Abstract
В дополнение к установленным методам, как вестерн-блоттинга, новые методы необходимы, чтобы быстро и легко количественно, ассоциированных с заболеваниями α-синуклеина (alpha; S D) в экспериментальных моделях synucleopathies. Трансгенной линии мышей (M83) более-выражения A53T & alpha; S человека и спонтанно развивается резкое клиническое фенотип между восемью и 22 месяцев, характеризующихся симптомами, включая потерю веса, упадок сил, и серьезные нарушения двигателя был использован в данном исследовании. Для молекулярных анализов alpha; S D (заболевания, связанные alpha; S) в этих мышей, ИФА был разработан специально для количественного & alpha; S D в больных мышей. Анализ центральной нервной системы в этой модели мыши показали наличие D & alpha; S, главным образом, в каудальных областях мозга и спинного мозга. Там не было никаких различий в распределении & alpha; S D между различных экспериментальных условиях, приводящих к клинической болезни, т.е. в uninoculованные и, как правило старения трансгенных мышей и мышей, привитых с экстрактами мозга от больных мышей. Конкретное определение иммунореактивности & alpha; S D с использованием антитела против Ser129 фосфорилируется & alpha; S от ELISA существу коррелируют с полученной помощью Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Неожиданно, аналогичные результаты были получены с несколькими другими антителами против С-концевой части & alpha; S. Распространение & alpha; S D, предполагая участие в "прионов, как" механизм, таким образом, может быть легко контролируется и количественно в этой модели мыши с использованием подхода, ELISA.
Protocol
Все процедуры и протоколы с участием животных были в соответствии с Директивой ЕС 86/609 / EEC и ратифицированной придет, французского национального комитета для рассмотрения этики в животных экспериментирования (протокол 11-0043). Животных содержали и уход в АНСЕС одобрил экспериментальные установки в Лионе (утверждение Б 69387 0801).
1. Получение мышей
- Эвтаназии мышей путем внутрибрюшинной инъекции летальной дозой пентобарбитала натрия.
- Получить весь мозг от черепа мыши и поместите его в 35 мм пластиковой чашке Петри на льду, пока добыча.
- Выписка шейного отдела спинного мозга.
Примечание: Извлечение & alpha; S или от одной из половин мозга после сагиттальной срезов или из вскрытых мозга мыши, доступна после экспериментов, приведенных в таблице 1.
| ЭкспериментальT | Мыши Посевной (мозг эквивалент) | Период выживания (Точек на дюйм) | Медиана / максимальная выживаемость (дней) | & alpha; S обнаружения разработки по ELISA / ВБ / IHC |
| 1 | Неинокулированную мышей | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Инокулировали мышей (0,2 мг) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Таблица 1. Список экспериментов, выполненных на мышах M83. Прививки проводили в течение 6 недель эксперимента 2 в стриато-кортикальной области с 20 мкл гомогената мозга больного мыши (1% вес / объем в глюкозы 5%), после того, как анестезия 6 недель гомозиготных мышей M83 на 3% изофлуран ингаляции. дюйм: дней после inoculвания.
2. & alpha; S Выписка из мозга Половинки
- Сагиттально сократить мозг, чтобы получить две половинки. Взвесьте каждую половину в ribolysis пробирку, содержащую мелющих шаров.
- Подготовьте высоким содержанием соли (HS) буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 750 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 1% фосфатазы и ингибитор протеазы коктейли. Добавить соль высокого буфер половин мозга, чтобы получить 20% (вес / объем) гомогенаты.
- Подготовка образцов из половин мозга с помощью механического гомогенизатора при 6,0 м / с в течение 23 сек в два раза. После первого 23 сек гомогенизации, поместить пробирки, содержащие гомогенатах на льду в течение 2 мин до второго цикла 23-сек.
- Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 5 мин, чтобы устранить неразмолотом фрагменты мозга. Восстановление супернатанты, разделить на 200 мкл аликвоты и хранить их при температуре -80 ° C для последующего анализа ELISA.
3. & alpha; S Выписка из рассеченной мозга регионов
- Проанализируйтевесь мозг в 35 мм пластиковой чашке Петри на льду с низким лупы питания (8X увеличение), используя два forcipes, концы которых хранятся вместе, за исключением, когда рассекает гиппокамп. Не превышать 10 минут, чтобы сохранить целостность мозга. Поместите правую сторону мозга и получить следующие участки мозга в следующем порядке:
- Отдельная один из двух обонятельных луковиц, используя щипцы, размещенные позади лампочки. Снять его с мозгом с помощью вниз движения. Повторите эту операцию для второй лампы.
- Аккуратно клин щипцы между двумя кор и переместить его вперед, чтобы облегчить диссоциацию двух кор. Ведение мозг в месте с одной щипцами, используйте другой, чтобы отделить кору от гиппокампа.
- Расположите щипцов на 2 мм ниже коры. Поддержание нежный давление на щипцы, пока верхняя часть гиппокампа не видно. Слезьте первую часть коры, и повторите со второй частью. Используйте пинцет, чтобы отделить два корначиная с гиппокампа и движется по направлению к передней части мозга.
- Расположите открытый щипцы вокруг одного из гиппокампа. Закройте щипцы в нижней части гиппокампа затем осторожно удалить его, восстанавливается в максимально возможной степени. Повторите процедуру для второго гиппокампа.
- Расположите открытый щипцы ниже один из полосатых и аккуратно отделить его от мозга. Используйте пинцет, чтобы удалить оставшуюся кору полосатого тела. Повторите эту процедуру для второго стриатуме.
- С помощью щипцов, чтобы аккуратно нажать на 2 мм по контуру мозжечка, чтобы облегчить отделение от мозжечка головного мозга. Поместите щипцы позади мозжечка и удалить его путем перемещения щипцы вперед.
- Используйте широкую часть щипцов, чтобы поднять средний мозг для того, чтобы ясно видеть, где он присоединяется к ствола мозга. Сделайте вертикальный разрез на стыке затем снимите ствол мозга.
- Расположите щипцы за среднего мозга, которые яы состоит из четырех округлых структур. Надрезать вертикально до тех пор, средний мозг не был полностью отделен от остальной мозга.
- Подготовьте гомогенатах переменной% (вес / объем) в HS буфера, в зависимости от количества доступных тканей, т.е. 5% гомогената на вес от 10 до 30 мг, 10% за весом от 30 до 80 мг, и 20% при весе выше 80 мг.
- Добавить адекватный объем HS буфера рассеченных областей мозга, чтобы получить ожидаемый% гомогената.
- Вихревые и убедитесь, что ткани полностью погружен в буфер HS.
- Однородный образцов, полученных из вскрытых участках головного мозга или шейного отдела спинного мозга с помощью гомогенизатора тканей, состоящей из боросиликатного стекла трубки и двух пестики, А и В.
- Налейте каждый регион мозга, чтобы быть раздавлен прямо в трубку. Вставка пестик A в трубу и отвода его. Повторите это движение около десяти раз, чтобы отделить ткань. Затем используйте пестик В до Соказанию в измельчение ткани с еще 20 движений. Передача гомогенатах в 1,5 мл пробирку с 1 мл пипетки.
- Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы устранить любые неразмолотом фрагменты мозга. Получить супернатанты, разделить их на 200 мкл аликвоты и хранить их при температуре -80 ° C для последующего анализа ELISA.
4. Выявление & alpha; S методом ИФА
- Развести антитела покрытий 0,01 нг / мл. Используйте либо анти-alpha; S кроличьи поликлональные или моноклональные антитела, клон 42 в 50 мМ Na 2 CO 3 / NaHCO 3 буфера (рН 9,6).
- Шерсть 96-луночных микропланшетов 100 мкл на лунку раствора для покрытия этого, и оставить на 4 ° CO / N. Использование поликлональное антитело кролика против & alpha; S в растворе для покрытия для ИФА с использованием антител обнаружения syn514, клонировать 42, LB509, AS11, 4D6 или 8A5. Использование анти-alpha; S моноклональное антитело клон 42 в виде раствора для нанесения покрытияв сочетании с анти-pSer129 & alpha; S антитела обнаружения.
Примечание: Если необходимо, пластины могут храниться при температуре 4 ° С в течение одной недели перед ELISA выполняется. - Использование промывки планшетов мыть пластины пять раз с 300 мкл фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин-20 (PBST) на лунку. Из этого шага вперед, инкубационный при комнатной температуре.
- Добавить 200 мкл PBS, Т20 блокирующего буфера на лунку. Встряхивают в течение 1 ч при 150 об. Промыть пластины пять раз PBST.
- Развести гомогенатах мозга (разведение 1: 100 в 20% гомогенатах, 1:50 из 10% гомогената и 1:25 из 5% гомогенатах в PBST BSA 1%), и добавить 100 мкл в каждую лунку. Тогда инкубировать в течение 2 часов при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Промыть пластины пять раз PBST.
- Добавить различные антитела обнаружения & alpha; S в PBST с 1% BSA в разведениях, указанных в Списке материалов. Инкубировать в течение 1 ч при 150 об. Промыть пластины пять раз PBST.
- Добавить либо анти-mouse или анти-IgG кролика HRP конъюгаты разбавляли 1: 8000 в PBST с добавлением 1% BSA в течение 1 ч при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Промыть пластины пять раз PBST.
- Добавить 100 мкл 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин раствора (TMB) в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин в темноте при встряхивании при 150 оборотах в минуту.
- Остановить реакцию, добавив 100 мкл 1 N HCl на лунку затем измерить оптическую плотность при 450 нм с микропланшетного.
- Для анализа данных, вычесть значение ОП, полученное в хорошо со всеми реагентами, за исключением каких-либо образцов мозга мыши (а) заготовки из значений оптической плотности, измеренных для каждого из анализируемых образцов.
5. Картирование эпитопов
- Выполнение картирование эпитопов в соответствии с методом, описанным Osman 16. Вкратце, местная пептиды человеческой последовательности α-синуклеина, содержащего 12 аминокислот на нитроцеллюлозу с 10 перекрывающихся аминокислот.
- Блок 50 мМ Трис / 150 мМ NaCl буфером с рН 10, содержащим 0,05% Tween 20 и 5% обезжиренное молоко. Инкубируйте антитела в блокирующем растворе при концентрации 2 мкг антитела на мл при 2-10 ° CO / N.
- Промыть мембраны три раза с помощью 50 мМ Трис / 150 мМ NaCl, рН-буфер 10, содержащим 0,05% Твин 20. инкубировать с козьим антителом против мышиного IgG HRP конъюгата. Вымойте мембраны еще пять раз, используя тот же буфер, то пятно, используя вестерн-блот ТМВ окрашивания комплект.
6. Статистический анализ
- Используйте R программного обеспечения и nlme пакет для выполнения смешанных эффектов регрессии для моделирования ОП. Для каждого сравнения, выполнять смешанную модель эффект регрессии. Используйте фиксированный эффект отличить от бессимптомных симптоматическое групп.
- Использование случайный эффект с учетом изменчивости повторений для заданного мыши. Проверьте гомоскедастичность путем изучения остатков и при необходимости использовать функции дисперсии моделировать структуру дисперсия внутри группы ошибок в соответствии с Пинейро и Бейтс 17. Установите 0,05 как значимости пороге P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, ИФА, используемые конкретно определены, ассоциированных с заболеваниями alpha; S (& alpha; S D) в гомогенатах мозга, полученных в буфер с высоким содержанием соли от больных мышей M83. Использование антитела специфически распознавать pSer129 & alpha; S (р = 0,0074), ИФА легко отличает старый, больной мышей (> 8 месяцев) от молодых (2-5 месяцев), здоровых мышей M83 (рис 1). Несколько другие антитела показали высокие сигналы аналогично (> 0,6 ОП) только в мозговых гомогенатах больных мышей. Это тот случай, для 4D6 (р = 0,01), LB509 (р = 0,0047) и 8A5 (р <0,001) против различных последовательностей в С-концевой части белка (124-134, 115-122, 129-140 и соответственно) и, в гораздо меньшей степени, syn514 против N-концевого (2-12) белка (р = 0,0003). Кроме того, моноклональное антитело AS11 производится в нашей лаборатории на человека фибриллярных рекомбинантных & alpha; S 18 после иммунизации C57BL / 6S (B6 & alpha; S-нулевых) 19мышей с делецией в α-син локуса, показали высокие сигналы аналогично (р <0,01) только в мозговых гомогенатах больных мышей. Это антитело теперь показано признать аминокислотную последовательность (Р) VDPDNEAY (Е) & alpha; S, соответствующий 118-125 последовательности человеческого α-синуклеина.
В противоположность этому, при этих условиях эксперимента, анализ мозга гомогенатов с детектирующего антитела клона 42, направленной против центральной области α-синуклеина (91-96) последовательности, показал очень слабый сигнал, для обоих больных и здоровых мышей M83. Это не могло выделить две популяции мышей (р = 0,1158). Молодые мыши M83, тем не менее показал более высокую иммунореактивность чем сделал трансгенного B6C3H мышей (M83 генетический фон линии). Контраст был еще больше с C57BL / 6S (В6 & alpha; S-нулевые) мышей, которые имеют удаленный α-син локус. Это говорит о том, что незначительное иммунореактивности у мышей M83 соответствует низкой обнаружения сигнала нормальных & alpha; S.nalytical чувствительность этого ELISA оценивали в сравнении с ранее описанным методом Western блот 4 для обнаружения нерастворимого Ser129 фосфорилированного α-синуклеина, путем изучения, используя как ELISA и западные методы блот, серийные разведения гомогенатов мозга, приготовленных из той же больной M83 мозга мыши (фиг.2). Ориентировочная 10 мкг эквивалентов мозга было достаточно, чтобы получить положительный сигнал для ELISA гомогената мозга больного из этого мыши, как с LB509 и PSer129 антител. Напротив, по меньшей мере, 200 мкг эквивалентов мозга были необходимы для обнаружения pSer129 & alpha; S в саркозила нерастворимые фракции анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием того же антитела PSer129 15. Это означает, что ИФА имеет Аналитическая чувствительность около 20 раз больше, чем пятно методом Западной.
В больничном и старых мышей M83 (3А), мозга гомогенатах из среднего мозга, ствола мозга и спинного мозга шо ср отмечены иммунореактивности с обеих LB509 и PSer129 антител в ИФА. Тем не менее, не обнаружено иммунореактивности не наблюдалось в других отделах головного мозга, в том числе обонятельной луковицы коры головного мозга, полосатого тела, гиппокампа,, таламуса и гипоталамуса. ИФА дал слабый сигнал мозжечка. Иммунореактивности в различных областях головного мозга мышей M83 разработке ускоренное развитие заболевания после инъекции экстракта мозга от больных M83 мыши 4 (3В) была неотличима от той, что в возрасте (> 8 месяцев назад) неинокулированную мышей M83. Эти результаты полностью согласуются с результатами, полученными с помощью Вестерн-блоттинга (фиг 3C) и иммуногистохимии 15, показывающий гораздо большую отложение Ser129 α-синуклеина в каудальных областях головного мозга и спинного мозга.
/52752/52752fig1highres.jpg "Ширина =" 700 "/>
Рисунок 1. обнаружение ELISA, ассоциированных с заболеваниями α-синуклеина (alpha; S D) в целых гомогенатах мозга мышей M83. ИФА объединения кролик анти-alpha; S поликлональные (покрытие) с syn514, LB509, АС11, 4D6, 8A5 (обнаружения) или клон 42 (покрытие) с анти-pSer129 & alpha; S (PSer129) (обнаружения) антител отличить больную мышей от здоровых мышей M83, в то время как ELISA с анти-кроличьего поликлонального & alpha; S (покрытие) / clone42 (обнаружения) нет. Шесть больных, старых мышей в возрасте М83 от 11 до 16 месяцев показали признаки иммунореактивности с анти α-син антител (кроме клон 42 антитела). Это не относится к ни шести молодых, здоровых мышей в возрасте от 2 до 5 месяцев, или с дополнительными контроля, включая B6C3H (генетического фона M83 мышей) или В6 & alpha; S-нулевые мыши. Столбики ошибок обозначают SD редактировался Bétemps 15.
Рисунок 2. Сравнение аналитической чувствительности обнаружения & alpha; S D по ELISA и Вестерн-блот. А. позитивный сигнал был получен с ELISA для 12,5 мкг эквивалентов мозга с обеих LB509 и PSer129 антител из двукратных разведений гомогенатов головного мозга от больных мышь. Оценочный уровень отсечки для дискриминации больных и здоровых мышей, соответствующие средства, полученные из образцов здоровых мышей M83 во время трех до шести повторов ELISA меры + 3 стандартных отклонения, были 0,030 и 0,020 для LB509 и PSer129 антител обнаружения соответственно , Они показаны в виде линии того же цвета, что и для каждого из антител. В. Вестерн-блот-анализа нерастворимых фракций, полученных после центрифугирования в PresenСЕ саркозила, 200 мкг эквивалентов мозга были необходимы, чтобы обнаружить & alpha; S D с той же PSer129 антитела. Молекулярные маркеры вес (в кДа) указаны слева от блота. Печатается с разрешения Bétemps 15.
Рисунок 3. Обнаружение заболевания связанный α-синуклеина (alpha; S D) в различных областях головного мозга мышей M83 по ELISA и вестерн-блоттинга. ИФА выявлены alpha; S D с PSer129 или LB509 антител обнаружения у мышей M83 во время нормального старения (A) (N = 1, 4 повторов, среднее ± SD) или после прививки от 6-недельных мышей M83 с гомогената мозга от больного M83 ( Б) (п = 1, 4 повторяется, значит, ± SD). (С) & alpha; S D был идентифицирован Wводоприемников промокните с EP1536Y антител обнаружения PSer129 в тех же нейро-анатомических областей в мышей, зараженных гомогената мозга от больного M83 мыши. Молекулярные маркеры вес (в кДа) указаны слева от панели С Равные количества суммарных белков были использованы в каждой линии для эквивалентной нагрузки на гель. Следующие восемь нейро-анатомических областях из больных мышей M83 были протестированы: OB: Olfactive лампы, Cx: кора головного мозга, Привет: гиппокамп, Санкт: стриатуме, меня: средний мозг, Cb: мозжечок, Б.: ствол мозга, Южная Каролина: шейного отдела спинного мозга , Измененный Bétemps 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование ELISA был продемонстрирован в частности, обнаружить & alpha; S D непосредственно из гомогенатов мозга мыши в течение заболевания в модели трансгенной мыши M83. В самом деле, это ИФА может легко отличить больные M83 мышей от здоровых мышей M83, используя только целые гомогенаты мозга в высокой концентрации соли буфера.
Наиболее важные шаги для успешных результатов, используя этот ИФА являются: правильно рассекает различные регионы мозга мыши по разработке необходимой ловкость, чтобы предотвратить повреждение во время вскрытия; выполнения разведения образца исключительно в HS буфера; и выбор антител, так как не все антитела будут работать в формате ELISA.
Некоторые различия в уровнях alpha; S D, тем не менее очевидно, между различными мышей. Эти результаты эквивалентны Вестернблоттинг обнаружения типичной & alpha; S D рисунком обнаруживается только в больных мышей M83 путем исследования Саркosyl нерастворимые фракции после обнаружения с антителами против Ser129 фосфорилируется & alpha; S 15. Это показывает, что ИФА иммунореактивность соответствует специфической детекции & alpha; S D.
В соответствии с предыдущими Вестерн-блот анализ 15, это ИФА обнаружены иммунореактивности после вскрытия головного мозга больных мышей M83 в хвостовой части головного мозга, то есть, в среднем мозге и стволе мозга, а также в шейного отдела спинного мозга. Нет иммунореактивность не была обнаружена в обонятельную луковицу, коры головного мозга, полосатого тела или гиппокампа, в соответствии с предыдущим данные, указывающие, что гиппокамп не был избавлен от патологического процесса 6, если на очень низком уровне, в случае мышей, которые были инокулируют фибриллярного альфа -synuclein в гиппокампе 15. Распределение & alpha; S D, таким образом, появились удивительно единые общие, несмотря на любые экспериментальные условия, которые вклluded либо нормальное старение мышей или ускоренное развитие заболевания после внутри-мозговой прививки гомогенатах мозга от больных мышей M83.
Кроме того, производительность анализа лучше, чем ранее описанного метода блот-западной. Аналитическая чувствительность ELISA оказались выше, как показано предела обнаружения, полученным в этом испытании с использованием серийных разведений в гомогенате головного мозга от больного M83 мыши (12,5 мкг для ELISA против 200 мкг на Вестерн-блот-анализа). Чувствительность ELISA, однако осталась ниже, чем у иммуногистохимического обнаружения, который обнаруживает alpha; S D в отдельных клетках и в лобной области головного мозга, таких как коры головного мозга 15. Чувствительность теста может, тем не менее быть дополнительно улучшена за счет использования различных антител и / или оптимизированные системы обнаружения, такие как хемилюминесцентного обнаружения, как описано выше 13.
Это важноотметить, что некоторые другие антитела, распознающие другие формы белка, и, в частности, не фосфорилированной форме (обнаружен с моноклональными антителами 4D6 20) дали сходные результаты, используя этот ELISA, в дополнение к моноклонального антитела к специфическому распознаванию pSer129 & alpha; S. Этот подход также показал, ИФА иммунореактивность с антител, распознающих специфически человеческие & alpha; S (LB509) и, в гораздо меньшей степени, & alpha; S мышей (D37A6) в тех же больных животных и / или регионах головного мозга больного мышей 15. С другой стороны, нет иммунореактивности не наблюдалось в анализе ELISA больных мышей M83 с использованием клона 42 антитела против центральной области & alpha; S (91-96) 21,22, что соответствует эпитоп, который может быть зашифрованное в этих условиях ELISA. Этот формат ИФА может обнаружить в мозге мыши M83 обоих Ser129 фосфорилированными & alpha; S, как заметил Фоулдс 11 в плазме крови человека, и нефосфорилированный, возможно, олигомерные формы, как описано в гулплазмы и спинномозговой жидкости 12,14. В отличие от ранее опубликованных ИФА, наш формат ИФА ни использовал тот же антитела в захвате и обнаружения для обнаружения олигомерные формы & alpha; S, ни антитела, известные как конформационные, как антитела 5G4, используемой в исследованиях Unterberger в.
В отличие от метода блот-Западной ранее использованного для обнаружения & alpha; S D в гомогенатах мозга мышей M83 4, ИФА не требует стадии концентрации, например, путем ультрацентрифугирования с саркозила обнаружить заболевание-ассоциированный белок 23. Ассоциированных с заболеваниями, & alpha; S ранее определены на мышах M83 последовательной экстракции с помощью буферов увеличения прочности 2,6. С практической точки зрения это количественный анализ существенно экономит время и реагенты по сравнению с Вестерн-блот-процедуры.
В этом исследовании, подробные & alpha; S молекулярный анализ с использованием подхода ELISA позволилолегко количественно иммунореактивности с различных антител в больных мышей M83. Это может пролить свет на молекулярные механизмы, участвующие в агрегации & alpha; S во synucleinopathies из количественной точки зрения. Таким образом, этот подход может обеспечить ИФА основу для быстрого и простого инструмента для выявления & alpha; S D в различных биологических образцов с надежным маркером патологии, такие как Ser129 фосфорилированными & alpha; S, который Фоулдс 11 считает более перспективным в качестве диагностического маркера, чем нефосфорилированный Белок. В последнее время он отметил тот факт, что меры общего alpha; S или, возможно, из нефосфорилированный & alpha; S может быть использован в качестве суррогатного маркера для прогрессирования заболевания в ПД, а уровень общей alpha; S имеет тенденцию к увеличению с течением времени после появления начальных симптомов 24 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Дэмиен Gaillard для прививок и последующей деятельности в экспериментах на животных. Эта работа была поддержана АНСЕС (Французского агентства по продовольствия, окружающей среды и охраны здоровья и безопасности) и грантом Фонда Франции Паркинсона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
