Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Introduction

توفر المقايسات خلية القاعدة أداة هامة لتطوير واكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. 1،2 تاريخيا، وقد استخدمت الثقافات أحادي الطبقة من الخلايا السرطانية للتحقيق كفاءة مركبات مرشح ضد أنواع معينة من الخلايا السرطانية. سهولة الصيانة الثقافات أحادي الطبقة في لوحات ثقافة القياسية، والتوافق لوحات القياسية مع الأدوات الروبوتية التجارية لإضافة الكواشف، ومع معدات الفحص لتحليل المصب من الاستجابات الخلوية إلى المركبات الكيميائية هي الفوائد الرئيسية التي تجعل الثقافات 2D أداة جذابة لاختبار المخدرات 3. لسوء الحظ، غالبا ما تفشل المقايسات خلية أحادي الطبقة التنبؤ فعالية من المركبات في الجسم الحي، مما يجعل تطوير العقاقير واكتشاف عملية مكلفة للغاية. وعلى الرغم من 4،5 استثمارات كبيرة وجهد من قبل شركات الأدوية والوحدات الأكاديمية، فقط ~ 1٪ المضادة للسرطان تمت الموافقة على المخدرات في التجارب السريريةمن قبل FDA على مدى العقدين الماضيين. 6 التفاوت بين الثقافات 2D و 3D البيئة المعقدة من الخلايا السرطانية في الجسم الحي هو أحد أوجه القصور الرئيسية لنظم الاستزراع أحادي الطبقة. 7 لذلك، وفحص المركبات مرشح ضد الخلايا السرطانية في الإعداد الذي أكثر شبها البيئة الورم 3D قد تعجل تطوير عقاقير العلاج الكيميائي الرواية. 8

الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية تقديم نموذج ورم 3D ذات الصلة في المختبر. 9،10 الأجسام الشبه الكروية هي مجموعات المدمجة التي تشكل من خلال التجمع العفوي أو المتعمد من الخلايا السرطانية على الأسطح غير ملتصقة أو في تعليق باستخدام تقنيات مثل قارورة الدوار، تراكب السائل، والصغرى microfabricated . كذلك المصفوفات، على microfluidics، وقطرات شنقا 11-16 الأجسام الشبه الكروية تحاكي الملامح الرئيسية الأورام الصلبة بما في ذلك الهندسة والنقل محدود من الأكسجين والمغذيات، والمركبات المخدرات في المنطقة الوسطى. وبالتالي، فإنها تتجدد بشكل وثيق respon المخدراتحد ذاته من الأورام الصلبة مقارنة الثقافات أحادي الطبقة. 17-19 وعلى الرغم من هذا الاستحقاق ملحوظة، لا تستخدم الأجسام الشبه الكروية بشكل روتيني لفحص المركبات الكيميائية ضد الخلايا السرطانية. صعوبة إنتاج الأجسام الشبه الكروية موحدة الحجم في إعداد إنتاجية عالية القياسية التي تتوافق مع الروبوتات المتاحة تجاريا وأدوات الفحص / التصوير تعرقل إدماج ثقافة كروي في خط أنابيب تطوير الأدوية. على الرغم من أن المواد المخصصة لوحات وأصبحت في الآونة الأخيرة المتاحة تجاريا لتلبية هذه الحاجة، اعتبارات التكلفة ردع استخدامها على نطاق واسع.

اثنين من التقنيات الرئيسية لديها القدرة على إنتاج الأجسام الشبه الكروية متناسقة الحجم في إنتاجية عالية استخدام منصة قطرة شنقا جديدة وmicrofabricated الآبار الصغيرة. 13،16،20 ومع ذلك، كلا النهجين تتطلب لوحات والأجهزة التي هي مكلفة لصنع وغير مريح للمستخدمين النهائيين الخاصة في مراكز البحوث الأساسية والصناعات الدوائية حيث EF معظم كبارمصنوعة الحصون لاكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. وعلى الرغم من بعض التحسن في استقرار قطرات تحتوي على خلية مع تصميم حديث من شنقا لوحات قطرة، لا تزال تستخدم فقط كل حفرة الآخر من لوحة خلال ثقافة لتجنب انتشار / دمج قطرات. 16 هذا يقلل بشكل ملحوظ الإنتاجية التجريبية. إدمان المخدرات والتجديد صعبة مع دليل أو pipetting لالروبوتية وتحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى لوحة القياسية لتحليل الكيمياء الحيوية الكروية لهذا التكوين لوحة غير متوافق بسهولة مع معدات الفحص التقليدية مثل لوحة القراء. ملفقة 21 مايكرو الآبار باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة أيضا سماح حجم تسيطر إنتاج كروي. 13،20 ومع ذلك، عدم توافق هذه المنصة مع الأدوات القياسية pipetting ليمنع علاج من الأجسام الشبه الكروية الفردية مع مختلف المركبات الدوائية / تركيزات، وفضح كل الأجسام الشبه الكروية إلى حالة معاملة واحدة. وهكذا، وهذه الطريقة ليست مناسبة لارتفاعفحص مجمع الخرج الذي يتطلب الاختبار في وقت واحد من المركبات متعددة / التركيزات.

للتغلب على هذه العقبات، وقد تم تطوير تقنية جديدة لإنتاج إنتاجية عالية من الحجم باستمرار الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا القياسية. 22،23 ويستند هذا النهج على نظام مائي على مرحلتين البوليمر (ATPS) مع البولي ايثيلين جلايكول ( وقد تم مؤخرا استخدمت PEG) وديكستران (DEX)، والبوليمرات التي تشكل المرحلة 24 ATPSs في مجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية خلية جديدة لتمكين micropatterning الخلية والمترجمة تسليم الكواشف البيولوجية للخلايا في الوسط المائي للغاية. 25-32 تشكيل ل كروي، يتم خلط الخلايا السرطانية مع المرحلة DEX المائية وانخفاض-ميكروليتر الفرعية لتعليق الناتجة من pipetted إلى تحتوي أيضا على الغمر المائي حل المرحلة PEG. يبقى قطرة إمتزاج من مرحلة الغمر والخلايا حدود لتسهيل تشكيل كروي. عفريتortantly، مرحلة الغمر المائي للغاية توفر المواد المغذية للخلايا كروي ويقلل من مشكلة معروفة من التبخر وسائل الإعلام المشتركة لبعض المقايسات الأخرى التي تسبب التغيرات في الأسمولية وسائل الإعلام وتقلبات تركيزات المخدرات. هذه التقنية تتيح إنتاج كروي والعلاج من تعاطي المخدرات فقط باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا وأدوات pipetting لفي لوحات 96-جيدا القياسية. الأهم من ذلك، يتم إجراء تحليل الاستجابات الخلوية من الأجسام الشبه الكروية في نفس لوحة باستخدام فحوصات البيوكيميائية القياسية والقراء لوحة. سهولة العمل مع ATPS والقدرة على التكيف للنهج لمعالجة السائل الروبوتية يجعل الجيل إنتاجية عالية من كلا أحادية الثقافة وشارك في الثقافة الكروية تقنية المختبرات مباشرة. وهذا النهج الجديد سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام نحو تكامل الكروية الخلايا السرطانية في عمليات التنمية المخدرات والاكتشاف مع تحسين الإنتاجية الاختبار وفعالية التكاليف (زيادة أعداد المركبات وredu اختباراستهلاك دائرة الهندسة المدنية كاشف) والكفاءة (خفض اليدين في الوقت المحدد).

يوصف بروتوكول مفصل لإنتاج الروبوتية من الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا باستخدام نهج ATPS أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض تفاصيل العلاج من تعاطي المخدرات من الناتج الكروية وتحليل المصب من الاستجابات الخلوية باستخدام مقايسة البيوكيميائية التجاري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد البوليمرية مائي نظام المرحلة الثانية (ATPS)

  1. تزن 0.5 غرام من غليكول البولي ايثيلين (PEG) (MW: 35،000) وإضافته إلى 9.5 مل من كامل متوسطة النمو في العقيمة 15 مل المخروطية لإعداد 10 مل من 5٪ (ث / ت) المرحلة PEG المائية.
    ملاحظة: إضافة نصف المتوسط ​​إلى المخروطية الأولى تليها إضافة البوليمر ثم المبلغ المتبقي من المتوسط ​​يقلل من التصاق البوليمر على الجدران المخروطية ويساعد البوليمر تذوب بشكل أسرع.
  2. تزن 0.128 غرام من ديكستران (DEX) (MW: 500،000) وإضافته إلى 0.872 مل من كامل متوسطة النمو في أنبوب معقم microcentrifuge 1.5 مل لإعداد 1 مل من 12.8٪ (ث / ت) مرحلة التنفيذ المباشر المائية.
  3. دوامة كلا حلول لحوالي 1 دقيقة لإذابة البوليمرات في المتوسط.
  4. إبقاء كلا حلول في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لضمان حل ومخاليط متجانسة. الحفاظ على أغطية فوق مستوى المياه لتجنب احتمال التلوث من الحلول من الحمامالمياه.
  5. تحميل حل المرحلة PEG إلى معقمة، المحاقن البلاستيكية وتمريرها من خلال مرشح حقنة من 0.2 ميكرومتر حجم المسام لإزالة الشوائب.
    ملاحظة: ملء المحاقن مع الحل PEG، وضعه في إدراج للمرشح على رأس أنبوب مخروطي الشكل واستخدام القوة، ودفع ببطء الحل من خلال مرشح. فمن الطبيعي أن تواجه مقاومة ضد حركة المكبس حقنة. خسارة طفيفة من الحل البوليمر تحدث عن بعض من الحل سيبقى في التصفية، إلا أن تركيز البوليمر لن تتغير.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من الحل مرحلة التنفيذ المباشر وتمييع في 10 ميكرولتر من المتوسط ​​في أنبوب منفصل أن يؤدي إلى 6.4٪ (ث / ت) حل المرحلة DEX. نضح 100 ميكرولتر من محلول المرحلة PEG والاستغناء عليه في طبق بتري.
    1. الاستغناء 0.5 ميكرولتر من 6.4٪ (ث / ت) حل المرحلة DEX في حل المرحلة PEG. تأكيد بصريا تشكيل ATPS ناجحة من خلال مراقبة هبوط DEX تحت المجهر. انخفاض الحدودينبغي أن تظل مرئية، مشيرا إلى وجود اثنين مستقرة، المراحل المائية منفصلة.
  7. تخزين مخزون مائي PEG وحلول مرحلة التنفيذ المباشر في 4 ° C حتى الاستخدام.
    ملاحظة: من المستحسن أن الحلول البوليمر يتم إعداد العذبة قبل كل تجربة وتستخدم خلال 24 ساعة من التخزين.

2. إعداد للطباعة من السرطان الأجسام الشبه الكروية خلية

  1. تنمو الخلايا السرطانية من الفائدة (على سبيل المثال، والخلايا MDA-MB-157 سرطان الثدي) إلى 90٪ -100٪ متموجة أحادي الطبقة. لMDA-MB-157 الخلايا، واستخدام وسيلة تتألف من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ الجلوتامين، و 1٪ للمضادات الحيوية.
    1. حصاد الخلايا باستخدام تفارق العازلة الخلية (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) وتحميل تعليق في مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج، وإزالة طاف، وخلايا resuspend في 1 مل من كامل متوسطة النمو.
  2. خلايا الحمل على عدادة الكريات ونعدهم لحساب العدد المطلوبخلايا لكثافة الخلايا كروي المطلوب. أحادي الطبقة متموجة من MDA-MB-157 الخلايا المزروعة في قارورة T75 عادة ما يعطي ~ 7 × 10 6 خلايا.
    ويوصى كثافة الخلايا المطلوبة لحجم قطرة لتوليد سوف كروي واحد يعتمد على نوع من الخلايا 22 على سبيل المثال، كثافة 1.5 × 10 4 أو أكبر لMDA-MB-157 خلية لكل ميكرولتر 0.3 قطرة مرحلة التنفيذ المباشر ل: ملاحظة. ضمان تشكيل كروي واحد.
  3. خلايا الطرد المركزي للمرة الثانية لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج و resuspend لهم في حجم مناسب من النمو المتوسطة لتركيز تعليق لكثافة الخلايا المطلوبة.
    ملاحظة: على سبيل المثال إذا كانت تحصد 7 × 10 6 خلايا السرطان، والحجم الكلي للتعليق الخلية المطلوبة لتشكيل كروي الكثافة 1.5 × 10 4 خلية في 0.3 ميكرولتر DEX انخفاض المرحلة ستكون 140 ميكرولتر. ولكن نظرا لتخفيف مع الحل مرحلة التنفيذ المباشر في الخطوة التالية، استخدم فقط 70 ميكرولتر من مستنبت الخلية ل resuspend الخلايا.
    4. 4 خلية كروي، يتم إضافة 70 ميكرولتر من محلول المرحلة DEX إلى 70 ميكرولتر من التعليق الخلية.
  4. تخلط جيدا تعليق خلية لضمان توزيع موحد للخلايا وخلط حل DEX. وينبغي أن يتم pipetting صعودا وهبوطا بلطف لمنع تشكيل فقاعة.

3. إعداد للطباعة من الأجسام الشبه الكروية المشارك مثقف

  1. تنمو الخلايا السرطانية (على سبيل المثال، MDA-MB-157 خلايا سرطان الثدي البشرية) وخلايا الدعم (على سبيل المثال، الخلايا الليفية الإنسان) إلى 90٪ -100٪ متموجة أحادي الطبقة. حصاد كل نوع من الخلايا باستخدام تفارق العازلة الخلية (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
    1. تحميل كل تعليق في المخروطية 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 173.3 x ج، ونضح طاف من كل المخروطية. Resuspend الخلايا المخروطية في كل 1 مل من ز الكاملrowth المتوسطة.
      ملاحظة: الأصباغ الفلورية مثل Calcein AM (وصمة عار الخلية الحية) والأصباغ النووية (هويشت) يمكن استخدامها للتمييز بين أنواع الخلايا اثنين.
  2. تحميل كل نوع من الخلايا بشكل منفصل على عدادة الكريات ونعدهم لحساب العدد المطلوب من كل نوع من الخلايا لنسبة المطلوب من الخلايا السرطانية الى دعم الخلايا في الأجسام الشبه الكروية شارك في تربيتها. الطبقات الوحيدة متموجة من MDA-MB-157 الخلايا والخلايا الليفية التي تزرع في قوارير T75 عادة ما تعطي ~ 7 × 10 6 و~ 6 × 10 6 خلايا، على التوالي.
  3. إضافة وحدة التخزين الصحيحة عن تعليق دعم الخلايا لخلايا السرطان تعليق لإعطاء نسبة المرجوة من عدد من أنواع الخلايا اثنين. على سبيل المثال، استخدام نسبة من 50 خلايا السرطان إلى 1 الخلية الليفية.
  4. الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على تعليق خلية مختلطة لمدة 5 دقائق عند 173.3 x ج و resuspend الخلايا في حجم مناسب لتؤدي في الكثافة النهائية التي تتألف من كميات متساوية من نمو المتوسطة و12.8٪ (ث / ت) DEX مائيحل المرحلة (المعد في 1.2).
  5. ماصة بلطف تعليق الخلية مما يؤدي إلى أعلى وأسفل لضمان تجانس تعليق.

4. طباعة الأجسام الشبه الكروية ورم في لوحة 96-جيدا

  1. قبل يوم واحد إلى التجارب، ومعطف، جولة القاع لوحات 96-جيدا غير المعالجة مع 1٪ (ث / ت) Pluronic عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. هذا الطلاء يمنع مرفق الخلية خلال الفترة الثقافة.
  2. الاستغناء 50 ميكرولتر من تصفيتها 5٪ (ث / ت) المرحلة PEG المائية في كل بئر من لوحة 96-جيدا (لوحة الوجهة).
  3. باستخدام ماصة، مزيج تعليق خلية (المعد في الخطوة 2 أو الخطوة 3 لأحادية وشارك في الثقافة، على التوالي)، وإضافة 20 ميكرولتر من تعليق على كل البعض جيدا من عمود واحد من لوحة 384 جيدا (لوحة المصدر) .
  4. تشغيل معالج السائل و"الوطن" رئيس pipetting للتسجيل الإحداثيات. ثم ترجمة بروتوكول المحددة سابقا (أقل من 4.6 في) لضمان معدات المختبرات ويتم تعريف المعلمات الصحيحلاي. هذا "صاروخ موجه" خطوة قد تكون مختلفة لمختلف معالجات السائلة.
    ملاحظة: تدفق البروتوكول، كما هو موضح خطوة بخطوة أدناه في 4.6، سوف تكون مشابهة بغض النظر عن معالج السائل الروبوتية المستخدمة؛ ومع ذلك، فإن واجهة برمجة قد تبدو مختلفة نظرا لاستخدام البرامج المختلفة.
  5. وضع لوحة مصدر، لوحة جهة، وصناديق ماصة الموجودة بالمواقع المحددة على محطة العمل من معالج السائل كما هو مبين في الشكل (1).
  6. تنفيذ البروتوكول الذي يتضمن الخطوات التالية:
    1. تحميل عمود واحد من برميل من الرأس pipetting لمن معالج السائل مع خلط نصائح ماصة (8 نصائح) من محطة العمل (الشكل 1).
    2. مزيج تعليق خلية في الآبار من لوحة المصدر (الشكل 1). تحديد حجم الخلط أصغر من حجم تعليق خلية في الآبار لتجنب تشكيل فقاعة.
    3. إخراج نصائح إلى مربع نصائح النفايات فارغة (الشكل 1). تحميل عمود واحد من برميل من الرأس pipetting لمع 10 ميكرولتر الاستغناء نصائح ماصة (الشكل 1).
    4. نضح 0.3 ميكرولتر من تعليق خلية من لوحة المصدر (الشكل 1) في كل طرف ماصة.
    5. الاستغناء تعليق خلية في آبار من عمود واحد من لوحة الوجهة (الشكل 1). استخدام ارتفاع الاستغناء 0.5 ملم ومعدل التدفق من الاستغناء أصغر من 1 ميكرولتر / ثانية.
    6. كرر الخطوات من 4.6.1 خلال 4.6.6 حتى الطباعة العمود تلو العمود في لوحة المقصد كلها كاملة.
  7. إزالة بعناية لوحة جهة من سطح محطة العمل ووضعه في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. الحفاظ على لوحة الأفقي عندما حملها في الحاضنة لتجنب تعطيل قطرات المرحلة DEX التي تحتوي على الخلايا.
  8. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة للسماح تجميع الخلايا في كروي داخل قطرة مرحلة التنفيذ المباشر.
<ص الطبقة = "jove_title"> 5. العلاج من تعاطي المخدرات من السرطان الأجسام الشبه الكروية خلية

لاحظ أن البروتوكول التالي هو لمعالجة مدمني المخدرات 4 أيام ويتضمن التجديد مع المخدرات الجديدة بعد يوم 2. ويمكن تعديل لفترات العلاج الأخرى.

  1. تأكيد بصريا تشكيل كروي في لوحات 96-جيدا بعد 24 ساعة. إذا لزم الأمر، والآبار صورة لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية عن طريق حساب متوسط ​​أصغر وأكبر بأقطار من كل كروي.
  2. إعداد محلول المخزون من دواء المطلوب حلها من قبل في مذيب الموصى بها من قبل الشركة المصنعة في تركيز الذوبان محددة سلفا. على سبيل المثال، ويحل سيسبلاتين في الماء عند 2 ملغ / مل.
    ملاحظة: حماية محلول المخزون من المخدرات من الضوء إذا كان الدواء هو حساسة للضوء.
  3. باستخدام تقنية التخفيف التسلسلية، وإعداد تركيزات الدواء المخفف مع زراعة الخلايا المتوسطة من حل الأوراق المالية على استعداد في الخطوة السابقة. وينبغي بذل كل تخفيف ضعف التركيز المطلوب. ديلوتختلف نسب ution اعتمادا على تركيز الأسهم تبدأ ورغبتك فى تركيزات العمل.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من محلول الدواء أعدت في الخطوة السابقة إلى كل بئر. ويمكن القيام بذلك آليا أو من قبل pipetting اليدوي.
    ملاحظة: سيتم تخفيفه كل تركيز الدواء في نصف إلى التركيز المطلوب من قبل 50 ميكرولتر المرحلة PEG المائية بالفعل في كل بئر.
    1. استخدام الأجسام الشبه الكروية من عمودين من لوحة 96-جيدا (ن = 16) لكل تركيز.
    2. في آبار المراقبة، إضافة فقط 50 ميكرولتر من مستنبت الطازجة إلى 50 ميكرولتر الحالية للمرحلة PEG المائية.
  5. احتضان الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، محمية من الضوء.
  6. بعد 48 ساعة من الحضانة، وإعداد التخفيفات جديدة من المخدرات بتركيزات المطلوبة وتجديد المخدرات عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الدواء الطازجة إلى كل بئر.
    ملاحظة: هذه الآبار تحتوي بالفعل على تركيز الدواء المطلوب من الأول ر المخدراتreatment. لذلك في هذه المرحلة التجديد، يتم تحضير كل التركيز على التركيز المطلوب نظرا لعدم التخفيف سيحدث.
  7. احتضان الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، محمية من الضوء.

6. تحليل الجدوى الخلوية في الأجسام الشبه الكروية

  1. بعد 48 ساعة من الحضانة مع تجدد المخدرات (أي الوقت الكلي للعلاج الأجسام الشبه الكروية مع المخدرات 4 أيام)، وقياس إجمالي حجم المتوسطة في واحدة بشكل جيد من قبل pipetting اليدوي.
    ملاحظة: حجم نموذجي في بئر واحدة هي ~ 140 ميكرولتر (يحدث انخفاض طفيف بسبب التبخر).
  2. حساب حجم خلية الجدوى كاشف (على سبيل المثال، PrestoBlue)، وتركيز 10٪ من حجم إجمالي جيدا. إضافة هذا الحجم من بقاء الخلية الكاشف إلى كل بئر.
    ملاحظة: مع حجم وسائل الاعلام القائمة من 140 ميكرولتر في بئر، مطلوب وبلغ حجم التداول 15.6 ميكرولتر لإعطاء تركيز 10٪ من إجمالي جيدا. ويتم احتساب ذلك من خلالتقسيم حجم الإعلامية القائمة بنسبة 9 (140 ميكرولتر / 9 = 15.6 ميكرولتر).
  3. احتضان لوحة مع كاشف بقاء الخلية تضاف إلى كل بئر لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  4. وضع لوحة في قارئ لوحة صغيرة وقراءة إشارة مضان في 560 نانومتر و 590 نانومتر الإثارة وانبعاث موجات، على التوالي.
  5. حساب الجدوى في المئة من الخلايا في الأجسام الشبه الكروية التي كتبها تطبيع إشارة الفلورسنت من الآبار التي تمت معالجتها لتلك الآبار السيطرة بعد حساب متوسط ​​القيم من شروط المعاملة نفسها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد محطة العمل من معالج السائل الروبوتية في الشكل 1. وقال رئيس pipetting لوصفت جميع المحطات المستخدمة في الطباعة الروبوتية من الأجسام الشبه الكروية في القسم 4.6. تظهر الصورة استخدام اثنين من محطات مختلفة لمربعات طرف (مجموعة واحدة من النصائح لخلط والمجموعة الثانية للالشفط / صرف خلية تعليق مائي DEX المرحلة خليط). يقع الإعداد بأكمله داخل خزانة السلامة البيولوجية القياسية للحفاظ على عقم الشكل 2 يصور التخطيطي لعملية "الطباعة" مع النظام على مرحلتين مائي. وخفضت وهناك معلومات ماصة محملة تعليق الخلية في المرحلة DEX المائية (الأزرق ومرحلة الزخرفة) في بئر مستديرة السفلي من لوحة 96-جيدا تحتوي على مرحلة PEG المائية (وردي، ومرحلة الغمر) إلى الاستغناء محتواه بالقرب من أسفل أيضا. أدى الانخفاض المرحلة DEX يقيد الخلايا السرطانية من تشتيت ويشجع التفاعلات خلية خلية التي تؤدي إلىتجميع الخلايا وتشكيل كروي. تشكيل كروي هو عفوية ويحدث خلال 24 ساعة من الحضانة كما هو مبين في الصورة التجريبية من الشكل 2. وفي الممارسة العملية، يتم تنفيذ هذه الطباعة كروي عمود من جانب العمود في لوحات 96-جيدا. بعد تشكل الأجسام الشبه الكروية، ويتم تجديد مستنبت بإضافة مباشرة من متوسطة جديدة، وتحويل النظام على مرحلتين إلى المرحلة المائية واحدة. ويرجع ذلك إلى انخفاض في تركيزات PEG وDEX أدناه تركيز العتبة المطلوبة للفصل المائية PEG وDEX مراحل هذا التحول.

الاستغناء عن آلية النزوح الهواء pipetting لالتقليدية للمعالج السائل والأمثل parametrically وتبين أن ارتفاع الاستغناء 0.5 ملم، وهو معدل تدفق الاستغناء من أصغر من 1 ميكرولتر / ثانية تليها الاستغناء 0.2 ميكرولتر من ينتج ما قبل يستنشق حجم الهواء حجم أكثر اتساقا من DEX مائي قطرات، وبالتالي الكروية. ديس 23 3A الشكليلعب توزيع قطرها 96 الأجسام الشبه الكروية من لوحة واحدة مع متوسط ​​قطرها من 332 ± 31 ميكرون. أظهرت التجارب السابقة أن هذا النهج عادة يولد الأجسام الشبه الكروية مع 8٪ الخطأ المعياري -10٪ في جميع أنحاء القطر المتوسط ​​الشكل 3B يبين توزيع تواتر قطر الكروية من نفس لوحة كما في الشكل 3A، مما يدل على أن أقطار يتم توزيعها بشكل طبيعي.

وبعد ذلك، وقد تجلى إمكانات هذا النهج لفحص مركب في لوحات 96-جيدا القياسية وتحليل الاستجابات الخلوية في نفس لوحات، من دون الحاجة إلى نقل الأجسام الشبه الكروية لوحات جديدة. ويبين الشكل 4 دراسة تعتمد على الجرعة من جدوى MDA -MB-157 الكروية الثدي الخلايا السرطانية تعامل مع دواء العلاج الكيميائي السريرية، سيسبلاتين. وحضنت الكروية المعالجة المخدرات والسيطرة مع كاشف PrestoBlue التجاري (خلية الجدوى كاشف). خفضت خلايا إنزيمي النشطة في الجرميةوأسفرت جنت في تغيير في اللون وسائل الإعلام والتحول في إشارة الفلورسنت. كان التحول في إشارة أعظم مع الخلايا الحية (على سبيل المثال، في الأجسام الشبه الكروية السيطرة). انخفضت قابلية الخلايا السرطانية في الأجسام الشبه الكروية مع زيادة تركيز الدواء أعلى من 1 ميكرومتر. أدى هذا الاختبار في 50٪ جرعة مميتة تركيز الدواء من LD50 = 4.67 ميكرومتر.

هذا على مرحلتين تكنولوجيا نظام مائي للثقافة 3D تتيح إنتاج مباشر من النماذج الورم أكثر واقعية من قبل بما في ذلك مكونات أخرى من microenvironments الخلوية مثل دعم خلايا انسجة. ولقد ثبت سابقا أن بما في ذلك الخلايا اللحمية في الثقافات 3D ينظم النمو والانتشار، وغزو الخلايا السرطانية 33-35 كما تم إنشاؤها من خلال الجمع بين MDA-MB-157 الثدي البشري إثبات صحة مفهوم الكروية التجربة، وشارك في الثقافة الخلايا السرطانية والخلايا الليفية الإنسان بنسبة 50: 1 36 قبل التجارب، وكانت ملطخة الخلايا MDA-MB-157 والخلايا الليفيةمع صبغة النووي (الأزرق) وصبغ الخلايا الحية (الأخضر)، على التوالي، للسماح للكشف عن الخلايا في الصور الفلورسنت. ويبين الشكل 5A الفلورسنت ومرحلة صور الأجسام الشبه الكروية شارك في ثقافة ذات الكثافة 1.5 × 10 4 خلايا و50 : نسبة 1 من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية ويبين الشكل 5B الكروية سيطرة MDA-MB-157 الخلايا للمقارنة. وهذا النهج سيمكن تقييم تأثير خلايا انسجة على الظواهر مختلفة من الخلايا السرطانية.

الشكل (1)
الشكل 1. السائل منصة تداول. ويتكون معالج السائل من المحطات حيث خلط نصائح، نصائح الاستغناء، مربع نصائح النفايات، لوحة المصدر، وتوضع لوحة مواقع الوجهة. يعرف موقع كل محطة في البروتوكول. يتم تحميل نصائح خلط على عمود واحد من الرأس pipetting لوتستخدم لخلط الحل من مرحلة DEX المائية تحتوي الخلايا في لوحة المصدر. ثم يتم التخلص من هذه النصائح للفي مربع نصائح النفايات ويتم إدراج نصائح الاستغناء على نفس العمود من الرأس pipetting ل. هذه النصائح نضح 0.3 ميكرولتر من المرحلة DEX المائية التي تحتوي على خلايا من لوحة المصدر والاستغناء عليه في لوحة وجهة لتشكيل قطرات تحتوي على خلية للمرحلة DEX ضمن المرحلة الغمر PEG بالفعل في الآبار لوحة الوجهة. وأخيرا يتم التخلص من هذه النصائح أيضا في مربع نصائح النفايات لإكمال دورة واحدة من الطباعة.

الشكل 2
الشكل 2. تشكيل كروي. يوزع معالج السائل 0.3 ميكرولتر من المرحلة المائية DEX (الأزرق) التي تحتوي على الخلايا (الأخضر) إلى تحتوي أيضا على حل PEG مائي (وردي). وهذا يؤدي إلى تشكيل كروي بعد 24 ساعة من الحضانة كما هو مبين في الصورة على اليمين. شريط مقياس 200 ميكرون.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الجسم الشبه الكروي اتساق البيانات. (أ) توزيع قطر الكروية تقاس من لوحة 96-جيدا، كل نقطة تمثل كروي واحد. (ب) توزيع تردد من أقطار يظهر التوزيع الطبيعي للبيانات.

الشكل (4)
الشكل 4. الاستجابة المخدرات من الأجسام الشبه الكروية. الجدوى من الخلايا في MDA-MB-157 الكروية خلية سرطان الثدي يقلل مع زيادة في تركيز سيسبلاتين أكثر من 1 نانومتر-200 مجموعة ميكرومتر. خط متقطع غير نوبة السيني للبيانات قدرتها على البقاء.

الرقم 5
الشكل 5. المشارك الثقافة الأجسام الشبه الكروية (أ) نيون (يسار) وعلى النقيض من المرحلة (يمين) وصور من الأجسام الشبه الكروية من MDA-MB-157 سرطان الثدي خلايا (الأزرق) المشارك مثقف مع الخلايا الليفية (الأخضر) في 50: 1 النسبة. وتظهر (ب) الأجسام الشبه الكروية من MDA-MB-157 الخلايا للمقارنة. مقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأجسام الشبه الكروية تقديم نموذج واقعي لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء الورم ونجاعة الأدوية وتوفير أداة مفيدة لمكافحة السرطان اكتشاف الأدوية. ان مثل هذه التطبيقات تستفيد كثيرا من التقنيات البسيطة جيل كروي والصيانة التي تتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، والتعامل مع الأدوات السائلة ومعدات الفحص. استخدام نظام على مرحلتين مائي الخلايا السرطانية الإجمالية عفويا خلال مرحلة الهبوط يسمح كفاءة الإنتاج وصيانة الكروية مع معالجات السائلة الروبوتية، والعلاج من تعاطي المخدرات الموقع وتحليل نقطة النهاية من الاستجابات الخلوية مع الكواشف والأدوات التجارية في. وهكذا، وهذه التكنولوجيا هي ميزة كبيرة على النهج القائمة الثقافات الخلايا السرطانية 3D وتقدم منصة الفحص لتسريع اكتشاف المخدرات.

توليد الأجسام الشبه الكروية موحدة الحجم في طبق من ذهب الصغيرة بشكل جيد أمر حاسم لتطبيقات فحص إنتاجية عالية لضمان وجود تيار الخلوي الأساسي مماثلمستوى الناقلية في جميع الأجسام الشبه الكروية. باستخدام معالجات السائلة مع آلية النزوح الهواء pipetting ل، من المهم لتحسين عملية الاستغناء عن طريق القياس الكمي لتأثير عوامل معالجة السائل الرئيسية (الاستغناء الارتفاع، الاستغناء معدل التدفق، وقبل أن يستنشق حجم الهواء) على الاستغناء المرحلة DEX المائية . هذا التحسين يسمح للرئيس pipetting للاكتساح خارج لزج حل مرحلة التنفيذ المباشر والخلايا السرطانية في الآبار وإنتاج الأجسام الشبه الكروية متجانسة. على الرغم من أن كميات محددة لهذه المعايير الثلاثة وقد تم تحديد في بروتوكول لمعالج السائل SRT برافو، ينبغي استخدام نهج مماثل مع غيرها من معالجات السائلة لتحديد الظروف المثلى الاستغناء التي تؤدي إلى ثابت المرحلة DEX حجم قطرة الاستغناء في مرحلة الغمر PEG. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن استخدام 96 نصائح وطباعة الكروية في وقت واحد في جميع الآبار 96. ولكن هذا يزيد بشكل كبير عدد الخلايا المطلوبة لملء لوحة مصدر فيالمرحلة تحتوي على خلايا المائية DEX. بغض النظر عن اختيار النهج الطباعة عمود الحكمة أو كلها لوحة، من الأهمية بمكان لخلط محتويات لوحة مصدر السابقة إلى الخطوة الطموح. هذا يضمن أن تعليق خلية كثيفة في المرحلة DEX متجانس ويقلل من الاختلافات في حجم الأجسام الشبه الكروية.

وتشير العديد من الدراسات أن الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية تحاكي العديد من الخصائص الأساسية للأورام اوعائي مثل التشكل ونشر القيود المفروضة على الكواشف. وبالتالي فإنها تقديم نموذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لتقييم فعالية رواية والتقليدية المركبات ضد الخلايا السرطانية بالمقارنة مع الثقافات الخلية أحادي الطبقة التقليدية. 8،17،18،21،23،37 وتبين أن نهج النظام على مرحلتين مائي لإنتاج الأجسام الشبه الكروية مريح يسمح فحص المخدرات في نفس لوحة، وذلك ببساطة عن طريق إضافة وتجديد مجمع المخدرات في نقاط الوقت المطلوب والفرز الآلي للبقاء الخلية باستخدام معيار قارئ لوحة الصغرى. هذاهي ميزة كبيرة على تقنيات مثل شنقا قطرات التي تتطلب نقل الأجسام الشبه الكروية إلى لوحة القياسية لتحليل الاستجابات الخلوية على الأدوية (21). وبالإضافة إلى ذلك، فمن المعروف أن دعم الخلايا في الورم المكروية وتفاعلاتها مع الخلايا السرطانية وتورط في سوف مختلف الظواهر الخبيثة الخلايا السرطانية. 33-35،38،39 ذلك القدرة على توليد الأجسام الشبه الكروية شارك في ثقافة من السرطان والخلايا اللحمية باستخدام المائية التكنولوجيا على مرحلتين تساعد على تقييم تأثير دعم خلايا الورم المكروية على ردود السرطان الخلايا لمختلف العلاجات. التجربة شارك في ثقافة أجريت في هذه الدراسة بمثابة مفهوم إثبات صحة أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تولد الأجسام الشبه الكروية التي تحتوي على الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية بنجاح. والدراسات المستقبلية تسخير هذه القدرة والتحقيق في الخصائص التفاضلية من الأجسام الشبه الكروية للأحادية وشارك في تربيتها مثل ردود انتشار الأسلحة النووية والمخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، وهذاتقدم تكنولوجيا منصة لتقليد أكثر عن كثب في الجسم الحي الورم المكروية التي كتبها بما في ذلك مكونات اللحمية الأخرى في نموذج الورم. 40

باختصار، هذا البروتوكول يتيح تشكيل عفوية من الأجسام الشبه الكروية في لوحات 96-جيدا من دون استخدام أي قوى خارجية. التكيف مع هذه التقنية إلى معالج السائل الروبوتية يعزز سرعة وكفاءة الإنتاج كروي في شكل إنتاجية عالية قياسية. التوافق بين التكنولوجيا مع التصوير التجاري وفحص يحلل منصات يسمح باستخدام أدوات مختلفة متوفرة في المختبرات الأكاديمية والصناعية. وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية، وهذا البروتوكول تبسيط فحص المخدرات مع مرض السرطان 3D الثقافات خلية تقنية روتينية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديلها بسهولة هذا النهج لتشكيل الأجسام الشبه الكروية من مختلف الأحجام، وأنواع مختلفة من الخلايا، مجموعات مختلفة من الخلايا السرطانية واللحمية في الأجسام الشبه الكروية شارك في الثقافة، ويتم تصعيده إلى أعلى إنتاجية لوحات صغيرة جيدا رس مزيد من الإسراع المضادة للسرطان فحص المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 98، سرطان خلية الجسم الشبه الكروي والثقافة 3D، الروبوتية، عالية الإنتاجية، المشارك الثقافة وفحص المخدرات
الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D.,… More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter