Abstract
생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다.
여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H 2 O 2 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 사멸을 유발 1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다.
ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H 2 O 2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 활성 산소 분자는 항산화 방어 메커니즘을 탈출 및 산화 적 손상을 초래할. 감지, 복구 및 손상된 세포 성분의 저하는 산화 스트레스 1,2시 필수적인 방어 전략이다.
스트레스 저항 특히 산화 스트레스에 관여하는 신호 전달 경로 것은 매우 진화 (10, 11)를 보존하고 있습니다. 생명체의 조건이 부분적으로 만 재생되는 세포 배양 실험, 12, 13은 큰 의미를 가지고 모델 생물에서 산화 스트레스의 연구와는 달리. C. 엘레는 막 다른 쉽고 저렴하게 할 수있는 자유 생활 선충이다한천 매체에 세균 잔디밭에 냈다는. 그것은 크기가 작고 일반적으로 (약 1 길이 ㎜) 및 유전자 조작을 용이하게하는 자기 시비 자웅 동체로 성장한다. 그것은 빠른 라이프 사이클과 높은 생식 능력, 세대 당 약 300 자손을 생산하고 그것을 대규모 유전 스크린 (14)을 수행 할 수있는 강력한 도구를하고있다. C. elegans의 게놈 염기 서열을 완전히하고 유전자 40-50 %가 인간의 질병 관련 유전자 15 ~ 18의 동체가 될 것으로 예상된다. 의 RNAi를 사용하여 관심의 유전자의 최저 신속하고 C에서 쉽게 엘레. 유전자 다운 조절은 E. 동물을 공급함으로써 달성 될 수있다 관심 19의 mRNA를 표적의 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드를 대장균 박테리아 항구. 따라서, 대규모의 RNAi 스크린을 이용한 유전자 기능의 결정은 암 (20, 21)을 포함하여 인간의 질병을 이해하는데 큰 영향을 미친다.
O의 연구C에서 xidative 스트레스 저항 엘레은 산화 스트레스 13,22에 대한 저항의 보존 메커니즘의 식별을 주도했다. 확인 된 일부 경로는 저산소증, 열, 삼투압 스트레스 같은 다른 스트레스뿐만 아니라 이러한 장수와 저항을 조절하는 일반적인 경로이다. 이 경로는 인슐린 신호, TOR 신호, 그리고 자식 작용을 포함한다. 다른 주요 경로는, 또는 손상의 수리 등의 열 충격 및 보호자 단백질 11,13,22 같은 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 효소와 카탈라아제 효소로 활성 산소의 해독을 포함한다.
이 프로토콜은 C의 산화 적 스트레스에 대한 저항을 확인하는 방법에 대해 설명합니다 액체에 간스. 우리는 이전에 C. 손실시 flcn -1- (ok975)를 산화 적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 보여 주었다 때문에 우리는 프로토콜을 설명하기 flcn -1- (ok975) 및 야생형 동물을 사용 엘레 (23). 우리는 또한이 증가 저항이 달려 있음을 보여 주었다AMPK와 자식 작용, 세포 생체 에너지를 향상시키고 응력 저항 (23)을 촉진 시그널링 축. PQ는 반응성 산소 종 (24)를 생성하기 위해 전자 전달계를 방해 산화성 스트레스이다. 같은 분석은 적용 할 수 있고, 다른 ROS 소스 또는 활성 산소 생성 화합물은 H 2 O 2와 로테 논 등 사용할 수 있습니다. 유사한 분석은 PQ의 낮은 농도 (25, 26)를 사용하는 플레이트에 개발되어왔다. 이 분석의 장점은 매우 빠르고, 그 결과는 하루에 획득 될 수 있다는 것이다. 또한, 96 웰 플레이트에서 산화 적 스트레스 저항성 검정을 수행하는 데 사용되는 액체의 총량은 PQ - 함유 플레이트를 제조하는 데 사용되는 체적에 비해 낮다. 따라서, 사용 된 PQ의 양이 분석에서 액체 인 것은 저가 분석을 렌더링하고 유해 폐기물의 생성을 제한하는 낮다. 그러나, 플레이트 분석에 비해이 분석의 한계 라 포함액체 분석에서 음식과 액체 산소의 낮은 농도의 CK는 공기에 비해. 이러한 경우에, 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 따라서,이 분석에서 얻어진 결과를 지원하기 위해 권장 산화 스트레스 저항성 다른 방법을 사용하여 재현성을 확인하기.
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Protocol
시약 1. 준비
- C의 미디어의 준비 (이 경우, 야생형 동물과 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물) 간스 성장.
- 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다.
참고 :이 믹스 참견 마라 매체의 10 L를 준비하기에 충분하다.
주 : 정상적인 성장 매체 (NGM) 판 참견 마라 판 (27) 대신에 사용될 수있다. 그러나 판의 동일한 유형 균주간에 독립적 반복 사이의 유효한 비교를 위해 사용되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 참견 마라 판을 사용했다. - 참견 마라 건조 믹스 6g, 한천 17g을 추가하여 참견 마라 매체의 1 리터를 준비하고 122 ℃에서 45 분 동안 H 2 O 및 오토 클레이브와 1 L로 구성한다. 판을 붓고 실온에서 2 일 동안 건조 할 수 있습니다.
- 멸균 기법을 사용 cultu 100 ㎖에 접종E.와 LB 국물 매체의 재 대장균 OP50 박테리아 및 37 ℃에서 O / N 성장.
- E.와 씨앗 참견 마라 판 대장균 OP50 박테리아. 그것은 48 시간 동안 실온에서 성장하도록 허용합니다.
- 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다.
- 의 RNAi를 사용하여 유전자의 하향 조절을위한 준비
- 참견 마라의 RNAi 수유 판을 준비합니다. 단계 1.1.1과 1.1.2에서와 같이 진행합니다. 오토 클레이브 후, 배지는 약 55 ℃로 냉각하고 추가 할 수있는 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG), 100 mM의 암피실린 1 ㎖를 1 ㎖.
- 킬 E. 콜라이 HT115 제어 EV 또는 한천 플레이트에 암피실린 flcn -1- 특정의 RNAi (50 μg의 / ㎖) / 테트라 사이클린 (15 μg의 / ㎖)를 발현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아. 37 ° C에서 문화 O / N 성장.
- 식민지를 선택하고 E. 접종 대장균 HT115 제어 EV 또는 특정의 RNAi-1 flcn과 하나가 37 & #에서 LB / 암피실린 (50 μg의 / ㎖) 매체와 O / N에서 문화를 성장 표현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아를176; C.
- E.와 씨앗 판 대장균 HT115 EV 세균이나 HT115 flcn-1 RNAi의 세균.
참고 : 사용하기 전에 실온에서 판을 48 시간 유지. 공급하여 RNAi의 최저 유효 인 경우, DS-28의 RNA 전달하는 다른 방법을 사용한다.
- 파라콰트 (PQ)를 사용하여 산화 스트레스를 유도 :
- KH 2 PO 4 3g을 혼합하여 M9 버퍼를 준비 나 2의 6g HPO 4, 염화나트륨 5 g 및 황산 0.25 g · 7 H 2 O. 증류수 1 L에 불러옵니다. 실온에서 122 ° C와 저장 병에서 45 분간 고압 솔루션입니다.
- 분석 당일, M9 / PQ - 함유 용액을 제조 하였다. (M9 버퍼의 4 ㎖에 녹이고 PQ의 0.1028 g을 잘 당 M9 / PQ의 40 μL로 전체 96 웰 플레이트를 채우고)이 프로토콜의 경우, 100 mM의 PQ를 사용합니다.
주의 : PQ는 위험하고 독성이 강한 화합물이다. 해당 지침에 따라 처리합니다.
참고 : 때 먼저 새의 실행기차 또는 새 조건, 그것은 7-10 시간 내에 동물을 죽일하기 위해 사용하는 가장 농도를 결정하기 위해 PQ의 농도를 증가에서 생존을 분석하는 것이 좋습니다.
나이 동기 L4 인구 2. 준비
- E. 시드 신선한 참견 마라 플레이트로 전송 20 임신하는 성인 자웅 동체를 대장균 OP50 박테리아. 분석시 필요한 웜의 수에 따라 몇 접시를 준비합니다.
- 그들이 6 시간 후, 어머니를 제거 백금 와이어 웜을 선택 사용하는 알을 낳는하도록 허용합니다. 누워 계란의 수를 평가하기 위해 현미경으로 번호판을 확인합니다.
- 알이 부화하고 48 시간 동안 20 ℃에서 성장하도록 허용합니다. 이 시점에서, 동물은 늦은 L4 / 젊은 성인 단계에있다. 같은 무대 동물을 선택하고 PQ 솔루션 함유 우물에 전송할 수 있습니다.
참고 : 48 시간 배양 단지 야생형 동물과 유사 성장 돌연변이에 적용하므로,이 발달 모니터링하는 것은 중요새로 테스트 돌연변이 비율은, 야생형 개발 레이트 그렇지 다른 타임 라인이 사용되어야 부합되도록한다. - 대안 적으로, 동기화 기술을 사용한다. 차아 염소산 용액을 사용하여 L1 유충 웜의 동기 인구 생성 (25 ml의 물, 5.25 %의 차아 염소산 나트륨의 125 ml의 4 M의 NaOH 50 mL로, 빛에서 분리하기 위해 알루미늄 호일로 병 포장). 강렬한 표백 분석 중에 동물의 행동에 영향을 줄 수 있기 때문에,이 분석을 위해, 그것은, 권장되지 않는다.
주의 : 지침에 따라 차아 염소산 용액을 처리합니다.
주 : 다운, 관심 유전자를 조절하는 특정 세균의 RNAi 시드 RNAi의 플레이트에 산모 전사 제외한 제 2 절에 설명 자웅 동체를 동기화 RNAi의 사용시. RNAi에와 최저 약한 경우, 여러 세대에 공급하는 것이 좋습니다.
3. 산화 스트레스 저항 분석을 <공연/ P>
- 피펫 96 웰 플레이트의 각 웰에 (신선한 제조) 100 mM의 PQ 용액 40 μL. 모든 조건 (치료, 돌연변이 등)의 복제로 최소 12 우물을 사용합니다. 백금선 웜 픽업을 사용하여, 각 웰은 시작 시간과 종료 시간을 나타내는 5-8 L4 유충 동물 옮긴다.
- 다른 조건을 시작할 때, 시작 시간 및 종료 시간을 참고. 시작 시간에서 한 시간 후에 죽은 동물을 벌레를 전송하고 점수 사이의 배양 시간에 20 ° C에서 접시를 놓습니다.
- 해부 현미경을 사용하여, 생존마다 시간을 계산합니다. 조심스럽게 계산을 시작하기 전에 판을 흔들. 죽은 동물로, 심지어 높은 강도의 광을 스폿 팅 한 후에, 이동하지 않은 웜을 표시한다. 또한, 살아있는 동물의 수를 나타낸다.
참고 : 높은 배율에서 벌레 모양, 꼬리와 머리의 움직임을 보면, 살아에서 죽은 벌레를 결정하는 데 도움을줍니다. - 대부분의 벌레가 죽을 때까지이 단계마다 시간을 반복합니다.
- 물론 모든 동물에 전송의 총 수를 가산함으로써 조건 당 동물의 총 수를 계산한다. 손상 또는 이전에 사망 동물을 무시합니다.
- 매 시간 포인트 (12 웰에서 죽은 동물의 합) 조건 당 죽은 동물의 총 수를 계산한다. 때마다 포인트, 생존 (100 마이너스 %의 죽음)의 비율 (죽은 동물 (100)에 의해 동물의 총 개수로 나눈 값과 곱의 수) 죽음의 비율을 계산합니다.
- 이 분석을 최소 3 독립 번 반복합니다.
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Representative Results
비교 야생형 C. 엘레은 flcn-1 (ok975) 돌연변이 동물
여기서 우리는 야생형 C.의 저항을 결정하기 위해 100 밀리미터 PQ 사용 산화 스트레스, 열, 산소 결핍 (23)에 저항하는 것으로 나타났다 flcn -1- (ok975)에 비해 간스 동물. 치료 4 시간, 야생형의 48.3 % 이후 생존으로 flcn-1 (ok975) 동물에서 77.8 %의 생존에 비해. 예상대로, flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물은 야생형 (도 2 및 표 1)에 비해 100 mM의 PQ 더 내성이었다.
제어 EV가 공급 또는 flcn-1의 RNAi 박테리아 야생형 동물 비교
사용 RNAi의 100 mM의 PQ에 대한 저항을 증가 flcn-1의 규제 아래 앞 절에서 제시 한 결과, 유사합니다. 이 결과는 RNAi를 모방 기능 상실 m을 이용하여 유전자 기능의 다운 조절을 보여 utation (그림 2, 표 1).
C. 96 웰 플레이트에서 산화 스트레스 저항 결정 방법의 도식도도 엘레.
MYOB 플레이트상에서 성장하고 E. 콜라이 OP50 박테리아 공급 동기화 L4 / 젊은 성인 동물 100㎜로 PQ를 함유하는 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 전달되어 웜 다수 죽을 때까지 생존 시간마다 측정된다. knockdowns의 RNAi의 경우에, 동일한 과정을 동기화 동물 IPTG가 보충 판 상에 성장되는 것을 제외하고, E. 먹인다 발현에 목적 유전자를 넉다운 것이다 플라스미드를 대장균 형질 HT115 박테리아.
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C에서 산화 스트레스에 FLCN-1이 증가 저항 그림 2. 손실 엘레. - 동물 제어 처리 또는 flcn-1 RNAi의 중량을 100 mM의 PQ (A) 및 중량 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물 및 (B) 내지 (B) 생존율 %.
| 백분율 생존 100 mM의 PQ에 | |||||
| 1 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 82.38 ± 1.31 | 0.0002 | 3 | (210) | |
| flcn-1 (ok975) | 99.03 ± 1.67 | 3 (224) | |||
| 중량; 제어 | 91.70 ± 0.55 | 0.0462 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 95.93 ± 2.48 | 3 | (207) | ||
| 2 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 72.13 ± 7.13 | 0.005 | 3 | (210) | |
| flcn-1 (ok975) | 96.33 ± 2.28 | 3 | (224) | ||
| 중량; 제어 | 80.27 ± 5.34 | 0.0261 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 91.23 ± 1.42 | 3 | (207) | ||
| 3 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 55.37 ± 4.72 | 0.0004 | 3 | (210) | |
| flcn-1 (ok975) | 87.00 ± 1.36 | 3 | (224) | ||
| 중량; 제어 | 70.77 ± 3.50 | 0.0027 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 87.63 ± 2.67 | 3 | (207) | ||
| 4 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 48.30 ± 6.39 | 0.002 | 3 | (210) | |
| flcn-1 (ok975) | 77.80 ± 3.12 | 3 | (224) | ||
| 중량; 제어 | 63.77 ± 0.66 | 0.0122 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 80.57 ± 6.68 | 3 | (207) | ||
| 5 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 41.60 ± 8.33 | 0.0062 | 3 | ||
| flcn-1 (ok975) | 67.43 ± 1.42 | 3 | (224) | ||
| 중량; 제어 | 60.53 ± 2.58 | 0.0313 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 71.53 ± 5.24 | 3 | (207) | ||
| 6 시간 | 스트레인, RNAi의 | 퍼센트 생존 (± 표준 편차) | P 값 | 실험의 수 | 벌레의 총 수 |
| 중량 | 34.86 ± 5.88 | 0.0021 3 | (210) | ||
| flcn-1 (ok975) | 60.34 ± 2.05 | 3 | (224) | ||
| 중량; 제어 | 44.43 ± 3.93 | 0.0042 | 3 | (202) | |
| 중량, flcn-1 (RNAi의) | 62.13 ± 3.44 | 3 | (207) | ||
결과 및도 2에서 산화 스트레스 저항성 통계 분석 표 1. 개요.
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Discussion
C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H 2 O 2, 및 juglone 25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ를 사용하여 96 웰 플레이트에서 액체 산화 스트레스 저항을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 유사한 분석은 그리어 등. (33)에 의해 수행되었습니다. 이 분석은 또한 다른 ROS 소스를 사용하여 액상에서 산화 스트레스를 연구하기에 적합 할 수있다. 예를 들어, 우리는 (23)뿐 아니라 여러 H 2 O 2 농도 flcn-1이 증가 저항의 감소를 보여 주었다.
이 분석은 기술이 될 수LY는 운동성 결함이나 표시 일부 균주에 대한 도전과 같은 도파민 수송 DAT-1 (34)의 돌연변이를 운반하는 균주로 마비의 표현형을 수영을 유도. 이러한 경우, 이동하는 무능력은 반드시 산화 적 스트레스 내성뿐만 아니라 결함 운동성 감소 의미하지 않기 때문에 혼란. 또한, 죽은 동물의 계산은주의 깊게 완료 연구진은 C.에주의를 지불해야한다 이러한 꼬리의 움직임, 머리의 움직임, 또는 느린 신체의 움직임으로 elegans의 행동 세부 사항. PQ 농도가 너무 높으면, 및 사망 동물의 동력학이 매우 빠르다면, 하나는 느린 사망률을 얻기 위해 PQ의 농도를 감소 고려해. 다른 사람은 DAF-2 돌연변이 동물 (37)로 높은 내성을하는 동안 일부 동물은 AAK-2 돌연변이 동물 26,33,35,36으로 산화 스트레스에 매우 민감하다. 이 경우, 상이한 코와 생존을 분석PQ의 ncentrations이 고려되어야한다.
의 RNAi 실험을 위해, 부정적인 결과는 RNAi의 처리의 비 효율성으로 인해 수 있습니다. 이 경우에, mRNA 수준의 측정은 유전자 녹다운이 성공적인지 여부를 결정하기 위해 필수적이다.
이 프로토콜은 상기 C.의 수영 동작을 추적하는 검출기를 이용하여 산화 적 스트레스 내성의 높은 처리량 스크리닝을 위해 적응 될 수있는 액체 (38, 39)에 간스. 이로 인해 C의 인내의 모니터링을 가능하게 할 엘레 및 산화 스트레스 굽힘 몸의 주파수와 같은 수영 동작. 신체 운동의 높은 비율은 스트레스가 높은 웜 체력을 나타낼 수 있습니다.
낮은 진핵 생물에서 스트레스 저항을 산화 이어질 진학 고도로 진화에 걸쳐 보존하고 산화 스트레스 관련 질병과 인간의 노화에 연결되어 있습니다. Mitohormesis과 균형 generatio활성 산소의 N은 수명을 연장하고 건강 범위를 개선하기 위해 필수적이다. 그러나, 과도한 ROS는 세포, 조직 / 기관, 생물체에 매우 해롭다. 변경하는 경우, 최적의 활성 산소의 균형을 제공하는, 경로를 찾기 때문에 필수적이며 산화 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 약물의 화면은 공통 분모와 여러 질병에 대한 치료의 발달을 도울 수 : 산화 스트레스. C에서이 검사를 수행 엘레은 이해와 산화 스트레스에 연결된 인간의 질병의 치료를위한 큰 잠재력과 가치를 가진 유리, 빠르고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법입니다.
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Acknowledgments
우리는 C의 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터를 인정 엘레 균주. 자금 지원은 테리 폭스 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 또한 Rolande과 마르셀 Gosselin의 대학원 재학 및 맥길 통합 암 연구 교육 프로그램의 암 연구 FRN53888에서 CIHR / FRSQ 훈련 보조금에서 EP에 부여 된 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60 x15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library |
References
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J. Turn to the worm! Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
