt 15 ml rør for å fjerne rusk og sentrifuger på nytt ved 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- Resuspender pelleten i 100 mL PBS + per mus og fortsett til positiv seleksjon på high-speed magnetisk celle sorteringssystem. Hvis du bruker en manuell separasjon system, følge produsentens instruksjoner for berikelse. Alternativt resuspender prøvene i FACS-buffer: PBS med 1 mM EDTA (pH = 8) og 1% BSA, sterilfiltrert.
- Fjern den positive brøkdel og vaske igjen med 10 ml PBS +. Den anrikede CD4 + fraksjon er nå klar til å bli merket for sortering.
4. Sortering naive CD4 + T-celler
- Merke celle pellet med PBS + inneholder fluorescerende antistoffer rettet mot CD62L, CD44, CD25, og CD4. Ved å bruke antistoffer som er oppført i tabell 1, blir fortynninger for hvert gitt. For farging, er et 100 ul volum av antistoff-cocktail anvendt pr vev fra en mus.
- Resuspender pelleten i antistoff cocktail og inkuberes i 15-30 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene med 10 ml PBS + og sentrifuger 475 xg i 5 minutter ved 4 o C.
- Passerer blandingen over en annen nylonfilter eller cellefilter hetten for å reflytte noen left rusk. Pipettere de merkede celler i et rør som er kompatibel for cellesorterer. Hold celler på is og beskyttet fra lys til slikt.
- Forberede samling rør ved å pipettere 1-2ml av komplette RPMI media eller FBS inn i bunnen av rørene kompatible for samling på en celle sorter.
- Sorter de naive CD4 + T-celler som en CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - befolkningen (figur 2). Vask de innsamlede celler med komplett RPMI-medium og sentrifugeres som beskrevet ovenfor.
- Resuspender pelleten i fullstendig RPMI, telle naive celler, og justere konsentrasjonen til en x 10 6 celler / ml.
5. Sette opp In vitro Differensiering
- Aspireres brønnene i de anti-CD3 og anti-CD28-belagte plater og vaske hver brønn med 1 ml steril PBS (uten FBS). For 48-brønners plater, plate 0,5 x 10 6 celler / brønn i 0,5 ml RPMI. For 24-brønners plater, kultur 1 x 10 6 celler / brønn i 1,0 ml RPMI.
- Ved å teste innvirkningen av en faktor slik som et medikament legge stoffet til de aktuelle brønner, enten før, under eller etter differensieringsprosessen, avhengig av forsøket. Deretter supplere kultur media med cytokiner og blokkerer antistoffer tilsvarende. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2, og 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml oppløselig 37,51, og 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 og 5000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 og 5000 ng / ml 11B11.
MERK: Forholdene er presentert ovenfor, ble funnet å være optimalt for å maksimere cytokinproduksjon som målt ved slutten av differensieringen eksperimentet (Representative resultater avsnitt). Imidlertid bør hver tilstand være optimalisert for individuelle laboratorier (Tabell 2 - Inkuber platen ved 37 ° C med 5% CO2 i 4-5 dager før analyse av genekspresjon og cytokinproduksjon. Alternativt fjerne cellene fra TCR stimuli etter 2 d, justert til 1 x 10 6 celler / ml med friskt medium, og platen i nye brønner (ikke-belagt) for å forbedre proliferasjon og sluttutbyttet. I dette tilfellet er friske polariserende cytokiner og antistoffer ikke nødvendig, men 10 U / ml IL-2 bør legges til nye medier for Th0, Th1, Th2, og iTreg kulturer.
6. Analyse av Differensiering
- For cytokin-analyse ved strømningscytometri, restimulere hver brønn med 10 ng / ml PMA og 1000 ng / ml ionomycin eller 1 pg / ml anti-CD3 i 4-6 timer i nærvær av en inhibitor som Golgi Brefeldin A (tabell1). Utføre intracellulær cytokin farging, avhengig av eksperimentet (figur 3).
MERK: Flekk ikke-avstamning-spesifikke cytokiner eller transkripsjonsfaktorer, slik som IL-4 (ikke vist) og IFNy (figur 3) for Th17 kulturer, for hver tilstand som negative kontroller, og som en indikator på differensiering effektivitet. Videre kan flekken foxp3 for Th17 kulturer som den resiproke utvikling av Tregs forekomme ved tilsetning av TGFp. - For kvantifisering protein, samle supernatantene fra hver brønn og analyse av cytokin-spesifikke ELISA (figur 3). Hvis det er bekymring for at faktoren som blir testet har påvirket proliferasjon sammenlignet med kontrollprøver, kan cellene vaskes, telles, normalisert, og deretter restimulert med 1 ug / ml anti-CD3 i 24 timer før oppsamling av supernatanter for ELISA-analyser. Ved analysering av IL-4 fra Th2 betingelser, vasking og restimulating er nødvendig å fjerne IL-4 som kan være leftover fra den første differensiering kultur.
- Genekspresjonsanalyser av real time PCR for, slakte celler etter inkubasjonstiden, vaske, normalisere, og re-stimulere for 2-6 t med en mikrogram / ml anti-CD3 før høsting mRNA (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidspunktet for analyse av differensiering kan variere avhengig av Th tilstand som testes, så vel som styrken av T-celle-reseptor-aktivering. Etter 2-3 dager med differensiering, kan cellene bli visualisert ved lysmikroskopi for å bestemme graden av T-celle-proliferasjon. Wells stiller omfattende spredning og klumper av celler vil mest sannsynlig være klar for analyse på dag 4. Differensierings forhold stole på tillegg av eksogene IL-2, som Th1 og Th2, vil trolig eksos media etter 4 dager i kultur. Å maksimere cytokin produksjon, kan slike brønner med utslitte media fylles opp med frisk RPMI inneholder IL-2 eller telles og re-belagt på 1 x 10 6 celler per brønn i frisk RPMI inneholder IL-2 for å forlenge differensiering for en dag eller to ved hjelp av denne metoden.
Figure 1. Illustrasjon av pin plassering for å fikse en mus for isolering av milt og lymfeknuter. (A) Spre bena fra hverandre og fest dem med en steril nål eller disseksjon pin. Fra denne posisjonen, klippe pels og hud lengderetningen fra halen til haken. (B) Etter kutting, forsiktig spre huden fra hverandre for å eksponere de lymfeknutene som vist på bildet. Plassering av lymfeknuter som er lett tilgjengelig fra denne posisjonen er oppført i bildet. Milten ligger like under brystkasse på høyre side av dyret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative sortering strategi for isolering av naive CD4 + T-celler ved celle sortering. Starter fra øverst til venstre, lymfocytter er først gated etter størrelse og deretter singlet celler blir diskriminert fra dublett celler. Gating på singlets avslører en befolkning på CD4 + CD25 + celler som er nTregs. Gate på CD4 + CD25 - befolkning og deretter sortere naive (CD62L + CD44 -) fra effektor / minne (CD62L - CD44 +) CD4 + celler. Stiplede linjer indikerer gate opprinnelsen til neste tomten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksempel på data etter in vitro Th differensiering. (A) Intracellular cytokin flekker data (gated på CD4 +) fra Th1, Th2, iTreg og Th17 differensieringer. Typisk, ikke-avstamning spesifikke cytokiner, slik som IL-4 og IFNy for Th17 kulturer bør være farget for å bestemme kvaliteten på differensiering. (B) ELISA-data etter 4 d Th differensiering, vasking, og 24 h restimulering av celler med 1 mikrogram / ml anti-CD3. (C) Real time PCR data fra avstamning-spesifikke transkripsjonsfaktorer følgende fire d differensiering og restimulering for 4 timer med 1 mikrogram / ml anti-CD3. Alle genet mengdene var normalisert til uttrykk av β-aktin og mRNA fra udifferensierte naive T-celler tjene som basis for genuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Se Materialer tabell nedenfor.
| Reagens | Anbefalt Titrering Range |
| Cytokiner: | |
| Humant (h) IL-2- | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antistoffer: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5,000 ng / ml |
| 37.51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2,500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5000 - 10 000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5000 - 10 000 ng / ml |
Tabell 2. Anbefalt Titrering Range for optimalisering av differensiering betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens milten inneholder naive Th-celler, er andelen av denne populasjonen i lymfeknuter mye høyere. Unnlatelse av å identifisere og fjerne lymfeknuter i denne protokollen vil resultere i et dårlig utbytte av naive celler. Dette kan være spesielt vanskelig i eldre mus eller hannmus som har mer fettvev. Som vist i figur 1, riktig fiksering og låsing av de animalske lemmer og huden vil tillate enklere visualisering av de tilgjengelige utvendige lymfeknuter. Når lymfeknuter og milt er behandlet, er cellesortering den foretrukne fremgangsmåte for å oppnå et høyt renset naive CD4 + T-celle-populasjon. Purity er avgjørende for å hindre nTregs eller effektor og minne Th celler fra å påvirke den naive celledifferensiering prosess. Vanskeligheter med å få en høy avkastning av naive T-celler forårsakes vanligvis av ineffektiv vev innsamling og behandling eller tap av celler under separasjonstrinn. Å øke utbyttet make sure å behandle cellene ved hjelp av kalde buffere og inkubasjoner på is. Videre, for å forhindre tap av celler i løpet av anrikning og / eller sortering, optimalisering av reagenser og protokoller separasjons forhånd er anbefalt. Til slutt, som nevnt på ulike steder i protokollen trinnene, differensiering forholdene skal være optimalisert for individuelle laboratorier før du utfører storskalaforsøk (tabell 2).
Som vist i figur 2, naive CD4 + T-celler kan lett skilles fra den nTreg (CD4 + CD25 +) og effektor (CD4 + CD44 + CD62L -) populasjoner. Sortering er en av de mest pålitelige måter å hindre forurensning av effektor Th undergrupper, som også finnes i milten og lymfeknutene. Treg forurensning under differensiering kan resultere i undertrykkelse av aktivering samt cytokinproduksjon. Forurensning av andre effektor Th undergrupper kan resultere iproduksjon av cytokiner som er hemmende for utvikling av de ønskede Th-linjer. Sortering anlegg avgifter kan være dyrt, og noen finner ut at det er lettere å berike for CD4 + T celler ved magnetisk separasjon for å kutte ned på sortering tid som beskrevet i denne protokollen. I fravær av en sorter, noen selskaper tilbyr nå separasjons kits som er spesielt utviklet for isolering av naive CD4 + T-celler. Imidlertid bør renheten av befolkningen alltid kontrolleres etter separasjon, lik sortert prøver. Funnet av en lav frekvens av naive CD4 + T-celler (CD62L +) i forhold til minne / effektor-celler (CD44 -) kan indikere et problem med mus, som for eksempel en infeksjon eller tumor. I dette tilfelle cellene ikke bør brukes for denne type forsøk.
Det er ganske mange måter å fastslå effektiviteten av Th differensiering. Protein analyse er tradisjonelt utført av cytokin flekkening, noe som vil gi et inntrykk av hvor stor prosentandel av naive celler som har blitt polarisert til en bestemt avstamning (figur 3). Protein kvantifisering av ELISA er også et nyttig verktøy for å bestemme den totale mengden av cytokiner blir gitt ut i media. Det forbeholdet med ELISA protein analyse skjønt er at sammenligne resultatene mellom eksperimentelle grupper kan være vanskelig hvis en bestemt faktor som blir testet har en innvirkning på spredning og overlevelse. I dette tilfelle kan det totale antall av celler som produserer cytokiner være forskjellig mellom gruppene ved slutten av forsøket. Således normalisering av celletall og restimulating for en kort tidsperiode (for eksempel, anti-CD3 i 24 timer) som er nødvendig for å oppnå passende resultater. Videre, IL-4 er brukt som en polariserende faktor for generering av Th2-delsett, slik at disse celler skal vaskes, normalisert og restimulert før gjennomføring av en ELISA for IL-4. Genekspresjonsanalyser av real time PCR er nyttig ikke bare feller analyse av cytokin gentranskripsjon, men også for avstamning-spesifikke transkripsjonsfaktorer (figur 3). Således, avhengig av eksperimentet, er det forskjellige måter for å bestemme effektiviteten av Th differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Reynolds lab ved Rosalind Franklin medisinske og vitenskapelige universitet, og Chen Dong lab ved University of Texas MD Anderson Cancer Center for optimalisering av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning til JMR fra National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
