Introduction
Begreppet distinkta linjer eller undergrupper av CD4 + T-hjälpar (Th) celler har funnits sedan slutet av 20-talet 1. Erkännande av besläktade antigen i närvaro av samstimulerande signaler resulterar i flera omgångar av cellulär proliferation och den slutligen differentiering till effektor Th-celler. Den typ av Th-celler som genereras under denna process är beroende av cytokin miljön närvarande under aktivering 2. Inledningsvis var naiva Th-celler tänkt att polarisera i 2 distinkta linjer efter T-cellsreceptor (TCR) aktivering, samstimulatorisk CD28 tion, och cytokin signalering. Typ 1-hjälparceller (Th1) kännetecknas av sin effektor produktionen av IFNy-cytokin samt deras krav för IL-12-signalering under differentieringsprocessen 3,4. Så småningom upptäcktes att differentierade Th1 celler har en genetisk profil som är mest tydligt präglas by expressionen av T behållaren familj transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), som anses vara huvudregulator av Th1 genetiska program 5. Vidare kan IL-12 samt IFNy främja T-bet uttryck 6,7. I immunsvaret, Th1-celler är viktiga för värd försvar mot intracellulära patogener samt starka främjare av autoimmun inflammation. I kontrast, typ 2 hjälparceller (Th2) kräver IL-4 för sin utveckling och deras effektorfunktioner cytokiner, innefattande IL-4, IL-5 och IL-13, är viktiga för att driva B-cellsvar och är patogena i allergi 8, 9. Liknar Th1-celler, Th2 celler fann att uttrycka sin egen herre transkriptionsregulator, benämnd GATA-3 10,11. Intressant, närvaron av polariserande cytokiner och generering av en specifik Th härstamning är antagonistiska till utvecklingen av andras 2,12, vilket tyder på att endast en viss Th delmängd kan bli dominerande under en immun reResponse.
Eftersom identifieringen av Th1 och Th2 härstamningar, har ytterligare arbete visat ännu mer unika delmängder av T-hjälparceller, däribland follikulär hjälpare (TFH), IL-9-producerande (Th9), och IL-22-producerande (Th22) (nyligen ses över 13). Vid tillämpning av in vitro-differentieringsexperiment kommer detta protokoll att fokusera ytterligare endast på två Th delmängder, benämnda regulatoriska T-celler (Treg) och IL-17-producerande CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriska T-celler kan förekomma naturligt (nTreg) i tymus; naiva Th-celler kan också induceras (iTreg) att bli reglerings i periferin (översikt i 14,15). Båda typerna av tregs uttrycka en karakteristisk transkriptionsfaktor, benämnd forkhead låda P3 (Foxp3), vilket är avgörande för att de effektor undertryckande mekanismer som inkluderar lösliga antiinflammatorisk mediator produktion, IL-2 konsumtion, och cellkontaktberoende mekanismer 14,15. Bristen på Foxp3 uttryck resulterar i en allvarlig, multi-organ autoimmun sjukdom kallas immun dysreglering, polyendocrinopathy, enteropathy, X-bunden syndrom (IPEX), visar den kritiska roll denna Th delmängd lösa inflammation och reglera perifer tolerans mot självantigener 16. In vitro, naiva CD4 + T-hjälparceller uppreglera Foxp3 och bli engagerad i Treg-programmet vid stimulering med IL-2 och TGF-β 14,15. Det kan vara måttlig till stor plasticitet i CD4 + T-cellinjer, speciellt när man överväger endast cytokinproduktion (ses över 17,18). Men i samband med in vitro differentiering protokoll, vi kommer att diskutera varje delmängd som en unik härstamning.
Nyligen genomfördes en delmängd av Th17 celler som producerar IL-17 cytokin identifierats som en unik härstamning med proinflammatoriska funktioner som är särskilt patogena under autoimmun inflammation 19-21. Th17 celler uttrycker en unik transkriptionsfaktor, benämnd retinoid relaterade föräldralös receptor gamma t (RORγt) som samordnar Th17 genetiska programmet 22. TGFp är viktigt för generering av Th17 härstamning genom induktion av RORγt. Emellertid är effekten av TGFp-signalering tros endast inducera Th17 åtagande vid synergizing med IL-6 (översikt i 12). Ytterligare studier har visat att en rad andra signaler som positivt kan reglera Th17 engagemang, inklusive IL-1β, ökad natrium- och TLR signalering 23-26. Andra rapporter har antytt att de patogena Th17 celler in vivo är de som faktiskt kringgår TGPP signalering och istället förlita sig på en kombination av IL-1, IL-6 och IL-23 för deras differentiering 27. Sålunda kan Th17 celler härledas från en mängd olika signalvägar; vid tillämpningen av detta protokoll, den vanligt förekommande (TGF och IL-6) väg för Th17 härstamning engagemangkommer att presenteras.
De differentierings protokoll som beskrivs nedan för alla effektor härstamningar bygger på fasta antikropp som stimuli för TCR och CD28 under hela loppet av experimentet. Men andra har visat att TCR aktivering med antigenpresenterande celler 28 eller tvärbindning anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar med hamster antikropp för 2 dagar 29 är också mycket effektivt medel för att inducera generering av olika Th delmängder. Protokollet presenteras här bygger på tidigare rapporterade metoder för att isolera murina CD4 + T-celler från sekundära lymfoida organ 30 och generera Th17 celler 31. En stor skillnad är att detta protokoll förlitar sig på användning av en cellsorterare för att isolera naiva CD4 + T-celler från lymfoid vävnad. Men många företag erbjuder nu snabba separations kit som kan berika för naiva CD4 + T-celler, vilket kanske kan kringgå kravet feller sorterings beroende på experimentet. De metoder och reagens som presenteras i detta protokoll är det vi använder rutinmässigt och finna att vara den mest effektiva. Men tänk på att alternativa reagens och metoder finns för många av de steg som presenteras nedan och det är upp till den enskilda labbet för att avgöra vad som fungerar bäst för sina syften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utförs med protokoll som godkänts av kontor Environmental Health and Safety vid Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6-möss (köpt från NCI) som används för detta protokoll inhystes under specifika patogenfria förhållanden, och alla djurexperiment utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Rosalind Franklin University of Medicine and Vetenskap.
1. Beredning av instrument, förbrukningsartiklar och reagenser
- Coat 48-brunnars eller 24-brunnars plattor med anti-CD3 och anti-CD28 (tabell 1) i steril PBS, omslag och svep i parafilm för att förhindra avdunstning och förorening, och sedan inkubera O / N vid 4 ° C dagen innan T cellisolering. Alternativt coat brunnar en timme vid 37 ° C. Utför Th0, Th1, Th2, och iTreg betingelser genom att belägga både anti-CD3 och anti-CD28 vid 1 | ig / ml i 0,5 till 1 ml tilltal volym (48-brunnar). För Th17, vi typiskt kappa anti-CD3 vid 2 | ig / ml och anti-CD28 på 1 pg / ml.
OBS: Vi har funnit att en lägre anti-CD3-koncentration är optimal för Th1, Th2, och iTreg generering medan en högre anti-CD3-koncentration är optimal för Th17 generation. Således bör anti-CD3 och anti-CD28-koncentrationer titreras och optimeras för individuella laboratorier (tabell 2). - Sterilisera en uppsättning dissektion verktyg (sax och pincett) med autoklav eller desinfektionslösning. Ett rör eller liten bägare innehållande 70% etanol kommer att behövas för snabb sterilisering av verktyg mellan dissektioner. Slutligen kommer en sprayflaska innehållande 70% etanol behövas för sterilisering av ytan av musen innan dissekering.
- Bered en dissektion yta genom att linda ett plant stycke av Styrofoam eller board i aluminiumfolie. Dissekera stift eller nålar används för att fixera djuret på plats.
- Förbered rätter eller plattor för insamling av tissues. Om sammanföra vävnader, separata 60mm rätter som innehåller 3 ml steril PBS + 1% FBS (PBS +) för mjälte och lymfkörtlar vävnader räcker. Om hålla vävnader från enskilda möss separat, förbereda en 24-brunnar innehåller 1 ml PBS + i önskat antal brunnar.
- Förbered komplett RPMI-medium för cellodling och pre-varm innan användning (Tabell 1).
OBS: Vi använder rutinmässigt RPMI men andra medier såsom IMDM och DMEM kan vara lika effektiva eller bättre beroende på labbet och experimentet. - Skär 2x2 cm rutor av nylon mesh med en 120 nm porstorlek och autoklav för att sterilisera (tabell 1).
- Tillval: Om du använder höghastighets magnetisk cellsortering system såsom autoMACS för CD4 + celler anrikning, pre-rinnande varmt och sköljning buffertar i ett 37 ° C vattenbad för att förhindra skador på maskinen.
- OBS: Anrikning rekommenderas att öka sorterings avkastningen och minska sorteringstiden.
- Alltberedningssteg, med undantag för dissektion, bör utföras i en steril vävnadsodling huva.
2. Isolering av lymfknutor och mjälte från möss
- Euthanize erforderligt antal djur som använder ett institutionellt godkänd teknik. Använd C57BL / 6 honmöss, ålder 5-10 veckor, på grund av sin höga andel av naiva T-celler och lägre kroppsfett jämfört med män eller äldre möss.
OBS: Celler härledda från hanmöss kommer att utföra liknande sätt in vitro och de protokollsteg förblir desamma. Honmöss, 5-10 wks gamla, kommer typiskt att ge 3-6 x 10 6 naiva CD4 + T-celler per mus. Emellertid kan med hjälp av olika stammar av möss påverkar avkastning och prestanda. Till exempel kan celler från C57BL / 6-möss är bättre för alstring Th1-celler medan celler från Balb.c möss är bättre för alstring Th2-celler. - Sprid lemmar djuret och stift dem på plats som visas i figur 1. Skär huden långaitudinally från anus till hakan och samtidigt vara noga med att inte punktera djupare vävnad.
- Spread öppna huden med pincett och nåla huden på plats för att ge enkel tillgång till lymfkörtlar som visas i figur 1.
- Skörda tillgängliga lymfkörtlarna från platser som visas i figur 1. Ta tag i lymfkörteln med en pincett samtidigt separera vävnad med en annan pincett kommer att möjliggöra enkel borttagning. Placera vävnaden i uppsamlingsskål.
- Harvest mjälten från den plats som visas i figur 1. I detta fall behövs noggrann skärning i bukhinnan för att få tillgång till mjälten. Placera vävnaden i en samling maträtt.
- Upprepa proceduren om fler vävnader kommer att skördas. Annars gå vidare till nästa steg. Vid denna punkt, utföra alla återstående stegen på is till plätering av T-cellerna efter sortering.
3. Vävnads Bearbetning och CD4 + Anrikning
- Behandla lymfkörtlar och mjälte i olika rätter att öka utbytet som lymfkörtelcellpreparat inte kräver erytrocytlys, vilket kan leda till lättare leukocyt döden. Därför följande steg beskriver en metod för behandling av mjälten och lymfkörtel populationer separat följt av att kombinera före märkning för sortering.
- Ta vävnaden (mjälte eller poolade lymfkörtlar) från uppsamlingsskål och lägg i en ny 60 mm skål innehållande 3 ml PBS +. Placera en bit steril nylonnät över vävnaden med hjälp steriliserade pincett.
- Ta tummen sidan av en sprutkolv (3-10 ml) och försiktigt krossa vävnaden mot nätet. Nästan alla av vävnaden bör gå in i suspensionen. Alternativt, placera vävnaden mellan två autoklave frostat diabilder och slipas i suspension.
- Pipetupphängnings upp och ner några gånger för att bryta upp de återstående lösliga klumpar. Placera en ny fyrkantig bit nylonnät över öppningen av en15 ml koniska rör och filtrera suspensionen genom att avlägsna återstående skräp.
- Upprepa steg 2-4 för ytterligare lymfkörtel och mjälten vävnad.
- När suspensionen har filtrerats in i en 15 ml tub fylla resten av röret med PBS + och invertera några gånger. Centrifugera cellerna vid 475 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- För mjältceller, aspirera supernatanten efter centrifugering och resuspendera cellpelleten i 1 ml iskall 1X ACK lösning per mjälte i 1 min för att lysera erytrocyter. Tillsätt sedan 10 ml PBS + ovanpå ACK, vänd röret, och centrifugera 475 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- För lymfkörtelceller, aspirera supernatanten och återsuspendera i 2 ml PBS +. Om så önskas kan dessa kombineras med mjältceller efter deras ACK lys och tvättsteg.
- Aspirera supernatanten efter centrifugering av splenocyterna och återsuspendera i ytterligare 10 ml PBS +. Vid denna punkt kan lymfkörteln fjädring vara endded ovanpå mjälten indragning om vävnads pooling krävs för sortering. Centrifugera röret igen vid 475 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Cellpelleten kan nu vara beredd på CD4 anrikning. Om det här steget inte kommer att utföras, vidare till sorteringsberedningssteg.
- För CD4 berikning med höghastighetståg magnetisk cellsorteringssystem, suspendera den cellulära pelleten med CD4 pärlor. Typiskt 15 il pärlor utspädda i 85 ul PBS + används för att märka de vävnader från en mus. Ramp upp volymen av pärlan blandning som behövs, suspendera pelleten, och inkubera i 15-30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 10 ml PBS +, passera suspensionen genom nylon in i en ny 15 ml tub för att avlägsna skräp, och centrifugera igen vid 475 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Suspendera pelleten i 100 l PBS + per mus och gå vidare till positiv selektion på höghastighetståg magnetisk cellsorteringssystem. Om du använder en manuell separationssystem, följ tillverkarens anvisningar för anrikning. Alternativt resuspendera proverna i FACS-buffert: PBS med 1 mM EDTA (pH = 8) och 1% BSA, sterilfiltrerad.
- Ta den positiva fraktionen och tvätta igen med 10 ml PBS +. Den berikade CD4 + fraktionen är nu redo att märkas för sortering.
4. Sorterings Naiv CD4 + T-celler
- Märk cellpelleten med PBS + innehåller fluorescerande antikroppar riktade mot CD62L, CD44, CD25, och CD4. Om med användning av de antikroppar som listas i tabell 1, är spädningar som respektive tillhandahålls. För färgning, är en 100 | il volym av antikroppscocktail används per vävnader från en mus.
- Återsuspendera pelleten i antikroppscocktail och inkubera under 15-30 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 10 ml PBS + och centrifugera 475 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Passera blandningen över en annan nylonfilter eller cell sil lock att återflytta all överbliven skräp. Pipet de märkta cellerna in i ett rör som är kompatibel för cellsorterare. Håll celler på is och skyddas från ljus tills sorteringen.
- Förbered insamlingsrören genom att pipettera 1-2ml av kompletta RPMI media eller FBS i botten av rör kompatibla för insamling på en cellsorterare.
- Sortera de naiva CD4 + T-celler som CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - populationen (Figur 2). Tvätta de uppsamlade cellerna med komplett RPMI-medium och centrifugera som beskrivits ovan.
- Återsuspendera pelleten i fullständigt RPMI, räkna de naiva celler, och justera koncentrationen till 1 x 10 6 celler / ml.
5. Installera In vitro-differentiering
- Aspirera brunnarna i anti-CD3 och anti-CD28-belagda plattor och tvätta varje brunn med 1 ml steril PBS (ingen FBS). För 48-brunnars plattor, plåt 0,5 x 10 6 celler / brunn i 0,5 ml RPMI. För 24-brunnars plattor, kultur 1 x 10 6 celler / brunn i 1,0 ml RPMI.
- Om testning av påverkan av en faktor såsom en drog lägga till ämnet till de lämpliga brunnarna antingen före, under, eller efter differentieringsprocessen beroende på experimentet. Nästa, komplettera odlingsmedia med cytokiner och blockerande antikroppar därefter. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2, och 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml löslig 37,51, och 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2, och 5000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2, och 5000 ng / ml 11B11.
OBS: De villkor som presenteras ovan befanns vara optimalt för att maximera cytokinproduktion mätt vid slutet av differentieringsexperiment (Representativa resultat avsnitt). Dock bör varje tillstånd optimeras för enskilda laboratorier (tabell 2 - Inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO2 under 4-5 dagarna före analys av genuttryck och cytokinproduktion. Alternativt, ta bort celler från TCR stimuli efter 2 d, justerat till 1 x 10 6 celler / ml med färskt medium, och plattan i nya brunnar (icke-belagda) för att öka spridning och slutliga utbytet. I detta fall är färska polarise cytokiner och antikroppar som inte behövs men 10 U / ml IL-2 ska läggas till nya medier för Th0, Th1, Th2 och iTreg kulturer.
6. Analys av differentiering
- För cytokin analys medelst flödescytometri, restimulate varje brunn med 10 ng / ml PMA och 1000 ng / ml jonomycin eller 1 pg / ml anti-CD3 under 4-6 h i närvaro av ett Golgi-inhibitor såsom brefeldin A (tabell1). Utför intracellulär cytokin färgning beroende på experimentet (Figur 3).
OBS: Stain icke-härstamning specifika cytokiner eller transkriptionsfaktörer, såsom IL-4 (ej visad) och IFNy (figur 3) för Th17 kulturer, för varje tillstånd som negativa kontroller och som en indikator på differentiering effektivitet. Vidare kan bets Foxp3 för Th17 kulturer som den ömsesidiga utvecklingen av tregs ske med tillägg av TGF. - För protein kvantifiering, samla supernatanterna från varje brunn och analys av cytokin-specifik ELISA (Figur 3). Om det finns en oro för att den faktor som testas har påverkat spridningen jämfört med kontrollprover, kan cellerna tvättas, räknas, normaliserad, och sedan återstimulerades med 1 mikrogram / ml anti-CD3 för 24 timmar före samla supernatanter för ELISA-analyser. Om analys av IL-4 från Th2-betingelser, tvättning och restimulating är nödvändigt att avlägsna IL-4 som kan vara leftover från den initiala differentiering kulturen.
- För genuttrycksanalys genom realtids-PCR, skörd celler efter inkubationstiden, tvätta, normalisera, och åter stimulera till 2-6 h med 1 mikrogram / ml anti-CD3 före skörd mRNA (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidspunkten för analysen av differentiering kan variera beroende på Th tillståndet som testas liksom styrkan i T-cellreceptoraktivering. Efter 2-3 dagar av differentiering kan celler visualiseras genom Ijusmikroskopi för att bestämma graden av T-cellproliferation. Brunnar som uppvisar omfattande spridning och klumpar av celler kommer sannolikt att vara redo för analys på dag 4. Differentiering förhållanden som förlitar sig på tillsättning av exogen IL-2, som Th1 och Th2, kommer sannolikt uttömma media efter 4 dagar i kultur. För att maximera cytokinproduktion kan sådana brunnar med utmattade medier fyllas med färsk RPMI innehållande IL-2 eller räknades och åter pläterades vid 1 x 10 6 celler per brunn i färsk RPMI innehållande IL-2 för att förlänga differentiering till en annan dag eller två med denna metod.
Figure 1. Illustration av stift placering för att fixa en mus för isolering av mjälte och lymfkörtlar. (A) Sprid benen isär och fixera dem med en steril nål eller dissektion stift. Från denna position, klippa pälsen och huden längdled från svansen till hakan. (B) Efter kapning, försiktigt isär huden att exponera lymfkörtlarna som visas på bilden. Platserna för lymfkörtlar som är lätt åtkomliga från detta läge är listade i bilden. Mjälten ligger strax under revbenen på höger sida av djuret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant sorterings strategi för isolering av naiva CD4 + T-celler genom cellsortering. Från det övre vänstra, lymfocyter först gated efter storlek och sedan sing celler diskrimineras från doublet celler. Gating på sing avslöjar en population av CD4 + CD25 + celler som är nTregs. Gate på CD4 + CD25 - befolkning och sedan sortera naiva (CD62L + CD44 -) från effektor / minne (CD62L - CD44 +) CD4 + celler. Prickade linjer indikerar grinden ursprung nästa tomten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på uppgifter efter in vitro Th differentiering. (A) Intracellular cytokin färgning data (gated på CD4 +) från Th1, Th2, iTreg och Th17 differentieringar. Typiskt, icke-härstamning specifika cytokiner, såsom IL-4 och IFNy för Th17 odlingarna, bör färgas för att bestämma kvaliteten på differentiering. (B) ELISA-data efter 4 d Th differentiering, tvättning och 24 h återstimulering av celler med 1 pg / ml anti-CD3. (C) Real time PCR uppgifter av härstamningsspecifika transkriptionsfaktorer efter 4 d differentiering och återstimulering under 4 timmar med 1 | ig / ml anti-CD3. Alla gen mängder normaliserades till uttryck av β-aktin och mRNA från odifferentierade naiva T-celler tjänar som baslinje för genuttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Se Material tabellen nedan.
| Reagens | Rekommenderad Titrering Range |
| Cytokiner: | |
| Humant (h) IL-2 | 5 U / ml - 50 U / ml |
| rmIL-4 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-6 | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| rmIL-12 | 10 ng / ml - 30 ng / ml |
| hTGFb (Th17) | 0,1 ng / ml - 5 ng / ml |
| hTGFb (iTreg) | 5 ng / ml - 30 ng / ml |
| Antibodies: | |
| 2C11 (anti-CD3) | 500 ng / ml - 5000 ng / ml |
| 37,51 (anti-CD28) | 250 ng / ml - 2500 ng / ml |
| 11B11 (anti-IL-4) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | 5.000 - 10.000 ng / ml |
Tabell 2. Rekommenderad Titrering Range för optimering av differentiering Villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan mjälten innehåller naiva Th-celler, är den andel av denna population i lymfkörtlar mycket högre. Underlåtenhet att korrekt identifiera och avlägsna lymfkörtlar i detta protokoll kommer att resultera i en dåligt utbyte av naiva celler. Detta kan vara särskilt svårt i äldre möss eller hanmöss som har mer fettvävnad. Såsom visas i fig 1, fastsättning och nålning av de djur lemmar och huden kommer att möjliggöra enklare visualisering av de åtkomliga yttre lymfkörtlar. När lymfkörtlar och mjälte bearbetas, är cellsortering den lämpligaste metoden för att erhålla ett höggradigt renat naiv CD4 + T-cellpopulation. Renhet är avgörande för att förhindra nTregs eller effektor och minne Th celler från att påverka den naiva celldifferentiering process. Svårigheter att få en hög avkastning av naiva T-celler orsakas vanligen av ineffektiv insamling och behandling eller förlust av celler vävnad under separationssteg. För att öka avkastningen make sure att bearbeta cellerna använder kalla buffertar och inkubationer på is. Dessutom, för att förhindra förlust av celler under anrikning och / eller sortering, optimera reagenser och separationsprotokoll förväg rekommenderas. Slutligen, som nämnts på olika ställen i protokollsteg, differentieringsförhållanden bör optimeras för enskilda laboratorier innan du utför storskaliga experiment (tabell 2).
Såsom visas i fig 2, naiva CD4 + T-celler kan enkelt särskiljas från nTreg (CD4 + CD25 +) och effektor (CD4 + CD44 + CD62L -) populationer. Sortering är en av de mest pålitliga sätten att förhindra kontaminering av effektor Th delmängder, som också finns i mjälten och lymfkörtlarna. Treg kontamination under differentieringen kan resultera i undertryckande av aktivering liksom cytokinproduktion. Förorening av andra effektor Th delmängder kan resultera iproduktionen av cytokiner som är hämmande på utvecklingen av önskade Th härstamningar. Sorteringsanläggning avgifter kan vara dyrt och en del tycker att det är lättare att anrika CD4 + T-celler genom magnetisk separation för att skära ner på sorteringstiden som beskrivs i detta protokoll. I avsaknad av en sorterare, vissa företag erbjuder nu separations kit som utformats speciellt för isolering av naiva CD4 + T-celler. Dock bör alltid kontrolleras renhet av befolkningen efter separation, liknande sorterade prover. Upptäckten av en låg frekvens av naiva CD4 + T-celler (CD62L +) i jämförelse med minnet / effektorceller (CD44 -) kan tyda på ett problem med musen, såsom en infektion eller tumör. I detta fall är cellerna inte bör användas för denna typ av experiment.
Det finns en hel del sätt att bestämma effektiviteten av Th differentiering. Proteinanalys traditionellt utförs av cytokin fläckenning, vilket kommer att ge en uppfattning om den procentuella andelen naiva celler som har polariserat till en specifik härstamning (Figur 3). Protein kvantifiering med ELISA är också ett användbart verktyg för att bestämma den totala mängden cytokiner släpps ut i media. Den varning med ELISA proteinanalys är dock att jämföra resultat mellan experimentella grupper kan vara svårt om en viss faktor som testas har inverkan på spridning och överlevnad. I detta fall kan det totala antalet celler som producerar cytokiner vara olika mellan grupperna vid slutet av experimentet. Således normalisera cellräkning och restimulating under en kort tid (t.ex. anti-CD3 under 24 timmar) är nödvändigt för att få lämpliga resultat. Vidare är IL-4 som används som ett polariserande faktor för generering av Th2 delmängden, så dessa celler måste tvättas, normaliserade, och återstimulerades före genomförandet av en ELISA för IL-4. Genuttrycksanalys genom realtids-PCR är användbar inte bara feller analys av cytokin gentranskription, utan också för linjespecifika transkriptionsfaktorer (figur 3). Således, beroende på experimentet, finns det olika sätt att analysera effektiviteten av Th differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i Reynolds labbet vid Rosalind Franklin University of Medicine and Science, och Chen Dong labbet vid University of Texas MD Anderson Cancer Center för optimering av detta protokoll. Detta arbete stöddes av ett bidrag till JMR från National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
