Introduction
Il cancro della vescica è uno dei tumori più comuni del tratto urogenitale, con circa 75.000 nuovi casi ogni anno negli Stati Uniti 1. Alti tassi di recidiva richiedono un follow-up per tutta la vita, il che rende il cancro della vescica uno dei tumori più costoso da trattare. Il trattamento gold standard per l'alta qualità NMIBC è la resezione trans-uretrale, seguita da immunoterapia intravescicale con BCG. Sebbene il meccanismo preciso della attività anti-tumorale di BCG rimane da chiarire, si ammette che l'attivazione di una risposta immune cellulo-mediata arricchito in T helper (Th) 1 e T citotossici (Tc) 1 cellule è fondamentale per il successo della terapia 2.
Nonostante il fatto che BCG rimane il trattamento di scelta per NMIBC, un'alta percentuale di pazienti non rispondono alla terapia; inoltre può causare una serie di effetti collaterali: circa il 70% dei tumori trattati ripresentarsi dopo qualche tempo e ~ 15% di avanzamento al modulo muscolo-invasivo dellamalattia. Altri effetti indesiderati associati al trattamento con BCG comprendono disuria, cistiti e infezioni renali 3-6.
Lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche deve prendere in considerazione l'uso di modelli preclinici, dopo valutazione iniziale in vitro; questo è particolarmente rilevante nei tumori le cui microambiente possono influenzare in modo significativo il loro sviluppo e la risposta al trattamento.
Negli ultimi dieci anni, abbiamo affrontato molteplici aspetti dell'attività immunomodulante di HP-NAP, una proteina prodotta dal batterio Helicobacter pylori, inizialmente identificato come in grado di promuovere l'adesione endoteliale di cellule polimorfonucleati (PMN) 7. Strutturalmente, HP-NAP appartiene alla proteina-DNA protezione in condizioni di fame (Dps) famiglia 8 e si compone di 12 subunità identiche disposte in un guscio dodecameric.
Abbiamo dimostrato che HP-NAP èun recettore Toll-like (TLR) 2 agonisti, con una forte attività immunomodulante responsabile per guidare la differenziazione dei linfociti T verso il fenotipo Th1, sia in vitro che in vivo 9-10. In virtù di tale attività, HP-NAP è in grado di reindirizzare la risposta immunitaria Th2 nella risposta Th1 più vantaggioso in un modello murino di asma allergica 11.
Per valutare il potenziale anti-tumorale Th1-dipendente di HP-NAP, abbiamo approfittato di un modello murino di cancro alla vescica sviluppato diversi anni fa da O'Donnel e colleghi 12 per valutare l'impatto della gestione BCG.
Con questo protocollo, dimostriamo che HP-NAP ha un forte potenziale antitumorale contro il cancro alla vescica e che l'efficacia della somministrazione di HP-NAP parallelo l'accumulo significativo, all'interno dei nodi del tumore e linfonodi regionali, di entrambi i linfociti Th1 e Tc1 produzione di interferone ( IFN) -γ 13
La presente relazione fornisce un protocollo passo per passo, in dettaglio la preparazione degli animali, la cateterizzazione uretrale, la combustione chimica necessaria per il fissaggio delle cellule di mucosa vescicale, e l'iniezione delle cellule tumorali. Noi descriviamo anche la somministrazione topica di HP-NAP che può essere considerato come un prototipo di agenti terapeutici sviluppati per il trattamento del cancro della vescica. Le prove ottenute confrontando i tumori isolati dal controllo e HP-NAP-animali trattati non solo sottolinea il fatto che HP-NAP potrebbe essere un buon candidato per l'immunoterapia del cancro della vescica, ma anche l'efficacia generale del set up sperimentale.
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Protocol
Tutte le procedure per la movimentazione degli animali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (204/2011-B DM).
1. Gli animali
- Grow C57BL6 / J topi femmina a 8 settimane di età in gabbie a ventilazione individuale con filtri microisolation.
Nota: Le femmine sono preferiti perché la conformazione anatomica del loro apparato uro-genitale esterno rende la cateterizzazione più facile che nei maschi.
Culture 2. Cella
- Mantenere il mouse uroteliale linea cellulare di carcinoma MB49 in RPMI 1640 supplementato con mezzo di siero bovino fetale inattivato al calore 10% e 50 ug / ml di gentamicina a 37 ° C in umidificata al 5% CO 2.
- Crescere cellule MB49 in T-75 palloni al 80% di confluenza. Trypsinize e risospendere a 0.5 × 10 5-0,5 × 10 6 cellule per 150 ml di PBS prima dell'impianto in topi.
3. intravescicale Tumore Implant
- Anestetizzare topi utilizzando una miscela del Zoletil anestetici e xylor (33 mg / kg e 20 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale.
- Mettere gli animali in posizione supina e fissare le zampe posteriori per il pad con lo scotch. Zampe devono essere sufficientemente separati per rendere il meato ben visibile e facilmente accessibile per l'inserimento del catetere uretrale.
- Nota: per la cateterizzazione, un catetere venoso pediatrico 24 G è adatto per 8 a 10 settimane di età topi. La scelta del catetere è molto importante al fine di evitare infiltrazioni di liquidi tra la parete ed il catetere uretrale. Grandi cateteri calibro devono essere usati per i topi più grandi o più anziani.
- Usando un piccolo pinza, un pizzico uno spigolo della parte esterna dell'uretra e ruotarlo molto dolcemente verso il "lato testa" dei topi. Questa azione espone il meato uretrale.
- Rimuovere l'ago interno del catetere e inserire quest'ultimo nell'uretra con un angolo di 45 °, leggermente orientataverso la "coda" dei topi. Non forzare l'ingresso del catetere; in caso di resistenza, basta ruotare il catetere molto delicatamente, fino a farlo scivolare all'interno dell'uretra. Quando circa 0.5-0.8 cm del catetere è nell'uretra, posizionare accuratamente il catetere parallelo alla coda dei topi e inserirla completamente.
- Usando una siringa da 1 ml, l'ago che deve essere inserito nel catetere, lavare la vescica da urina residua iniettando 200-300 ml di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
- Nota: Quando si somministra PBS, la vescica si riempirà e un gonfiore sarà visibile tra le zampe posteriori dei topi; Questo conferma che la cateterizzazione sia corretto. La maggior parte dei cateteri hanno un volume morto che deve essere considerato nel calcolo del volume di iniezione.
- Usando una siringa sterile da 1 ml, iniettare 200 ml di 0,1 N HCl. Riempire la vescica al fine di bruciare tutta la sua parete. Dopo 10 secondi, rimuovere tutto l'acido e neutrali subitoze iniettando 200 ml di 0,1 N NaOH con una siringa sterile. In caso di iniezione del maggior numero di cellule (0,5 x 10 6), la fase di acidificazione non è necessaria.
- Aspirare tutto il liquido residuo e sciacquare immediatamente la cavità con 300 ml di PBS sterile.
- Svuotare la vescica tramite aspirazione, e iniettare 150 ml di PBS contenenti cellule MB49 (range 0,5 × 10 5 - 0,5 x 10 6) nella vescica. Lasciare la siringa assemblata al catetere per evitare la fuoriuscita di cellule. E 'meglio per garantire la siringa fissandolo al pad con lo scotch.
- Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra, e posizionare i topi nella gabbia, sotto una lampada a incandescenza finché si svegliano: questo avviene di solito tra 1 e 2 ore dopo la fine del trattamento.
4. Consegna intravescicale di HP-NAP
- Nota: Almeno 3 giorni dopo instillazione cella, è possibile iniziare latrattamento.
- Cateterizzare come descritto ai punti da 3.1 a 3.4. In questa fase, non è necessario per bruciare la parete della vescica con HCl.
- Usando una siringa da 1 ml, lavare la vescica da urina residua iniettando 200-300 ml di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
- Iniettare 50 mg di HP-NAP per 150 l di PBS nella vescica. Lasciare la siringa attaccata al catetere per evitare perdite della soluzione proteica. Fissare la siringa fissandolo al pad con lo scotch.
- Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra e posizionare i topi nella gabbia, sotto una lampada ad incandescenza, fino si svegliano.
5. tumorale espianti e analisi istologica
- Alla fine del trattamento, sacrificare gli animali, metterli in posizione supina e fissare le zampe posteriori per il pad con lo scotch.
- Usando un bisturi chirurgico, fare un'incisione verticale lunga circa 1,52 centimetri attraverso la pelle e laperitoneo, a partire proprio sopra genitali esterni alla "testata" dei topi. Per minimizzare il rischio di danneggiare la vescica, prestare particolare attenzione alla profondità del taglio.
- La vescica sarà posizionato nel centro-sinistra del taglio e il tumore sarà visibile come una massa di colore rosa / viola scuro. Al momento della sua escissione, posizionare l'intera vescica in una gabbia istologico e fissare nel 10% formalina tamponata prima inclusione in paraffina.
- Per analisi istologiche e istochimiche immunitario, preparare sezioni seriali della vescica (46 micron di spessore) con un microtomo standard.
- Macchiare le sezioni con ematossilina / eosina e procedere con il calcolo della dimensione del tumore (D xd 2) e determinando la percentuale di necrosi per area della sezione trasversale utilizzando un computer assistita analizzatore di immagini.
- Per il conteggio nave, procedere colorazione delle sezioni per il marcatore endoteliale CD31 / PECAM, utilizzando una tecnica dell'immunoperossidasi standard. Eseguire la scansione delle sezioni di unat bassa potenza (4 ×) per identificare la zona di massima densità vascolare. All'interno di questa regione, contare i singoli microvasi in cinque campi aleatori separati ad alta potenza (20 ×).
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Representative Results
La Figura 1 mostra la tecnica di cateterizzazione; il mouse è cateterizzato e instillato con 0,5 × 10 6 MB49 cellule. Il trattamento con HP-NAP è iniziato 3 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali, per consentire loro di attaccare alla parete della vescica e proliferare. Tutti gli animali appartenenti al gruppo di controllo sviluppano tumore; alcuni di essi possono morire prima della fine del periodo di 13 giorno a causa dell'occlusione dell'uretra.
Dopo la prima iniezione con HP-NAP, gli animali vengono trattati ogni tre giorni, per un totale di quattro iniezioni. Alla fine dell'esperimento, al giorno tredici, gli animali vengono sacrificati e le vesciche raccolto per l'analisi istologica istochimica e immunitario. Come mostrato in Figura 2A, il volume del tumore all'interno della vescica da topi HP-NAP-trattata è significativamente inferiore a quella del tumore di topi trattati con veicolo (220 ± 62 millimetri 3 vs 830 ± 180 millimetri 3).
È interessante notare che, mentre negli animali trattati con veicolo tumore invade il tessuto adiposo sottostante, in 7 degli 8 animali HP-NAP-trattati il tumore è confinato all'interno della parete della vescica (Figura 2B). Infine, vascolarizzazione è ridotta e l'estensione della necrosi è aumentata in topi HP-NAP-trattati, rispetto agli animali di controllo (Figura 2B e C).
Figura 1. Topi cateterizzazione. Topi femmina sono anestetizzati e cateterizzati mediante una cannula sterile 24 G. Il pannello di destra è l'ingrandimento della scatola nera. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Attività anti-tumorale di HP-NAP. Topi, impiantato al giorno 0 con MB49 cellule (0,5 × 10 6), sono trattati con 50 mg di HP-NAP o PBS (veicolo) nei giorni 3, 6, 9 e 12. Tutti gli animali vengono uccisi a giorno 13. (A) Rappresentante analisi istologica su vesciche isolati da topi di controllo e gli animali HP-NAP-trattati, e il volume del tumore quantificazione. (B) ingrandimento delle sezioni del pannello A e la percentuale di necrosi nei due gruppi di animali. (C) vesciche asportato, colorate per CD31 / PECAM; Sono mostrati sezioni rappresentative di controllo e gli animali HP-NAP-trattata. Quantificazione di densità dei microvasi (C, pannello di destra); HPF, campi alta potenza. I dati rappresentano medio SD ±; n = 8 topi per gruppo. Significatività statistica è stata determinata da t-test di Student (** p <0.01). Figura modificata da Codolo etal. 13. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La maggior parte dei progressi nella terapia del cancro richiede test su modelli animali prima di iniziare le sperimentazioni cliniche. La possibilità di studiare biologia tumorale in vivo, approfittando di modelli animali, rappresenta uno strumento fondamentale per i ricercatori che studiano patogenesi del cancro, consentendo la valutazione dei diversi approcci terapeutici. Modelli ortotopico rimangono il gold standard 14-15, sia per l'enorme quantità di linee cellulari disponibili per impostare un modello di tumore e perché imitano l'ambiente del tumore naturale 16.
Inoltre, la creazione di modelli ortotopici di cancro nei topi singenici, come descritto qui, è particolarmente rilevante nel caso di studi volti ad indagare nuove strategie terapeutiche basate sulla immunoterapia, dal momento che questi ultimi non sono possibili nei topi deficienti immunitarie che subiscono xenoimplants.
La metodologia descritta in questo protocollo descrive tha cateterizzazione di uretra topo femmina che permette sia l'inoculazione delle cellule tumorali e la somministrazione di agenti terapeutici nella cavità della vescica.
Il vantaggio di precondizionamento parete vescica attraverso un'ustione acida (come descritto sopra, invece di altri approcci, come l'uso di tripsina o poli-lisina), è quello di promuovere lo sviluppo di tumori grandi e altamente invasive. Al contrario, precondizionamento con tripsina e poli-lisina, risultati nei tumori più piccole e meno invasive, probabilmente a causa di un effetto dannoso dei residui di tali sostanze sulla vitalità delle cellule tumorali 17. L'ustione acido preferisce anche un altro sistema precondizionamento basato su cauterizzazione elettrica perché quest'ultimo può provocare la perforazione della parete della vescica e la diffusione del tumore nel peritoneo 18.
Il protocollo è stato ottimizzato per studi di breve durata (~ 13 giorni). Impianto del prNumero oper di cellule è fondamentale, dal momento che un numero di cellulare più alto si tradurrà in più rapida crescita del tumore e, eventualmente, la perdita di animali a causa della grande massa tumorale. Inoltre, fino a quando l'utente diventa sicuro con la tecnica, vi è un certo rischio di danneggiare l'uretra o la vescica, provocando così la morte degli animali. Nella nostra esperienza, tuttavia, se gli animali sono adeguatamente gestiti (e quindi non morire durante la procedura), vivono senza soffrire per tutta la durata degli esperimenti (13 giorni). Inoltre, riducendo il numero di cellule iniettate, è possibile prolungare la durata degli esperimenti.
Abbiamo utilizzato questo modello per valutare l'attività anti-tumorale della proteina HP-NAP prodotte da Helicobacter pylori, con lo scopo di migliorare, ed eventualmente sostituire, la terapia corrente in base BCG con uno nuovo dotato di un più elevato benefici / effetti collaterali rapporto. Più in generale, questo approccio sperimentale può essere adottato in tutti i pre-clinivalutazioni CAL che richiedono l'erogazione di agenti terapeutici nella cavità vescicale.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Ministero dell'Università e della Ricerca italiano, progetti PRIN e Progetti di Ricerca di Ateneo, concedere N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, concedere N ° 2011-0485 per MdB, e Finanziamento Giovani Studiosi, Università di Padova, a Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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