Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Мы описываем метод генерации в пробирке производных тучных клеток, их привитие в мачтовых клеток дефицитных мышей, а также анализ фенотипа, номера и распределение привитых тучных клеток на различных анатомических участках. Этот протокол может быть использован для оценки функций тучных клеток in vivo.

Abstract

Тучные клетки (MCs) гематопоэтические клетки, которые находятся в различных тканях, и особенно обильные в местах, подверженных внешней среде, таких как кожа, дыхательные пути и желудочно-кишечного тракта. Наиболее известный за их вредную роль в IgE-зависимых аллергических реакций, MCs также стали важными игроками в принимающей обороны от яда и вторжения бактерий и паразитов. На фенотип и функцию MC могут влиять микрооконденциальные факторы, которые могут отличаться в зависимости от анатомиального расположения и/или в зависимости от типа или стадии развития иммунных реакций. По этой причине мы и другие люди отдают предпочтение подходам in vivo, а не методам in vitro, чтобы получить представление о функциях MC. Здесь мы описываем методы генерации мышей костного мозга, полученных культурных MCs (BMCMCs), их приемной передачи в генетически MC-дефицит мышей, а также анализ чисел и распределения приемных переданы MCs на различных анатомических участках. Этот метод, названныйподходом «в нокаута тучных клеток», широко используется в течение последних 30 лет для оценки функций MCs и MC-производных продуктов in vivo. Мы обсуждаем преимущества и ограничения этого метода в свете альтернативных подходов, которые были разработаны в последние годы.

Introduction

Тучные клетки (MCs) гематопоэтические клетки, которые возникают из плюрипотентных прародителейкостного мозга 1-3. После регрессии костного мозга, прародители MCs мигрируют в различные ткани, где они развиваются в зрелые MCs под влияниемместных факторов роста 1-3. Ткань-резидентОВ MCs стратегически расположены на хост-среды интерфейсов, таких как кожа, дыхательные пути и желудочно-кишечного тракта, где они ведут себя как первая линия обороны от внешнихоскорблений 3-6. MCs часто субклассифицированы на основе их "базовых" фенотипических характеристик и их анатомические местоположения. У мышей были описаны два типа MCs: "соединительной ткани типа" MCs (CTMCs) и слизистых MCs (MMCs)1-3,7,8. КТК часто расположены вокруг венуле и вблизи нервных волокон, и проживают в серозных полостей, в то время как MMCs занимают внутрипителенные места в кишечнике и слизистой оболочкедыхания 1-3.

Многочисленные методологии были применены для изучения биологических функций MCs9-13. Многие группы сосредоточились на подходах in vitro, используя либо клеточные линии (такие как человеческие линии MC HMC114 или LAD215,16), в пробирке производных MCs (например, человека периферическойкрови, полученныхMCs 17 , или мыши костного мозга полученных культурные MCs (BMCMCs)18, фетальной кожи полученных культурных MCs (FSCMCs)19 и брюшной клетки полученных MCs (PCMCs)или ex vivo изолированных MCs из различных анатомических сайтов. Все эти модели широко используются для изучения молекулярных деталей биологии MC, таких как сигнальные пути, участвующие в активации MC. Однако важным аспектом биологии MCs является то, что их фенотипические и функциональные характеристики(например,содержание цитоплазмической гранулы или реакция на различные раздражители) могут быть модулированы анатомическим расположением и микроокнироницией2,7. Так как точная смесь таких факторов, которые встречаются in vivo может быть трудно воспроизвести in vitro, мы выступаем за использование in vivo подходов, чтобы получить представление о MCsфункции 9.

Существует несколько штаммов мыши с генетическим дефицитом MC, таких как широко используемые WBB6F1-Kit W/W-v или C57BL/6- Kit W-sh/W-sh мышей. Эти мыши отсутствие выражения и / или активности KIT (CD117), рецептор для основного фактора роста MC фактор стволовых клеток (SCF)21,22. В результате, эти мыши имеют глубокий дефицит MC, но и имеют дополнительные фенотипические аномалии,связанные с их c- комплект мутаций (в WBB6F1-Kit W / W-V мышей) или последствия большой хромосомной инверсии, что приводит к снижению C-комплект выражения (в C57BL/6-Kit W-sh/W-sh мышей) 9,10,23. Совсем недавно, несколько штаммовмышей с c-комплект-независимый составной дефицит MC былизарегистрированы 24-26. Все эти мыши и некоторые дополнительные новые типы неодобоваемых MC-дефицитных мышей были недавнорассмотрены в деталях 9,10,13.

Здесь мы описываем методы генерации полученных из костного мозга мышей культурных MCs (BMCMCs), их приемную передачу в MC-дефицитных мышей, а также анализ чисел и распределения приемных переданных MCs на различных анатомических участках. Этот так называемый метод стука "мачтовых клеток" может быть использован для оценки функций MCs и MC-производных продуктов in vivo. Мы обсуждаем преимущества и ограничения этого метода в свете альтернативных подходов, которые были разработаны в последние годы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все операции по уходу за животными и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения и с конкретным одобрением Институционального комитета по уходу за животными и использованию Стэнфордского университета.

1. Поколение и характеристика костного мозга полученных культурных тучных клеток (BMCMCs).

Примечание: Донор BMCMCs должны быть получены из клеток костного мозга того же генетического фона, как получатель MC-дефицит мышей. Донор BMCMCs, полученный от мужчин, не подходит для присвековывки самок мышей. Донор бМКМ, полученный женщинами, успешно будет впихит как мужчин, так и женщин-реципиентов.

  1. Извлечение костного мозга.
    1. Налейте стерильный фосфат-буферный солевой раствор (PBS) в 6 хорошо культуры пластины (1 хорошо на мышь) и место на льду.
    2. Замочите инструменты для вскрытия в 70% этанола для стерилизации.
    3. Эвтанизировать мышей-доноров углекислым газом (CO 2 )ингаляции следуютшейки вывиха, а затем спрей мышей с 70% этанола в местах манипуляции.
    4. Используйте стерильные инструменты вскрытия для извлечения бедренной кости, голени и малоберцовой кости без резки каких-либо эпифизиков костей.
    5. При обеспечении кости с типсами, соскребать все ткани из костей (и отказаться от малоберцовой кости) с помощью стерильных ножниц (или скальпель лезвия). Поместите кости в PBS на лед, пока все кости не будут собраны.
    6. Выполнить все оставшиеся шаги в стерильной ткани культуры капот. Используя стерильные инструменты, закрепив кости щипцы и отрезав оба эпифизика, чтобы разоблачить медуллярную полость.
    7. Использование 3 мл шприцев и 30 Г игл, и холодная среда промывки (Dulbecco Модифицированный Eagle Medium (DMEM) дополнен 10% фетальной сыворотки теленка (FCS, тепло-инактивированный), 2 мММ L-глутамин, 1% антибиотико-антимикотический раствор, 50 МК -меркаптоэтанол), промыть красную кость в чашку.
    8. Используйте тот же шприц, чтобы разобщить промытые кластеры клеток костного мозга, повторив мягкое аспирации и выброса.
    9. Бассейн бедренной кости и трибиального костного мозга с каждой мыши в одну 15 мл центрифуги трубки. Заполните трубку холодной промывки среды для мытья клеток костного мозга и центрифуги на 400 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию.
  2. Культура BMCMCs.
    1. Удалить супернатант и восстановить гранулы клеток костного мозга в 10 мл среды культуры (DMEM дополняется 10% фетальной сыворотки теленка FCS, тепловой инактивированный, 2 мМ Л-глутамин, 1% антибиотико-антимикотический раствор, 50 МК-меркаптоэтанол и 20% WEHI-3 клеточной среды «в качестве источника IL-3; альтернативно используйте рекомбинантную мышь IL-3 при температуре 10 нг/мл»).
    2. Поместите клетки в фляг культуры тканей соответствующегоразмера (например,T25 для 1 мыши, T75 для 2 мышей и т.д.).
    3. Через 1-2 дня после покрытия клеток, передачи средних и подвесных клеток (оставляя мусора и адептов клеток прилипания к нижней части колбы) в новую колбу и добавить свежие среды культуры (10 мл / мышь).
    4. В течение следующих недель, кормить клетки каждые 3-4 дней (добавить 10 мл культуры среды на мышь). Поддержание плотности клеток между 2,5 х 105-1 х 106 клеток/мл. Передача неприемляемых клеток в новую колбу один раз в неделю, пока в культурной колбе нет адептов. Проверьте зрелость клеток (см. ниже) перед использованием для анализа в пробирке или engraftment в MC-дефицит мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная дифференциация BMCMCs займет 4-6 недель.
  3. Оценка зрелости BMCMC.
    1. Использование цитометрии потока.
      1. Вымойте клетки (5 х10 4-5х 10 5 клеток/условие) с ледяным буфером FACS (PBS, 0,5% FCS) в 5 мл полистирола вокруг нижней трубки. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспират супернатант.
      2. Разбавить антимошашки CD16/32 (клон 93 или 2,4G2) моноклональные антитела 1:200 (2,5 мкг/мл) в буфере FACS. Добавьте 10 мкл к каждой грануле и хлюссенд, кратко облив. Инкубировать 5 мин на льду, чтобы блокировать Fc связывания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы от прямого света для всех оставшихся шагов.
      3. Разбавленный фикоэритрин (PE) спрягает антимошки Fc'RI α (клон MAR-1) 1:200 (1 мкг/мл) и фторцейн изотиоцианат (FITC) конъюгированный антимошезный КИТ (CD117; клон 2B8) 1:200 (2,5 мкг/мл) ("решение для окрашивания") или соответствующие помеченные антитела для контроля изотипа в буфере FACS ("решение для контроля изотипа").
      4. Разделите половину заблокированных клеток от шага 1.3.1.2) на дополнительную полистирол круглую нижнюю трубку и добавьте 20 мкл «раствора окрашивания» в одной трубке и 20 мкл раствора «изотипного контроля» в другой трубке. Инкубация 30 мин на льду.
      5. Добавьте 3 мл ледяного буфера FACS и центрифуги при 400 x g в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант и повторно посовелайте гранулы в буфере FACS в 300 мкг/мл пропидия (PI, для идентификации мертвых клеток). Продолжить анализ цитометрии потока (см. рисунок 2A).
    2. Использование толуйдина синего окрашивания.
      1. Вымойте 1 х10 5 клеток один раз с PBS центрифугации на 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, затем аспирировать и повторного перерасхода клеток в 200 мкл PBS.
      2. Перенесите подвесную клетку в подготовленную цитофуннель, прикрепленную к слайду микроскопа, и приступайте к цитоцентрифугации с помощью цитоцентрифуга (40 х г в течение 5 мин).
      3. Воздух сухие слайды в течение 10 минут и рисовать воск круг вокруг клеток с помощью пера PAP. Добавьте 0,1% голубого раствора Толуйдин, чтобы покрыть клетки. Инкубация в течение 1 мин. Вымойте горки в проточной водопроводной воде в течение 1 мин, затем сухие слайды в течение 10 мин.
      4. Клетки Coverslip с использованием монтажной среды. Приступайте к анализу светового микроскопа (см. рисунок 2B)

2. Присвящание мышей с дефицитом тучных клеток с БМКМ.

  1. Ухом engraftment путем интрадермальной (i.d.) инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для принятия передачи BMCMCs в ухо pinnae MC-дефицитных мышей, мы рекомендуем высовываем две инъекции 1 х 106 клеток каждый (в общей сложности 2 х 106 клеток) на ухо пинна. Внутридермальный engraftment BMCMCs в ухо pinnae MC-дефицитных мышей был использован многими следователями в нескольких моделях, в том числе модели пассивной кинной анафилаксии (PCA)24,27, принимающей защитыот ядов 28, и хронической гиперчувствительности (CHS)реакции 29,30.
    1. Подсчитайте и повторно посчитайте клетки на 4 x10 7 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 l) в холодном DMEM. Перенесите раствор BMCMCs в шприц 1 мл, оснащенный иглой 30 G. Держите на льду до инъекции.
    2. Анестезировать 4-6 недель MC-дефицит мышей с использованием изофлюран (2,5% v/v). Проверьте глубину анестезии на ноте щепотку, настроить изофлюран, если указано и продолжать контролировать дыхание и ногой щепотку ответа на протяжении всей процедуры. Нанесите офтальмологическую мазь с наконечником, чтобы предотвратить сухость глаз.
    3. С указательным пальцем, создать вертикальное давление на спинной стороне уха пинна подвергать и растянуть брюшной лицо.
    4. Выполните две инъекции 25 мкл i.d. раствора BMCMC в двух различных участках брюшной точки уха пинна, первая инъекция в середине уха и вторая инъекция к кончику уха пинна. Подождите 4-6 недель после того, как i.d. engraftment перед выполнением экспериментов in vivo.
      Примечание: По нашему опыту, к томувремени количество MCs/mm 2 дермы в центральной части уха пинна в целом похож на то, что в соответствующем месте у диких мышей типа, в то время как число MCs/mm2 на периферии уха pinnae, как правило, значительно ниже, чем в соответствующих дикихмышей типа 27,28. Это следует иметь в виду при проектировании экспериментов стакими MC-engrafted мышей (например, агенты с возможным воздействием на функцию MC должны быть введены в центральной части уха pinnae, и анализ последствий таких процедур должны также сосредоточиться на этой области).
  2. Перитонеальная инкрустация полости путем внутриперитонеальной (i.p.) инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приемная передача BMCMCs в брюшной полости MC-дефицит мышей потребует одной инъекции 2 х 106 клеток на мышь. Такие инъекции BMCMCs в MC-дефицитных мышей были использованы многими группами для изучения роли брюшной МК в различных моделях, в том числе модели принимающей обороны отядов 31 или бактериальногосепсиса 32,33.
    1. Подсчитайте соответствующее количество ячеек и повторное количество при 1 х 107 БМКМК/мл (2 х10 6 БМКМК/ 200 л) в холодном DMEM. Перенесите раствор BMCMCs в шприц 1 мл, оснащенный иглой 25 Г. Держите на льду до инъекции.
    2. Выполните 1 инъекцию 200 МКЛ BMCMCs раствор в брюшной полости 4-6 недель mc-дефицит мышей. Подождите 4-6 недель после i.p. engraftment перед выполнением экспериментов in vivo.
  3. При внутривенной (i.v.) инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приемная передача BMCMCs путем i.v. впрыски в MC-дефицитных мышей потребует одной инъекции 5 х 106 клеток на мышь. Внутривенные (i.v.) инъекции BMCMCs в MC-дефицитных мышей были использованы многими группами для изучения роли MCs в различных моделях заболеваний, в том числемодели инфекции мочевого пузыря 34,астма 35,фиброз легких 36, и антитела опосредованногоартрита 37.
    1. Подсчитайте соответствующее количество ячеек и повторное время в 2,5 х10 7 BMCMCs/ml (5 х10 6 BMCMCs/200 мл) в холодном DMEM. Перенесите раствор BMCMCs в шприц 1 мл, оснащенный иглой 30 G. Держите на льду до инъекции.
    2. Анестезировать 4-6 недель MC-дефицит мышей с использованием изофлюран (2,5% v/v). Проверьте глубину анестезии на ноте щепотку, настроить изофлюран, если указано и продолжать контролировать дыхание и ногой щепотку ответа на протяжении всей процедуры. Нанесите офтальмологическую мазь с наконечником, чтобы предотвратить сухость глаз.
    3. Выполните одну инъекцию 200 мкл раствора BMCMC в хвостовую вену (или, в качестве альтернативы, ретро-орбитальную вену) мыши с дефицитом MC. Подождите 12 недель после прихожей, прежде чем выполнять эксперименты in vivo.

3. Анализ Engrafted мачты клеток дефицитных мышей.

  1. Анализ уха.
    1. В конце эксперимента эвтанизируйте мышей при вдыхании CO2 с последующим вывихом шейки матки.
    2. Изолировать ухо pinnae и исправить в 10% (vol/vol) буферных формалин ночь при 4 градусов по Цельсию. Вставлять фиксированные ушные пинна в парафин, вырезать 4 мкм разделы уха pinnae и монтировать на стеклянных слайдах.
    3. Пятно слайды с 0,1% Толуйдин синий раствор в течение 1 мин при комнатной температуре. Вымойте горки в водопроводной воде в течение 1 мин, затем воздушно-сухие горки в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Coverslip слайды с использованием монтажа среды, а затем подсчитать количество присвятытых MCs на pinnae разделов с помощью светового микроскопа. Оцените эффективность присвещания, сравнивая процент и распределение MCs в коже уха притязаных мышей против диких мышей типа.
  2. Анализ привития брюшной полости.
    1. Оценка количества тучных клеток в брюшной полости.
      1. В конце эксперимента эвтанизируйте мышей при вдыхании CO2 с последующим вывихом шейки матки. Тщательно удалите брюшной кожи мышей, не нарушая брюшной полости.
      2. Ввимите 5 мл холодного или комнатной температуры PBS в брюшной полости с помощью шприца 5 мл, оснащенного иглой 25 G. Используйте холодный PBS, чтобы уменьшить риск активации перитонеаных клеток (это очень важно при оценке дегрануляции брюшной MC или уровней некоторых продуктов, полученных mc в брюшной жидкости). Выполните массаж живота в течение 20 сек для сбора перитонеачных клеток.
      3. Медленно аспирировать брюшной полы с помощью 5 мл шприца оснащен 22 G иглы. Замержуйте объем аспирированной лавы (ожидайте восстановления до 80% вводимого объема).
      4. Передача брюшной жидкости в 5 мл полистирола круглой нижней трубки и центрифуги при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспират супернатант. Восстановите гранулы в 400 мкл холодной PBS.
      5. Подсчитайте общее количество перитонеаных клеток с помощью гемоцитометрической камеры. Используйте половину клеточной суспензии для анализа цитометрии потока (как описано в шаге 1.3.1), чтобы оценить процент и маркер выражения привитых MCs в брюшной полости. Умножьте общее количество брючных клеток на процент MCs, чтобы получить абсолютное количество перитонеаных MCs.
      6. Выполните цитоцентрифугации с остальными клетками, как описано в шаге 1.3.2.2. Воздух сухие слайды в течение 10 минут при комнатной температуре и рисовать воск круг вокруг клеток с помощью пера PAP.
      7. Обложка клетки с неразбавленной мая-Грюнвальд окрашивания раствор в течение 5 минут, а затем мыть в PBS в течение 5 минут, как при комнатной температуре. Обложка клетки с Giemsa пятно разбавленной 1:20 с деионизированной водой и инкубировать 20 мин при комнатной температуре. Вымойте горки 2 раза в водопроводной воде в течение 1 мин, затем воздух сухие горки.
      8. Клетки Coverslip с помощью монтажной среды и вычисляют процент присвятающих MCs с помощью светового микроскопа (считая не менее 400 клеток). Оцените эффективность присвещания, сравнив процент MCs в брюшной лаве присвящающих мышей по сравнению с дикими мышами типа.
    2. Оценка тучных клеток в мезентерических окнах.
      1. После брюшной лавы, описанной в шаге 3.2.1, разрежьте брюшеную мембрану, чтобы разоблачить кишечный тракт мышей. Упорядочить от 4 до 5 мезентерических окон на мышь на слайде.
      2. Зафиксировать слайды на 1 час в растворе Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol этанола, хлороформа и ледниковой уксусной кислоты) при комнатной температуре. Воздушно-сухие горки и удалить кишечник (фиксированные мезентерические окна будут оставаться прикрепленными к слайдам).
      3. Пятно препаратов в течение 20 мин при комнатной температуре с Csaba (Alcian синий / Сафранин O) окрашивание раствора.
        1. Чтобы сделать 500 мл пятна Чаба, подготовить 500 мл буфера ацетата, смешивая 100 мл 1 М ацетат раствора натрия с 120 мл 1 M HCl. Сделать до 500 мл с деионизированной водой и настроить рН до 1,42. Затем растворите 90 мг Сафранина (определяет «зрелые МС» красным цветом, 1,8 г алцианского синего цвета (определяет «незрелые МП» синим цветом) и 2,4 г феррикового сульфата NH4Fe (SO4)2 в 500 мл буфера ацетата.
      4. Слайды Coverslip с использованием монтажной среды, а затем подсчитать количество приколоть MCs на мезентерическое окно с помощью светового микроскопа. Оцените эффективность присвещания, сравнив процент и распределение MCs в мезентерических окнах присваивания мышей против диких мышей типа.
  3. Анализ И.В. Engraftment.
    1. В конце эксперимента, усыплять мышей ПУТЕМ2 ингаляции следуют шейки матки дислокации, и урожай ткани интереса (например, легких, кожи или селезенки) и исправить на ночь в 10% (vol/vol) буферных формалин при 4 градусов по Цельсию.
    2. Встраивание фиксированных тканей в парафин, разрезанные на 4 мкм секции и монтировать на стеклянных слайдах. Пятно слайды с 0,1% Толуйдин синий раствор в течение 1 мин при комнатной температуре. Вымойте горки в водопроводной воде в течение 1 мин, затем воздушно-сухие горки в течение 10 мин.
    3. Слайды Coverslip с использованием монтажной среды и оценки количества и распределения присвятывающих MCs на секции ткани с помощью светового микроскопа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор ' мачтыячейки стук-в' подход показан на рисунке 1, и включает в себя генерацию BMCMCs, количество клеток, которые должны быть engrafted i.p., i.d. или i.v. в MC-дефицит мышей (число может быть разнообразным, если указано на основе экспериментальной конструкции) и интервал между engraftment и эксперимент в зависимости от места инъекции (этот интервал также может варьироваться, если указано; например, содержаниехранимых посредников в цитоплазмических гранулах MC неуклонно увеличивается современем 38). На рисунке 2 показаны репрезентативные цитометрические анализы потока и толуидиновое голубое окрашивание БМКМК после 1, 15 и 45 дней культуры в среде DMEM, содержащей в 20% WEHI-3 клеточной среде в качестве источника IL-3. Обратите внимание, что BMCMCs, культурируемые в течение 45 дней, на 95% чисты, содержат большое количество цитоплазмических гранул и могут быть использованы для экспериментов по присвещаниям, в то время как клетки, вылечанные в течение 15 дней, не подходят для присвечтения. Рисунок 3 показывает репрезентативную успешную энграфирование в ухе pinnae 4 недели после i.d. engraftment(рисунок 3A), в мезентерических окнах(рисунок 3B) и брюшной полости(рисунок 3C) 6 недель после i.p. engraftment, и в легке(рисунок 3D) 12 неделей после i.v. engraftment.

Figure 1
Рисунок 1: 'Мачта ячейки стук-в' мыши модели для анализа функций MC in vivo. Дикий тип или мутант костного мозга полученных культурных MCs (BMCMCs) генерируются путем культивирования клеток костного мозга, по крайней мере 4-6 недель в 20% WEHI-3 клеточной кондиционированной среды в качестве источника IL-3 (или в качестве альтернативы в среде, содержащей 10 нг / мл рекомбинантной мыши IL-3). Эти BMCMCs затем могут быть приучены в MC-дефицитных мышей для создания так называемых 'мачтовых клеток стук в' мышей. BMCMCs могут быть введены через различные маршруты (внутривенные (i.v.), внутриперитонеальные (i.p.) или внутридермальные (i.d.) для местных (i.d., i.p.) или системных (i.v.) восстановления различных популяций MC. Функция MC (ы) в различных биологических ответах может быть проанализирована путем сравнения ответов на диких мышей типа, MC-дефицит мышей и 'мачты клеток стук в' мышей. Вклад (ы) конкретных продуктов MC может быть проанализирован путем сравнения ответов 'мачтовых клеток стук в' мышей приразвливания либо дикого типа BMCMCs или BMCMCs, полученных от мышей, которые не имеют, или выразить генетически измененных форм, таких продуктов. (Это модифицированная версия рисунка 1 из ref.12).

Figure 2
Рисунок 2: Оценка чистоты препаратов BMCMC с помощью цитометрии потока и микроскопии. (A) Представитель потока цитометрии анализы Fc'RI и KIT (CD117) выражение на поверхности 1 день (левая панель), 15 дней (средняя панель) и 45 дней (правая панель) старые BMCMCs. Propidium йодид (PI)-положительные мертвые клетки были исключены из анализа (не показано). Цифры указывают процент fc'RI'КИТи BMCMCs закрыты в синем квадрате. (B) Представитель фотографии BMCMCs окрашенных толуидин синий, нижняя панель является увеличение областей верхней панели определяется черными пунктирными линиями. Бары 10 мкм.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка эффективности MC engraftment на различных анатомических участках. (A)Представитель фотографии 4 мкм уха pinnae разделы окрашены толуидин синий. (B)Представитель фотографии мезентерических окон, окрашенных с Safranin / Acian Blue ('Csaba' пятно). (C) Представитель фотографии клеток, присутствующих в брюшной жидкости лаважа и окрашенных с мая-Грюнвальд Giemsa (MGG). (D)Представитель фотографии 4 мкм легких разделов окрашенных толуидин синий. Бары 50 мкм(A, B и D)или 20 мкм (C). Фотографии из C57BL/6 диких мышей типа (верхняя панель), MC-дефицит KitW-sh/W-sh мышей (средняя панель) и MC-дефицитных мышей engrafted с диким типом BMCMCs: BMCMCs KitW-sh/W-sh (нижняя панель). MCs обозначены стрелками.

Мышей Доступные фоны Номера MC
(устойчивое состояние)		 Другие фенотипы (рассмотреныв 9,10,13) Сообщено о присвечтениях с BMCMCs
КомплектW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Лаборатории Джексона -
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Отсутствие соединительной ткани и слизистых MCs Анемия, снижение числа базофилов и нейтрофилов, недостатки меланоцитов и интерстициальных клеток каджала, стерильные и т.д. i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; то есть49; fp.i. 63 Года
КомплектW-sh/W-sh C57BL/6
(Лаборатории Джексона -
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Единый нуклеотидный полиморфизм, проведенный в лабораториях Джексона, показывает, что эти мыши имеют лишь 87% C57BL/6-генетического фона.		 Отсутствие соединительной ткани и слизистых MCs Умеренное увеличение числа базофилов и нейтрофилов, увеличение количества клеток супрессорамиелоидного происхождения 64, недостатки меланоцитов и интерстициальных клеток Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Лаборатории Джексона -
B6. Cg-KitWsh/ HNihrJaeBsmGlliJ) Эти мыши были backcrossed >11 раз на фоне C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Заметное снижение брюшной полковиды (98%) и кожи (89-96,5%) MCs, слизистые MCs вряд ли будут исчерпаны Вероятное наличие слизистых MCs; репортер мышей показывает Cre-опосредованное удаление 'floxed' YFP трансгена в 30% селезенки НК-клеток66 никакой
Cpa3Cre/ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3 (icre)Hrr)		 Отсутствие соединительной ткани и слизистых MCs Cpa3, выраженный в других типах клеток; снижение числа базофильных i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3 (icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Макл-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Отсутствие соединительной ткани и слизистых MCs Cpa3, выраженный в других типах клеток; увеличение нейтрофилов селезенки и легкая анемия;
снижение числа базофильных		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (наши неопубликованные данные)

Таблица 1: Штаммы мышей с составляющими недостатками MC. Несколько штаммов мышейс c- комплект-зависимых или c-комплект-независимый составной дефицит MC доступны. В принципе, все эти штаммы могут быть использованы для генерации 'мачтовых клеток стук в' мышей (хотя, к лучшему нашему знанию, это еще не было сообщено для Mcpt5-Cre; R-DTA мышей). Тем не менее, каждый из этих штаммов имеет другие фенотипические аномалии и ограничения, которые следует иметь в виду при интерпретации результатов, полученных с этими мышами. Некоторые примеры успешного mc engraftment можно найти в ссылках. (Это измененная и обновленная версия таблицы 1 из ref.9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Почти 30 лет после его первоначальногоописания 38, 'мачты ячейки стук в' подход продолжает предоставлять ценную информацию о том, что MCs может сделать или не может сделать in vivo. Функции МС долгое время считалось ограниченным их ролью в аллергии. Данные, генерируемые с помощью подхода'mast cell knock-in',изменили эту точку зрения, предоставив доказательства того, что MCs могут, среди других функций, играть важную роль в защитехозяина от определенных патогенов 4,39 или ядов 28,31, или даже могут подавлять определенныеиммунные реакции 29,34,40.

В описании протокола мы решили сосредоточиться на генерации и привитии культурных MCs (BMCMCs), полученных из костного мозга, потому что большое количество этих клеток может быть получено в пробирке из костного мозга дикого типа или мышей-мутантов. Тем не менее, MCs также могут быть выучены непосредственно из эмбриональных стволовых клеток (эмбриональных стволовых клеток, полученных культурных MCs (ESCMCs)41 и, когда генетически совместимы, эти клетки также могут быть использованы для присвечения в MC-дефицит мышей. Этот альтернативный подход особенно интересен для изучения роли белка, дефицит которого вызывает эмбриональную летальность у мышей, и поэтому для которого BMCMCs недостаточно для этого белка не может быть создана. Оба BMCMCs и ESCMCs также могут быть трансокодированы в пробирке с лентивирусами кодирования генов, представляющих интерес или shRNA, чтобы заставить замолчать гены, представляющие интерес, до engraftment этих клеток в MC-дефицитмышей 31,33.

Мы обычно используем 20% WEHI-3-кондиционированной среды в качестве источника Ил-3 для культуры BMCMCs. Тем не менее, рекомбинантный Ил-3 (10 нг/мл, как описано в шаге 1.2.1) также может быть использован, и добавление рекомбинантного фактора стволовых клеток (SCF) к среде культуры может существенно увеличить число BMCMCsгенерируется 42,43. В зависимости от исследования, от 10 до 100 нг/мл рекомбинантных СКФ были использованы, в дополнение к Ил-3, для создания BMCMCs36,44,45. Следует иметь в виду, что коммерчески доступные мурин рекомбинантные препараты SCF от разных поставщиков могут отличаться по своей потенции, влияя на развитие БМКМ. Важно также признать, что детали подхода, используемого для генерации BMCMCs (например, добавляет ли один рекомбинантный SCF к IL-3-содержащей среде, продолжительность периода культуры и т.д.)может влиять на фенотип и функции таких клеток. Например, было сообщено, что BMCMCs хронически подвергаются SCF имеют повышенный уровень гистамина и некоторых протеаз44,46, но дисплей заметное затухание Fc-RI-опосредованного дегрануляции и цитокинов производства в пробирке45. Наконец, в дополнение к IL-3, WEHI-3-кондиционированная среда содержит много биологически активных молекул, которые могут повлиять на функции MC. BmCMCs, полученные с WEHI-3-кондиционированной среде, следовательно, вероятно, будет отличаться от BMCMCs, полученных с рекомбинантным Ил-3 (или с рекомбинантным Ил-3 плюс СКФ). Там было несколько исследований о том, или как долго любые такие различия в фенотипах BMCMCs порожденных в различных типах культуры среды сохраняются после присвечтения клеток в различных анатомических сайтов in vivo, и дополнительные исследования этого типа могут быть заинтересованы. Однако, независимо от выбранных условий культуры, один и тот же рецепт среды культуры должен использоваться для создания всех BMCMCs, которые будут использоваться для присвечтения в экспериментах, из которых результаты будут объединились для анализа. Кроме того, МС должны быть отючены, по крайней мере от 4 до 6 недель до их присвечения в MC-дефицит мышей, для того, чтобы достичь чистоты 95-98%(рисунок 2). Это делается для того, чтобы уменьшить вероятность того, что присутствие в "BMCMC популяций", гематопоэтических клеток, кроме тех, которые привержены линии тучных клеток (которые присутствуют в культурах на ранних интервалах после размещения клеток костного мозга в пробирке) может привести к появлению донорских клеток в дополнение к MCs в 'мачтовой клетки стук-в' мышей.

Мы представляем здесь подробный протокол для engrafting MC-дефицитных мышей с диким типом или мутант BMCMCs intraperitoneally (i.p.), внутривенно (i.v.) или внутридермально (i.d.) в ухе пинна, в виду того что эти трассы впрыска были использованы много исследователей. Тем не менее, BMCMCs также были успешно engrafted взадней коже 47, в подножки48,внутри-артикулярно49 иливнутри-черепно 50,51. Количество BMCMCs для присвечтения, а также интервал между engraftment и эксперимент, может варьироваться в зависимости от маршрута инъекции и целевого органа для engraft (Рисунок 1). Очень важно соблюдать такие интервалы после присвоить BMCMCs перед началом эксперимента, с тем чтобы достаточно времени для BMCMCs (которые не являются полностью зрелыми MCs), чтобы стать более зрелым in vivo. Поскольку содержание посредников, хранящихся в цитоплазмических гранулах MC, может продолжать увеличиваться в течениежизни клетки 38,52, для некоторых экспериментов можно пожелать увеличить интервал между МК-энграфтированием и началом эксперимента по оценке функции MC.

В зависимости от маршрута инъекций и/или количества вводимых БМКМ, цифры и/или анатомическое распределение усыновляемых МК могут отличаться от числа соответствующих местных популяций MCу диких мышей типа 12,23,53,54. MC-дефицит мышей engrafted i.p. или i.d. с BMCMCs может иметь около такое же число и распределение MCs чем родная населенность MC в одичалых мышах типа, в брюшной полости и мезентерии и в дерме, соответственно оцененных 4 до 8 неделей после перехода MC12.23. Внутривенная передача BMCMCs не приводит к нормальным номерам MC и/или распределению в большинстве тканей. Например, в коже таких и.в. -engrafted ' мачтовых клетокстук-вмышей. На 4-28 недель после i.v. инъекции BMCMCs в MC-дефицитных мышей, количество MCs в трахее значительно ниже, чем у соответствующих диких мышей типа. В отличие от этого, число MCs на периферии легких, как правило, больше, чем у соответствующих дикихмышей типа 12,23,53,55. I.v. передача BMCMCs также приводит к высоким уровням MCs в селезенке, тогда как очень немногие родные MCs типично найдены в этом органе в одичалыхмышах типа 23.56. Важно отметить, что предыдущие доклады показали, что i.v. инъекции BMCMCs в MC-дефицитных мышей не приводит к присвечению популяций MC в конкретных анатомических местах, таких как спинной мозг, лимфатическиеузлы или сердце 54,57. Несколько групп также отметили, что такое i.v. engraftment не приводит к присвечению кишечной слизистой MC (MMC)населения 23,58-60. Такие различия в числах MC и/или распределении перечтучтых MCs по сравнению с родными MCs должны быть приняты во внимание при интерпретации данных, полученных с помощью MC 'мачтовой ячейки knock-in'модель 9.

Существует несколько штаммов мышей с дефицитом MC, и важно выбрать, какой из них (ы) использовать в конкретном проекте. c-комплект мутантов MC-дефицитных мышей, таких как KitW/ W-V или KitW-sh/W-sh мышей, традиционно используются многими следователями. Тем не менее, такие мыши страдают от многих c-комплектсвязанных фенотипических аномалий рядом с их глубоким дефицитом MC (Таблица 1). В последние годы, несколько штаммовмышей с c-комплект-независимый составной дефицит MC былизарегистрированы 24-26. Некоторые из этих мышей также проявляют другие фенотипические аномалии рядом с их дефицитом MC(таблица 1), и дополнительные аномалии также могут быть обнаружены, как фенотип этих недавно описанных штаммов все еще находится под следствием. Все эти мыши и некоторые дополнительные новые типы MC-дефицит мышей были недавно рассмотрены вдеталях 9,10,13.

Учитывая ограничения каждого из MC-дефицит штаммов в настоящее время, мы рекомендуем попытаться проверить гипотезы о функции MC с использованием более чем одной модели дефицита MC9. В нашей лаборатории мы обычно выполняем пилотные эксперименты в KitW-sh/W-sh и Cpa3-Cre; Макл-1fl/fl мышей. Если мы получаем со согласием результаты в обоих типах MC-дефицитных мышей, то мы затем приступить к экспериментов по привечению, чтобы установить роль MCs и оценить потенциальную роль некоторых MC-производных продуктов. Наконец, следует отметить, что несколько штаммов, позволяющих индуцированное истощение MCs или Cre рекомбиназы опосредованное удаление "floxed" генов в MCs также недавнобыли описаны 25,49,61. Эти штаммы были подробно рассмотрены в другихместах 9,10,13 и представляют собой перспективные альтернативные - или дополнительные - подходы к изучению функций MC in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Н.Г. является получателем стипендий от французской "Фонд за Recherche Medicale FRM" и Филипп фонда; R.S. поддерживается Фондом Люсиль Паккард по охране здоровья детей и Стэнфордским номером UL1 R025744; P.S. поддерживается стипендией Макса Кейд фонда Макса Кейд и Австрийской академии наук и стипендией Шрёдингера Австрийского научного фонда (FWF): J3399-B21; S.J.G. признает поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения грантов U19 AI104209, NS 080062 и от программы исследований заболеваний, связанных с табаком в Калифорнийском университете; Л.Л.Р. признает поддержку со стороны Национального исследовательского фонда артрита (ANRF) и Национального института здравоохранения грант K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 99,c-kit фактор стволовых клеток Fc'RI иммуноглобулин E модель мыши приемная передача иммунология аллергия
Анализ функций тучных клеток <em>In Vivo с использованием</em> <em>'Mast Cell Knock-in'</em>Mice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter