Introduction
세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. 1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. 3 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. 4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 6 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. (7) 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. (8)
암세포 타원체는 시험관 내에서 중요한 3D 종양 모델을 제시한다. 9,10 타원체는 비 - 부착 표면 또는 스피너 플라스크, 액체 오버레이, 미세 마이크로 같은 기법을 사용하여 현탁액 중의 암세포의 자발 또는 유도 조립체를 통해 형성 컴팩트 클러스터 아르 . 어레이, 미세 유체 및 매달려 방울도 11 ~ 16 타원체는 형상과 중앙 영역에 산소, 영양분, 약물 화합물의 제한으로 전송을 포함한 고형 종양의 주요 기능을 모방; 따라서, 그들은 더 밀접하게 약물 respon를 재생단층 문화에 비해 고형 종양의 자체.이 현저한 이점에도 불구하고 17 ~ 19, 타원체 정기적으로 암 세포에 대한 화학 물질의 스크리닝에 사용되지 않습니다. 상업적으로 이용 가능한 로봇 및 심사 / 이미징 도구와 호환되는 표준 높은 처리량 설정에서 균일 한 크기의 타원체를 생산 난이도는 신약 개발 파이프 라인으로 회전 타원체 문화의 결합을 방해. 사용자 정의 재료와 플레이트는 최근 이러한 요구를 해결하기 위해 시중에서 판매되고 있지만, 비용을 고려은 광범위한 사용을 방지.
새로운 매달려 드롭 플랫폼과 미세 마이크로 우물을 사용하여 높은 처리량의 일관된 크기의 타원체를 생산하는 기능이있는 두 가지 주요 기술. 13,16,20 그러나, 두 가지 접근 방식은 특별한 접시와 제작이 비싸고 엔드 포인트 사용자를위한 불편 장치가 필요 핵심 연구 센터 및 제약 산업 대부분의 주요 EF에서새로운 항암 약물의 발견을위한 요새가 만들어진다. 드롭 플레이트 매달려의 최근 디자인 세포 함유 방울의 안정성에 약간의 개선에도 불구하고, 판 매 다른 구멍은 여전히 방울의 확산 / 병합을 방지하기 위해 문화 중에 사용됩니다. (16)이 크게 실험 처리량을 감소시킨다. 의약품 추가 및 갱신은 수동 또는 로봇 피펫으로 어려운이 판 구성은 플레이트 리더로 기존의 검사 장비와 쉽게 호환되지 않기 때문에 타원체는 생화학 적 분석을위한 표준 플레이트에 전달 될 필요가있다. (21) 마이크로 웰은 또한 소프트 리소그래피를 사용하여 제작 제어 크기 회전 타원체 생산을 할 수 있습니다. 13, 20을하지만, 표준 피펫 팅 툴이 플랫폼의 호환성은 단일 처리 조건에 모든 구 상체를 노출, 다른 약 화합물 / 농도 개별 타원체의 치료 방지 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 높은 적합하지 않다여러 화합물 / 농도의 동시 테스트를 필요로 처리 화합물 스크리닝.
이러한 장애를 극복하기 위해, 표준 96 웰 플레이트에서 일관 크기 암세포 타원체의 높은 처리량의 생산을위한 새로운 기술이 개발되었다. 22, 23 접근법은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 수성 개의 상 시스템 (ATPS ()에 기초 상 형성 중합체와 같은 PEG)과 덱스 트란 (DEX). (24) ATPSs는 최근 셀의 미세화를 가능하게하는 새로운 세포 생물학적 다양한 응용 분야에 활용이 높은 수성 미디어의 셀에 생물학적 시약의 전달을 현지화하고있다. 25 ~ 32을 형성하기 회전 타원체가 암세포 DEX 수성 상과 현탁액의 서브 드롭 마이크로 리터와 혼합이 잘 함유 수성 침지 PEG 용액 상으로 피펫 팅한다. 드롭 타원체의 형성을 용이하게하기 위해 침지 위상 및 경계 셀에서 혼화 남아있다. 꼬마 도깨비ortantly, 높은 수성 침지 단계는 회전 타원체의 세포에 영양분을 제공하며, 미디어 삼투압 변화 및 약물 농도의 변동을 일으키는 다른 분석법에 공통 매체 증발의 잘 알려진 문제를 최소화한다. 이 기술은 회전 타원체 생산에만 표준 96- 웰 플레이트에서 시판 시약 피펫 팅 도구를 사용하여 약물 치료를 가능하게한다. 중요한 것은, 타원체의 세포 반응의 분석은 표준 생화학 검정 및 플레이트 판독기를 사용하여 동일한 플레이트에서 수행된다. 로봇 액체 처리에 대한 접근 방식의 ATPS과 적응성 작업의 용이성 모노 문화 및 공동 문화 모두의 높은 처리량 생성이 간단 실험실 기술을 타원체 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 개선 된 테스트 처리량 및 테스트 화합물과 redu의 수가 증가 비용 효율성 (와 약물 개발 및 검색 프로세스에 암 세포 타원체의 통합을 향해 앞으로 중요한 단계가 될 것입니다CED 시약 소비)과 효율성 (시간에 손을 감소).
ATPS 접근법을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 암세포 타원체의 로봇 제조 상세한 프로토콜 설명한다. 또한, 얻어진 타원체와 상용 생화학 분석을 이용하여 세포 반응의 분석 하류의 약물 치료의 세부 사항이 제시된다.
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Protocol
고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS)
- 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가.
주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다. - 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가.
- 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해.
- 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물.
- 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다.
천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법에 대한 필터의 삽입에 배치 참고. 그것은 주사기 플런저의 움직임에 대한 저항을 경험하는 정상입니다. 용액의 일부는 필터에 남아 있지만, 중합체의 농도가 변화하지 않으므로 중합체 용액 경미한 손실이 발생한다. - 피펫 10 DEX 위상 솔루션의 μL 및 별도의 튜브에 매체의 10 μL에 희석은 6.4 % (w / v)의 DEX 단계 솔루션을 초래할 수 있습니다. 대기음 100 PEG 상 용액 μL 및 페트리 접시로 분배.
- PEG 용액 상으로 DEX 상 용액 (V / w) 6.4 % 0.5 μl를 분배. 시각적으로 현미경 DEX 강하를 관찰하여 성공적인 ATPS 형성을 확인합니다. 드롭 경계두 안정, 별도의 수성 단계의 존재를 나타내는, 계속 표시해야합니다.
- 사용할 때까지 4 ° C에서의 주식 수성 PEG와 DEX 단계 솔루션을 저장합니다.
주 : 폴리머 솔루션은 이전에 각 실험에 신선한 준비 및 보관 24 시간 내에 사용하는 것이 좋습니다.
인쇄 암의 세포 타원체 2. 준비
- 90 % -100 %의 융합 성 단층 관심 (예를 들면, MDA-MB-157 유방암 세포)의 암세포 성장. MDA-MB-157 세포, DMEM은 10 % FBS, 1 %의 글루타민, 및 1 % 항생 물질을 함유 이루어지는 매체를 사용한다.
- (제조사의 프로토콜에 따라)과 15 ML 원뿔에 서스펜션을로드 셀 분리 버퍼를 사용하여 수확 세포. , 173.3 XG에서 5 분 정도 원심 분리기 뜨는을 제거하고, 재현 탁 세포 완전한 성장 배지 1 ㎖에.
- 로드셀 상 혈구 계산하고이를 원하는 숫자를 계산하는원하는 회전 타원체 세포 밀도에 대한 세포의. T75 플라스크에 성장 MDA-MB-157 세포의 합류 단층은 보통 ~ 7 × 10 6 세포를 제공합니다.
주 :. 1.5 × 104 또는 MDA-MB-157 세포에 대한 큰 방울 체적에 필요한 세포 밀도가 단일 회전 타원체는 세포 유형에 의존 할 것이다 생성하기 위해 예를 들어 22, 밀도는 0.3 μL DEX 위상 드롭 당 권장 단일 회전 타원체의 형성을 보장합니다. - 173.3 XG에서 5 분 동안 원심 분리 두번째 세포 및 원하는 세포 밀도로 현탁 집중 성장 배지의 적당한 용적에 재현 탁 그들을.
참고 : 7 × 106 암세포 수확 예를 들어, 0.3 μL의 DEX 위상 강하는 1.5 × 104 세포 밀도의 타원체를 형성하는데 필요한 세포 현탁액의 총 부피는 140 μL 것이다. 그러나 인해 다음 단계에서 DEX 상 용액으로 희석 만 세포를 재현 탁하는 세포 배양 배지의 70 μl를 사용한다. - 철저히 세포 DEX 혼합 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 세포 현탁액을 혼합한다. 피펫 위아래로 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 수행해야합니다.
공동 배양 타원체의 인쇄 3. 준비
- 암 세포 성장 (예를 들어, MDA-MB-157 인간 유방암 세포) 및 90 % -100 %의 융합 성 단층을지지 세포 (예, 인간 섬유 아세포). (제조사의 프로토콜에 따라) 세포 해리 완충액을 이용하여 각 세포 유형 수확.
- 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체.
참고 : 예컨대 칼 세인 AM (생균 얼룩) 핵 염색 (훽스트) 형광 염료는 두 종류의 세포를 구별하는데 사용될 수있다.
- 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체.
- 혈구에 별도로 각 세포 유형을로드하고 공 배양 세포 타원체를 지원하는 암세포의 원하는 비율에 대한 각각의 세포 유형의 필요한 개수를 계산하도록 계산. T75 플라스크에서 재배 합류 MDA-MB-157 세포의 단층 및 섬유 아 세포는 일반적으로 각각 ~ 7 × 10 6 ~ 6 × 10 6 세포를 제공합니다.
- 두 종류의 세포 수의 바람직한 비율을 제공하는 암 세포에 세포 현탁액을지지 현탁액으로부터 정확한 볼륨. 예를 들어, 하나의 섬유 아세포 세포에 암 세포를 50의 비율을 사용한다.
- 원심 적절한 부피 173.3 XG 재현 탁하고 세포에서 5 분 동안 혼합 세포 현탁액을 함유하는 수성 원추형 DEX (/ V W)와 동일한 성장 배지의 부피를 12.8 %의 최종 농도로 포함하는 결과(1.2에서 준비) 단계 솔루션입니다.
- 부드럽게 현탁액의 균질성을 확인하기 위해 위아래로 얻어진 세포 현탁액을 피펫.
96- 웰 플레이트 종양 타원체 4. 인쇄
- 어느 날 이전에 실험에, 1 % 코트 비 처리 된 둥근 바닥 96 웰 플레이트 24 시간 동안 37 ° C에서 (w는 / v)의 플루로 닉. 이 코팅은 배양 기간 동안 세포 부착을 방지 할 수 있습니다.
- 여과하고, 5 %의 50 μl를 분주를 96 웰 플레이트 (대상 판)의 각 웰에 PEG 수성 상 (/ V w).
- 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 혼합 (2 단계 또는 각각 모노와 공동 문화에 대해 단계 3에서 제조) 및 384 웰 플레이트의 하나의 열 (소스 판)에서 잘 모든 다른 서스펜션의 20 μl를 추가 .
- 액체 핸들러와 "홈"좌표를 등록하는 피펫 팅 머리를 켭니다. 그런 다음 실험 실용을 보장하기 위해 (4.6 이하) 이전에 정의 된 프로토콜을 컴파일하고 매개 변수가 올바른 정의LY. 이 "원점 복귀"단계는 다른 액체 핸들러 다를 수 있습니다.
참고 : 프로토콜의 흐름, 단계별로 아래 4.6에 관계없이 사용되는 로봇 액체 핸들러의 유사합니다 표시; 그러나, 프로그래밍 인터페이스는 다른 의한 소프트웨어의 사용으로 다르게 보일 수있다. - 도 1에 도시 된 바와 같이 액체 핸들러의 워크 스테이션의 위치에 정의 된 소스 플레이트, 대상 판, 피펫 팁 및 박스를 배치.
- 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 실행
- 로드 워크 스테이션 (그림 1)에서 피펫 팁 (8 팁) 믹싱 액체 핸들러의 피펫 팅 헤드로부터 배럴 중 하나 열입니다.
- 소스 플레이트 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 혼합한다. 기포 형성을 방지하기 웰에 세포 현탁액의 부피보다 작은 혼합 볼륨을 선택.
- 빈 폐기물 팁 상자 (그림 1)에 팁을 꺼냅니다. 부하 10 μL 분배 피펫 팁 피펫 헤드로부터 배럴의 하나의 열 (그림 1).
- 대기음 각 피펫 팁으로 소스 플레이트에서 세포 현탁액 0.3 μL (도 1).
- 대상 판의 하나의 열 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 분배. 0.5 mm의 높이 및 분배 미만 1 μL / sec의 분사 유량을 사용한다.
- 전체 대상 플레이트에 컬럼 별 인쇄가 완료 될 때까지 반복 4.6.6을 통해 4.6.1 단계를 반복합니다.
- 조심스럽게 워크 스테이션 표면에서 대상 플레이트를 제거하고 CO 2를 37 ° C에서 습기가 인큐베이터에 배치하고 5 %. 세포를 포함하는 위상 DEX 방울의 교란을 방지하기 인큐베이터로 운반시 접시 수평을 유지한다.
- DEX 단계 드롭 내에서 회전 타원체로 세포의 응집을 할 수 있도록 24 시간 동안 접시를 품어.
다음 프로토콜은 4 일간의 약물 치료이며, 그것은 다른 치료 기간을 수정할 수 있습니다 일 2. 후 신선한 약물과 갱신이 포함되어 있습니다.
- 시각 24 시간 후 96 웰 플레이트의 회전 타원체의 형성을 확인합니다. 각 회전 타원체의 최소 및 최대 직경을 평균하여 타원체의 크기 측정을위한 이미지 우물을 필요로합니다.
- 소정의 용해도 농도 제조사 권장 용매 및 원하는 약물의 원액을 준비한다. 예를 들어, ㎖ / 2 mg을 물에 시스플라틴을 용해.
주 : 약물이 빛에 민감한 경우 빛으로부터 약물의 원액을 보호합니다. - 시리얼 희석 기술을 사용하여, 이전 단계에서 제조 스톡 용액으로부터 세포 배양 배지로 희석 약물 농도를 준비한다. 각 회 희석하여 원하는 농도가 이루어져야한다. DIL의 ution 비율은 시작 재고 농도에 따라 달라질 수 및 작업 농도를 원하는 것입니다.
- 각 웰에 이전 단계에서 제조 된 약물 용액 50 μL를 추가한다. 이 로봇 또는 수동 피펫 팅하여 수행 할 수 있습니다.
주 : 각 약물 농도는 각 웰에 50 ㎕의 이미 PEG 수성 상으로 원하는 농도로 반으로 희석한다.- 각 농도 96 웰 플레이트 (N = 16)의 두 개의 열에서 타원체를 사용합니다.
- 대조군 웰에서, PEG 수성상의 기존 50 μL 신선한 배지의 50 μL를 추가한다.
- 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 48 시간 및 5 % CO 2,위한 약물과 타원체 부화.
- 배양 48 시간 후, 소정 농도의 신선한 약물 희석액을 제조하고 각 웰에 신선한 약물 용액 50 μl를 첨가하여 약제를 갱신.
주 : 웰이 이미 제 약물 t에서 원하는 약물 농도를 포함reatment. 더 희석이 발생하지 않는 것이므로 따라서 갱신이 단계에서, 각각의 농도가 목적하는 농도로 제조한다. - 빛으로부터 보호 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 약 5 % CO 2와 타원체를 품어.
6. 타원체의 세포 생존 능력의 분석
- 갱신 약물 (즉, 약물과 타원체의 처리의 총 시간 4 일)와 배양 48 시간 후, 잘 매뉴얼 피펫 팅에 의해 하나의 매체의 총 부피를 측정한다.
참고 : 하나 잘 일반적인 볼륨이 140 μl의 (작은 감소는 증발로 인해 발생) ~이다. - 웰 총 부피의 10 % 농도 세포 생존 시약 (예 PrestoBlue)의 체적을 계산한다. 각 웰에 세포 생존 시약이 볼륨을 추가합니다.
주 : 웰 140 μL의 기존 미디어 부피, 15.6 μL의 부피는 웰의 총 농도 10 %를 제공 할 필요가있다. 이 계산됩니다9 (140 μL / 9 = 15.6 μL)에 의해 기존의 미디어 볼륨을 분할. - 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 6 시간 동안 각각의 웰에 첨가 세포 생존 시약, 접시를 인큐베이션.
- 마이크로 플레이트 리더에서 접시를 놓고 각각 560 nm에서 590 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 신호를 읽어보십시오.
- 동일한 처리 조건에서 값을 평균 한 후 대조군 웰의 처리함으로써 웰로부터 형광 신호를 정규화하여 타원체에서 세포의 생존 비율을 계산한다.
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Representative Results
로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수납된다. 2 개의 상, 수성 시스템 "인쇄"프로세스의 개략적 인 도표를 나타낸다. 수성 DEX 단계 (블루, 패터닝 단계)에서 세포 현탁액 로케이션 피펫 팁은 가까이에 그 콘텐츠를 분배하도록 수성 PEG 단계 (핑크, 침지 단계)를 함유하는 96 웰 플레이트의 둥근 바닥 웰 내로 하강 잘 바닥. 얻어진 DEX 위상 강하 확산되는 암세포를 제한하고 결과 세포 - 세포 상호 작용을 촉진세포 및 회전 타원체 형성 응집. 회전 타원체 형성은 자발적이며,도 2의 실험 이미지와 같이 배양 24 시간 내에 일어난다. 실제로,이 회전 타원체 인쇄는 96- 웰 플레이트에서 컬럼 별을 행한다. 스페 로이드를 형성 한 후, 배양액을 단일 성상으로 2 상 변환 시스템, 새로운 배지에 직접 첨가함으로써 갱신된다. 이 전환은 PEG와 DEX 수성 상 분리에 필요한 임계 농도 이하의 농도로 PEG 및 DEX 감소에 기인한다.
액체 핸들러의 종래의 공기 변위 피펫 팅기구로부터 디스펜스는 파라미터 적 최적화 하였 더니, 0.5 mm, 미리 흡입 풍량 생산 0.2 μL 분배 하였다 미만 1 μL / sec의 분사 유량의 분배 높이 수성 DEX의 가장 일관된 크기 방울, 따라서 회전 타원체. (23) 그림 3a 창피332 ± 31 μm의 평균 직경을 가진 하나의 플레이트에서 96 타원체의 직경의 분포를한다. 이전의 경험은 이러한 접근법은 전형적으로 평균 직경이 약 8 % -10 %의 표준 오차와 회전 타원체를 생성 함을 보여준다.도 3B는 직경이 정규 분포 것을 보여주는,도 3a에서와 같은 판의 회전 타원체의 직경의 도수 분포를 도시한다.
다음에, 새로운 플레이트에 회전 타원체를 전송할 필요없이 표준 96 웰 플레이트와 같은 플레이트에서 세포 반응의 분석에서 화합물 스크리닝이 접근법의 전위가 입증되었다.도 4는 MDA의 생존을 용량 의존적 연구를 도시 -mb-157 유방암 세포 스페 로이드 임상 화학 요법 약물, 시스플라틴으로 처리 하였다. 약물 - 처리 및 제어 타원체는 상업용 PrestoBlue 시약 (세포 생존율 시약)와 함께 배양 하였다. 효소 적 활성 세포 REA 감소신사는 미디어 색상의 변화와 형광 신호의 변화의 결과. 신호의 변화는 살아있는 세포 (예를 들어, 제어 타원체에)와 큰했다. 스페 로이드에서의 암세포의 생존 능력은 1 μM 이상 약물 농도가 증가함에 따라 감소 하였다. 이 시험은 LD50 = 4.67 μM의 50 % 치사량의 약물 농도 결과.
3 차원 배양이 두 수성 상 시스템 기술은 간질 세포를지지 세포 미세 환경 등의 다른 구성 요소들을 포함하여보다 현실적인 종양 모델의 직접적인 생산을 허용한다. 이것은 3D 배양에서 간질 세포를 포함하는 것이 이전에 도시 한 내용은 MDA-MB-157 인간 유방을 조합하여 생성 된 개념 증명 실험 공동 배양 타원체로 성장, 증식, 암세포의 침윤. 33-35 변조 (50)의 비율로 암세포와 인간 섬유 아세포 :. 36 일 이전의 실험으로, MDA-MB-157 세포는 섬유 아세포와 염색핵 염색 (청색) 및 생균 염색 (녹색)로, 각각 형광 이미지의 세포의 검출을 허용한다.도 5a는 1.5 × 104 세포의 밀도 및 50와 공동 배양 타원체의 형광 및 위상 이미지를 나타낸다 :. 암 세포와 섬유 아세포의 1 비율도 5b는 비교 MDA-MB-157 세포의 제어 타원체를 나타낸다. 이 접근법은 암세포의 표현형에 각종 기질 세포의 효과를 평가할 수있게된다.
그림 1. 액체 처리 플랫폼. 액체 핸들러는 팁을 혼합 스테이션, 분배 팁, 폐기물 팁 상자, 소스 플레이트로 구성되며, 대상 플레이트 위치가 배치됩니다. 각 국의 위치는 프로토콜에서 정의된다. 믹싱 피펫 팁 헤드의 한 컬럼에 로딩하고, 수성 상 DEX의 용액을 혼합하는 데 사용되는 소스 접시에 세포를 포함. 이러한 팁은 팁 폐기 상자에 폐기되고 분배 팁 피펫 헤드의 동일한 열 상에 삽입된다. 이러한 도움말 소스 플레이트로부터 세포를 포함하는 수성 DEX상의 0.3 μl를 대기음 대상 판 웰 이미 침지 PEG 위상 내의 DEX상의 셀 - 함유 방울을 형성하는 대상 플레이트로 분주. 마지막으로 이러한 팁은 또한 인쇄의 한 사이클을 완료하는 폐기물 팁 상자의 배치된다.
그림 2. 회전 타원체 형성. 액체 핸들러는 잘 수성 PEG 솔루션을 포함하는 (핑크)로 수성 DEX 단계 (파란색) 세포 (녹색)를 포함하는 0.3 μl를 분배합니다. 오른쪽 그림과 같이이 배양 24 시간 후 회전 타원체의 형성을 초래한다. 스케일 바 200 μm의.TPS : //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 회전 타원체 일관성 데이터. 96 웰 플레이트에서 측정 타원체의 직경 () 배포, 각 지점은 하나의 회전 타원체를 나타냅니다. (b) 직경의 빈도 분포는 데이터의 정규 분포를 나타낸다.
도 4의 타원체 약 응. MDA-MB-157 유방암 세포 타원체 세포의 생존은 200 nm의 1 μM 범위에 걸쳐 시스플라틴의 농도가 증가함에 따라 감소시킨다. 점선 생존 데이터에 맞는 S 자형이다.
그림 5. 공동 문화 타원체 () 형광등 (왼쪽)와 위상차의 타원체의 (오른쪽) 이미지 MDA-MB-157 유방암 세포 (파란색) 공동 배양 (50)에서 섬유 아세포 (녹색)와 함께 :. (1) 비. MDA-MB-157 세포의 (b)는 타원체는 비교를 위해 표시됩니다. 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원체의 유지, 및 인 시츄 약물 치료 및 상업적인 시약 및 도구 세포 반응의 종점 분석을 허용한다. 따라서,이 기술의 주요 장점은 3D 암 세포 배양의 기존 접근 방식을 통해이며, 신약 개발을 촉진 할 수있는 검사 플랫폼을 제공한다.
마이크로 웰 플레이트 내에서 균일 한 크기의 타원체를 생성하면 유사한 기준 셀룰러 교류를 보장하기 위해 높은 처리량 검사 애플리케이션을위한 매우 중요하다모든 타원체에 tivity 수준. 공기 변위 피펫 팅기구 액체 핸들러를 사용하여, 상기 수성 DEX상의 분배 키 액체 핸들링 파라미터 (프리 흡입 공기량, 높이를 분배 유량 분배 등)의 영향을 정량화 통해 분배 프로세스를 최적화하는 것이 중요 . 이러한 최적화 피펫 헤드 우물에 위상 DEX 점성 용액 및 암세포 쓸어 균질 타원체를 제조 할 수있다. 이들 세 가지 파라미터에 대한 특정 수량 SRT 브라보 액체 핸들러 프로토콜에서 판정 하였지만, 유사한 방식이 침지 PEG 상에 분배 일관된 DEX 위상 입자경 결과 최적 분배 조건을 결정하는 다른 액체 핸들러를 사용해야한다. 또한, 팁 (96)을 사용하여 동시에 모든 96 웰에 스페 로이드를 인쇄 할 수있다. 그러나, 이것은 유의와 소스 판을 채우기 위해 필요한 셀들의 개수를 늘려수성 DEX 단계 포함하는 셀. 열 방향에 관계없이 전체 또는 플레이트 인쇄 방법의 선택, 상기 흡입 단계에 앞서 소스 판의 컨텐츠를 혼합하는 것이 중요하다. 이것은 DEX 단계에서 치밀한 세포 현탁액을 균질하고 회전 타원체의 크기의 변동을 감소 시킨다는 것을 보장한다.
몇몇 연구는 암 세포 타원체는 시약의 형태와 확산 제한 등의 무 혈관 종양의 몇 가지 주요 특성을 모방하는 것을 보여; 따라서 이들은 전통적인 단층 배양 세포에 비해 암세포에 대해 신규하고, 종래의 화합물의 효능을 평가하기위한 생리 학적으로 관련 모델을 제시한다. 8,17,18,21,23,37 그것은 도시되는 생산하는 수성 개의 상 시스템 접근 스페 로이드는 단순히 편리하고 또한 원하는 시점에서 의약 화합물의 갱신 및 표준 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 세포 생존의 자동 선별하여, 동일한 플레이트에서 약물 검사를 허용한다. 이예컨대,이 암 세포와 종양 미세 환경에서 셀을지지하고 그 상호 작용에 연루된 것으로 알려져 약물 세포 반응의 분석을위한 표준 플레이트 타원체를 전송 요구한다. 또한 21 매달려 방울과 같은 기술을 통해 주요 장점은 수성 두 상 기술을 사용하여 각종 악성 따라서 암세포의 표현형. 33-35,38,39 암의 공동 배양 구 상체를 생성 할 수있는 능력 및 간질 세포 암의 응답에 종양 미세 환경의 지원 세포의 영향을 평가하는데있어 도움이 될 것이다 다양한 치료에 세포. 본 연구에서 수행 공동 배양 실험은이 기술이 성공적으로 암세포와 간질 세포를 함유하는 구 상체를 생성 할 수있는 개념 증명로서 기능한다. 미래 연구는이 기능을 활용 및 확산 및 약물 반응으로 모노와 공동 배양 타원체의 차동 특성을 조사합니다. 또한,이보다 자세히 기술 종양 모델에서 다른 기질 성분을 포함하여 생체 내 종양 미세 환경을 모방하는 플랫폼을 제공한다. (40)
요약하면,이 프로토콜은 어떤 외부의 힘을 사용하지 않고 96 웰 플레이트에서 타원체의 자발적 형성을 가능하게한다. 로봇 액체 핸들러에 적응하는 기술 표준 고 스루풋 포맷 속도 및 회전 타원체의 생산 효율을 향상시킨다. 상업 이미징 및 분석과 기술의 호환성은 학술 및 산업 실험실에서 사용할 수있는 다른 악기를 사용 할 수 있습니다 플랫폼을 분석한다. 미래의 애플리케이션의 경우,이 프로토콜은 3D 암 세포 배양 루틴 기술로 약물 검사를 간소화합니다. 또한,이 방법은 용이하게 다른 크기, 다른 세포 유형, 공동 배양 타원체 암 및 간질 세포의 상이한 조합의 스페 로이드를 형성하도록 변경 될 수 있으며, 높은 처리량 마이크로 웰 플레이트 t까지 확장 할O 상기 항암 약물 검사를 신속.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
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