Introduction
Клеточные анализы являются важным инструментом для развития и открытия новых лекарств против рака. 1,2 Исторически сложилось так, однослойные культуры раковых клеток были использованы для изучения эффективности соединений-кандидатов против отдельных видов раковых клеток. Простота в обслуживании однослойных культур в стандартных планшетах для культивирования, совместимость стандартных пластин с коммерческими роботов инструментов для добавления реагентов, а также с сортировочного оборудования для нисходящего анализа клеточных реакций на химические соединения основные преимущества, которые делают 2D культурам привлекательный инструмент для тестирования на наркотики. 3 К сожалению, монослой клеток анализы часто не в состоянии предсказать эффективность соединений в естественных условиях, что делает разработки лекарственных препаратов и открытия чрезвычайно дорогостоящий процесс. 4,5 Несмотря на значительные инвестиции и усилия фармацевтических компаний и академических подразделений, только ~ 1% противораковых были утверждены наркотики в клинических испытанияхпо FDA в течение последних двух десятилетий. 6 Неравенство между 2D культур и комплексной среде 3D раковых клеток в естественных условиях является существенным недостатком систем культивирования монослоя. 7 Таким образом, скрининг соединений-кандидатов против опухолевых клеток в условиях, больше напоминает среда опухоли 3D может ускорить разработку новых препаратов химиотерапии. 8
Раковая клетка сфероидов представить соответствующую 3D модель опухоли в пробирке. 9,10 Spheroids компактные кластеры, которые образуют через спонтанного или индуцированного сборки раковых клеток на неприлипающих поверхностях или в суспензии, используя такие методы, как вращающуюся колбу, жидкого наложения, микроизготовленном микро- . также массивы, микрофлюидики и висячей капли 11-16 Spheroids имитировать основные черты твердых опухолей, включая геометрии и ограниченной сети транспорта кислорода, питательных веществ и лекарственных соединений в центральной зоне; следовательно, они более тесно регенерации наркотиков responSE солидных опухолей по сравнению с однослойных культур. 17-19 Несмотря на это заметное выгоды, не используются сферические обычно для скрининга химических соединений против раковых клеток. Трудность получения однородных по размеру сфероидов в стандартной установки с высокой пропускной который совместим с коммерчески доступными робототехники и инструментов скрининга / визуализации препятствует включению сфероида культуры в стадии разработки лекарственного средства. Хотя пользовательские материалы и пластины в последнее время стали коммерчески доступными для удовлетворения этой потребности, соображения экономии сдерживать их широкое применение.
Два основных методов с возможностью получения в соответствии размера сфероидов в высокой пропускной использовать новый висячей капли платформу и микроизготовленном микро-Уэллс. 13,16,20 Однако, оба подхода требуют специальных пластин и устройств, которые являются дорогостоящими для изготовления и неудобно для пользователей конечных точек в основных научно-исследовательских центров и фармацевтической промышленности, где наиболее крупных EFфорты для открытия новых лекарств против рака сделаны. Несмотря на некоторые улучшения в стабильности клеточных-содержащих капли с недавним дизайна свисающими тарелки, только каждый второй отверстие пластины до сих пор используется во время культивирования, чтобы избежать распространения / слияние капель. 16 Это значительно снижает экспериментальный пропускную способность. Добавление наркотиков и возобновление трудно с ручной или роботизированной пипетки и сферические должны быть переданы в стандартной пластины для биохимического анализа, поскольку эта конфигурация панель не легко совместим с обычным сортировочного оборудования, таких как плиты читателей. 21 микро-скважин изготовлены с использованием мягкого литографии также позволяют контролируемого размера сфероид производства. 13,20 Тем не менее, несовместимость этой платформы с помощью стандартных инструментов пипеток предотвращает лечения отдельных сфероидов с различными лекарственных соединений / концентрации, выставляя все сфероидов в одном состоянии обработки. Таким образом, этот способ не подходит для высокогоскрининг соединение, которое требуется одновременное тестирование нескольких соединений / концентрациях.
Чтобы преодолеть эти трудности, новая технология производства за большой пропускной способностью стабильно размера сфероидов раковых клеток в стандартных 96-луночных была разработана. 22,23 подход основан на полимерной водной двухфазной системе (АТП) с полиэтиленгликолем ( ПЭГ) и декстран (DEX) в фазе формирования полимеров. 24 ATPSs недавно были использованы в различных биологических приложений новым клеток, позволяющих клеток micropatterning и локализованной доставки биологических реагентов с клетками в водной среде высокой. 25-32 Для формирования сфероид, раковые клетки смешивают с водной фазой DEX и капли суб-мкл полученной суспензии с помощью пипетки в лунку, содержащую погружения водным раствором ПЭГ фазы. Падение остается не смешивается с этапа погружения и ограничивает клеток для облегчения образования сфероида. Чертенокortantly, высоко водную фазу погружения обеспечивает питательные вещества к клеткам сфероида и минимизирует хорошо известную проблему массовой информации испарения, общий для некоторых других анализов, которые вызывает изменения в медиа-осмотического давления и колебания концентрации препарата. Эта методика дает сфероид производства и медикаментозное лечение только с помощью коммерчески доступных реагентов-пипетки и инструменты в стандартных 96-луночных. Важно отметить, что анализ клеточных ответов сфероидов выполняется в одной и той же пластине с помощью стандартных биохимических анализов и пластины читателей. Простота работы с АТП и приспособляемости подхода к роботизированной обработки жидкого предъявляет высокие поколения пропускная способность как моно-культуры и сотрудничества культуры сфероидов простой лабораторной техники. Этот новый подход будет важным шагом вперед на пути интеграции раковых клеток сфероидов в разработке лекарств и открытий процессов с улучшенными тестирование пропускной способности и экономической эффективности (увеличение числа тестируемых соединений и РедуCED расход реагентов) и эффективность (снижение руки-по времени).
Подробный протокол робота производства раковых клеток сфероидов в 96-луночных планшетах с использованием АТП подход описан ниже. Кроме того, сведения о лекарственной терапии в результате сфероидов и вниз по течению анализа клеточных реакций с использованием коммерческого биохимический анализ представлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение полимерного водного двух системных фазы (ATPS)
- Взвешивание 0,5 г полиэтиленгликоля (ПЭГ) (MW: 35000) и добавить его в 9,5 мл полной среды роста в стерильной 15 мл коническую подготовить 10 мл 5% (вес / объем) водной фазы ПЭГ.
Примечание: Добавление половину среды в коническую первого последующим добавлением полимера, а затем оставшееся количество среды минимизирует адгезию полимера к конической стенки и полимер растворяются быстрее. - Взвешивание 0,128 г декстрана (DEX) (MW: 500 000) и добавить его в 0,872 мл полной среды роста в стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки, чтобы подготовить 1 мл 12,8% (вес / объем) водной фазы DEX.
- Вихревой как растворы в течение примерно 1 мин, чтобы растворить полимеры в среде.
- Держать оба решения на водяной бане при 37 ° С в течение 1 ч, чтобы обеспечить растворение и однородных смесей. Держите выше уровня воды колпачки, чтобы избежать возможности заражения решений из ваннывода.
- Загрузка фазе раствора ПЭГ в стерильный пластиковый шприц, и передать его через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм, чтобы удалить примеси.
Примечание: Заполните шприц с раствором ПЭГ, поместите его на вставке фильтра в верхней части конической трубе и с помощью силы, медленно толкать раствора через фильтр. Это нормально, чтобы испытать устойчивость к движению поршень шприца. Незначительные потери раствора полимера происходит в некоторых раствора останется в фильтре, но концентрация полимера не изменится. - Пипетка 10 мкл DEX фазы раствора и разбавить его в 10 мкл среды в отдельную пробирку, приведет к 6,4% (вес / объем) DEX фазы раствора. Аспирируйте 100 мкл раствора ПЭГ фазы и выдачи его в чашку Петри.
- Не включать 0,5 мкл 6,4% (вес / объем) DEX фазу раствора в фазе раствора ПЭГ. Визуально подтвердить успешное формирование АТП, наблюдая падение DEX под микроскопом. Границе каплидолжен оставаться видимым, указывающий наличие двух стабильных отдельных водных фаз.
- Хранить запас водного ПЭГ и фазовые решения DEX в 4 ° С до использования.
Примечание: Рекомендуется, чтобы полимерные растворы получают свежий перед каждым экспериментом и использовать в течение 24 ч хранения.
2. Подготовка к печати раковых клеток сфероидов
- Растут раковые клетки, представляющие интерес (например, MDA-MB-157 клеток рака молочной железы) до 90% -100% сливной монослоя. Для MDA-MB-157 клеток, используют среду, состоящую из DMEM, содержащей 10% FBS, 1% глутамина и 1% антибиотика.
- Урожай клетки с использованием буфера для диссоциации клеток (в соответствии с протоколом производителя) и загрузки суспензии в 15 мл коническую форму. Центрифуга в течение 5 мин при 173,3 мкг, удалить супернатант, и ресуспендируют клеток в 1 мл полной среды роста.
- Тензодатчики на гемоцитометре и считать их рассчитать необходимое количествоклеток в течение желаемого сфероида плотности клеток. Сливная монослой MDA-MB-157 клетки, выращенные в колбе Т75 обычно дает ~ 7 × 10 6 клеток.
Примечание:. Требуемое плотность клеток для объема капли, чтобы генерировать один сфероид будет зависеть от типа клеток 22 Например, плотность 1,5 х 10 4 или больше для MDA-MB-157 клеток рекомендуется в 0,3 мкл DEX фазы капли, чтобы обеспечить формирование единого сфероида. - Центрифуга клетки во второй раз в течение 5 мин при 173,3 мкг и ресуспендируют их в соответствующем объеме среды роста концентрировать суспензии до желаемой плотности клеток.
Примечание: Например, если были собраны 7 × 10 6 раковых клеток, общий объем клеточной суспензии, необходимой для образования сфероида плотности 1,5 × 10 4 клеток в 0,3 мкл каплей DEX фазы будет 140 мкл. Тем не менее из-за разбавления с DEX фазы раствора в следующей стадии, используют только 70 мкл клеточной культуральной среды для ресуспендирования клеток. - Тщательно перемешать клеточной суспензии, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и смешивание раствора DEX. Пипетированием вверх и вниз должно быть сделано аккуратно, чтобы предотвратить образование пузырьков.
3. Подготовка для печати сокультивировали сфероидов
- Растут раковые клетки (например, MDA-MB-157 рака молочной железы человека клетки) и поддерживающие клетки (например, фибробластов человека) к 90% -100% сливной монослоя. Урожай каждого типа клеток, используя буфер для диссоциации клеток (в соответствии с протоколом производителя).
- Загрузка каждой суспензии в 15 мл коническую отцентрифугированы в течение 5 мин при 173,3 мкг, и аспирации супернатант из каждой конической. Ресуспендируют клеток каждого конуса 1 мл полного гrowth средой.
Примечание: флуоресцентные красители, такие как кальцеина AM (живой пятна клеток) и ядерных красителей (Hoechst) могут быть использованы для различения двух типов клеток.
- Загрузка каждой суспензии в 15 мл коническую отцентрифугированы в течение 5 мин при 173,3 мкг, и аспирации супернатант из каждой конической. Ресуспендируют клеток каждого конуса 1 мл полного гrowth средой.
- Загрузка каждого типа клеток отдельно на гемоцитометра и сосчитать их рассчитать требуемое количество каждого типа клеток на желаемом соотношении раковых клеток, чтобы поддерживать клетки в совместном культивировании сфероидов. Конфлюэнтные монослоя MDA-MB-157 клеток и фибробластов, выращенных в Т75 колбы обычно дают ~ 7 х 10 6 и ~ 6 х 10 6 клеток, соответственно.
- Добавить правильного объема из суспензии опорных клеток к раковым клеткам суспензии дать желаемое соотношение количества двух типов клеток. Например, можно использовать соотношение 50 раковых клеток к 1 фибробластов.
- Центрифуга коническая, содержащий смешанную суспензию клеток течение 5 мин при 173,3 мкг и ресуспендируют клеток в соответствующем объеме, чтобы привести к конечной плотности, состоящий из равных объемов среды для выращивания и 12,8% (вес / объем) водного DEXфазы раствора (полученного в 1,2).
- Осторожно пипетки в результате клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность суспензии.
4. Печать опухолевых сфероидов в 96-луночный планшет
- За день до экспериментов, пальто необработанными с круглым дном 96-луночные планшеты с 1% (масса / объем) Pluronic при 37 ° С в течение 24 ч. Это покрытие предотвращает прикрепление клеток в течение периода культивирования.
- Разлить по 50 мкл фильтрованного 5% (вес / объем) водной фазы ПЭГ в каждую лунку 96-луночного планшета (назначения) пластины.
- С помощью пипетки, смешать клеточной суспензии (полученного на стадии 2 или 3 стадии для моно- и со-культуры, соответственно) и добавить 20 мкл суспензии с любой другой также от одного столбца 384-луночного планшета (источник пластины) ,
- Включите жидкой обработчика и "дома" пипеткой головы зарегистрироваться координаты. Тогда скомпилировать ранее определенный протокол (ниже в 4,6), чтобы обеспечить лабораторное оборудование и параметры определяются правильноLY. Это "наведения" шаг может быть различной для различных жидких обработчиков.
Примечание: поток протокола, как показано шаг за шагом ниже в 4,6, будет одинаковой независимо от обработчика робота жидкости, используемой; Однако, программный интерфейс может отличаться из-за использования различного программного обеспечения. - Поместите исходный пластину, назначения пластину, и пипетки коробки на определенных позициях на станции жидкого обработчик, как показано на рисунке 1.
- Выполнить протокол, который включает в себя следующие шаги:
- Загрузите один столбец баррелей из пипетки главы жидкой обработчика с перемешиванием наконечники (8 TIPS) с рабочей станции (рис 1).
- Смешайте клеточной суспензии в скважинах исходного пластины (рис 1). Выберите смесительную камеру меньше, чем объем клеточной суспензии в лунки, чтобы избежать образования пузырьков.
- Извлеките советы в пустой коробке советы отходов (рисунок 1). Загрузите один столбец баррелей из пипетки голове 10 мкл дозирования наконечники пипеток (Рисунок 1).
- Отберите 0,3 мкл клеточной суспензии из исходного пластины (рис 1) в каждой пипетки.
- Отказаться от клеточной суспензии в лунки одного столбца назначения пластины (рис 1). Использование высоту дозирования 0,5 мм и скорость дозирования потока меньше, чем 1 мкл / сек.
- Повторите этапы 4.6.1 через 4.6.6 до столбца за столбцом печати на всю пластину назначения не будет завершена.
- Осторожно снимите назначения пластину от поверхности рабочей станции, и в местах с повышенной инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2. Поддерживать пластины горизонтально при проведении его в инкубатор, чтобы избежать нарушения фазовых капель DEX, содержащих клетки.
- Инкубируют планшет в течение 24 ч, чтобы позволить агрегацию клеток в сфероида в капле DEX фазы.
Следует отметить, что следующий протокол для 4-дневного лекарственной терапии и включает в себя обновление со свежими препарата в день 2. Это может быть модифицирована для других периодов лечения.
- Визуально подтверждают образование сфероида в 96-луночных планшетах за 24 ч. При необходимости, изображение скважин для измерения размера сфероидов путем усреднения наименьшего и наибольшего диаметра каждого сфероида.
- Подготовка исходного раствора требуемой препарата путем растворения его в растворителе, рекомендованным производителем в заданной концентрации растворимости. Например, растворяются в воде цисплатин в дозе 2 мг / мл.
Примечание: Защита исходного раствора препарата от света, если препарат легко чувствительны к регистру. - С помощью метода серийных разведений, подготовки разбавленные концентрации препарата с клеточной культуральной среды из маточного раствора, полученного на предыдущей стадии. Каждое разведение должно быть в два раза больше желаемой концентрации. ДилКоэффициенты социологическое загрязнение будет варьироваться в зависимости от исходной концентрации акций и желаемой рабочей концентрации.
- Добавить 50 мкл лекарственного раствора, приготовленного на предыдущей стадии, в каждую лунку. Это может быть сделано с помощью робота или вручную пипетки.
Примечание: В каждом концентрация лекарственного средства будет в два раза разбавл до желаемой концентрации в 50 мкл водной фазы ПЭГ уже в каждую лунку.- Использование сфероидов из двух столбцах 96-луночного планшета (N = 16) для каждой концентрации.
- В контрольных лунках, добавить только 50 мкл свежей культуральной средой с существующими 50 мкл водной фазы ПЭГ.
- Инкубируйте сфероидов с препаратом в течение 48 ч при 37 ° С и 5% СО 2, защищенном от света месте.
- После 48 ч инкубации, готовят свежие разведений препарата в нужные концентрации и возобновить препарат путем добавления 50 мкл свежего раствора лекарственного средства в каждую лунку.
Примечание: скважины уже содержат нужной концентрации наркотиков из первого препарата Treatment. Поэтому в данном обновления фазы, каждая концентрация получают в нужной концентрации, так как не произойдет разбавление. - Инкубируйте сфероидов с лекарственным средством в течение еще 48 ч при 37 ° С и 5% СО 2, защищенном от света месте.
6. Анализ жизнеспособности клеток в сфероидов
- После 48 ч инкубации с новой препарата (то есть, общее время обработки сфероидов с лекарственным средством является 4 дней), измерить общий объем среды в один и ручным пипетированием.
Примечание: Типичный объем в одну лунку составляет ~ 140 мкл (небольшое уменьшение происходит за счет испарения). - Рассчитать объем клеточной жизнеспособности реагента (например, PrestoBlue) в концентрации от общего объема а 10%. Добавить объем жизнеспособности клеток реагента в каждую лунку.
Примечание: При существующей объема средств массовой информации 140 мкл в колодец, объем 15,6 мкл обязан дать концентрацию общего 10% хорошо. Это вычисляется путемделения существующего тома СМИ по 9 (140 мкл / 9 = 15,6 мкл). - Инкубируйте планшет с реагентом жизнеспособности клеток добавляют в каждую лунку в течение 6 ч при 37 ° С в защищенном от света.
- Поместите пластину в читателе микро-пластины и читать сигнал флуоресценции на 560 нм и 590 возбуждения нм и эмиссии длин волн, соответственно.
- Вычислить процентное жизнеспособность клеток в сфероидов путем нормализации флуоресцентного сигнала от обработанных скважин в том, что из контрольных лунок после усреднения значений из одних и тех же условий обработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочая станция роботизированного жидкости обработчика показана на рисунке 1. Пипеткой головы и все станции, используемые в робота печати сфероидов в разделе 4.6 помечены. Изображение показывает использование двух различных станций на наконечник коробки (один набор наконечников для смешивания и второго набора для аспирации / дозирования суспензии клеток-водный DEX фазы смеси). Вся установка размещается в стандартном биологической безопасности кабинета для поддержания стерильности. Рисунок 2 изображена схема процесса "печатного" с водной двухфазной системе. Наконечник пипетки загружен клеточной суспензии в водной фазе DEX (голубой, рисунка фаза) опускают в круглым дном лунку 96-луночного планшета, содержащего водную фазу, ПЭГ (розовый, погружение фаза) для выдачи его содержание близко к Нижняя также. Полученный DEX фазы падение ограничивает раковых клеток и стимулирует диспергирующие межклеточных взаимодействий, которые приводят кагрегация клеток и образование сфероида. Сфероид образование спонтанно и происходит в течение 24 ч инкубации, как показано в экспериментальной изображения на фиг.2. На практике это сфероид печати столбец за столбцом выполняется в 96-луночных планшетах. После сфероиды образуют, культуральную среду вновь путем непосредственного добавления свежей среды, преобразование двухфазную систему с одной водной фазы. Этот переход происходит из-за снижения концентрации ПЭГ и DEX ниже пороговой концентрации, необходимой для разделения водных PEG и Декс фаз.
Дозирование от обычного объем воздуха пипетирования механизма жидкой обработчик был оптимизирован параметрически и было обнаружено, что высота дозировка 0,5 мм, со скоростью потока дозировки меньше, чем 1 мкл / сек с последующим дозирования 0,2 мкл предварительно атмосферный объем воздуха производит Наиболее последовательным размер водного DEX падает, и, следовательно, сфероидов. 3а DIS 23 Рисунокиграет распределение диаметра 96 сфероидов из одной пластины со средним диаметром 332 ± 31 мкм. Предыдущий опыт показывает, что такой подход, как правило, порождает сфероидов с 8% -10% стандартной ошибки вокруг среднего диаметра. Рисунок 3b показывает распределение частот диаметром сфероидов одной пластине как показано на рисунке 3а, демонстрируя, что диаметры нормально распределены.
Далее, было показано, потенциал этого подхода для соединения скрининга в стандартных плит и анализа клеточных реакций в тех же 96-луночных, без необходимости передачи сфероидов в новых плит. Фиг.4 показывает зависимое от дозы изучение жизнеспособности MDA -MB-157 молочной железы сфероиды раковых клеток обрабатывали клинического химиотерапевтического препарата, цисплатин. Лекарственное контрольных и обработанных сфероиды инкубировали с коммерческой PrestoBlue реагента (реагента Жизнеспособность клеток). Ферментативно-активные клетки уменьшается РЭАГент и привело к изменению цвета и медиа смещению флуоресцентного сигнала. Сдвиг в сигнале было самым большим с живыми клетками (например, в контрольных сфероидов). Жизнеспособность раковых клеток в сфероидов уменьшается с увеличением концентрации лекарственного средства выше 1 мкМ. Этот тест привело к 50% летальная доза концентрацией наркотиков ЛД50 = 4,67 мкМ.
Этот водный технологии двухфазной системы для 3D культуры позволяет простой производство более реалистичных моделях опухолей из других компонентов сотовой микросреды, такие как поддержка стромальных клеток. Было показано ранее, что в том числе стромальных клеток в 3D культур модулирует рост, пролиферацию, и инвазию раковых клеток. 33-35 в качестве доказательства правильности концепции эксперимент, со-культуры сфероидов были сгенерированы путем объединения MDA-MB-157 молочной железы человека раковые клетки и фибробласты человека в соотношении 50: 1. 36 Перед экспериментами, MDA-MB-157 и фибробластов клетки окрашивалис ядерным красителя (синий) и живых клеток красителя (зеленый), соответственно, чтобы обнаружить клетки в люминесцентных изображений. На рисунке 5а люминесцентные и фазы изображения со-культуры сфероидов с плотностью 1,5 х 10 4 клеток и 50 :. 1 соотношение раковых клеток и фибробластов 5б показывает контрольные сфероидов MDA-MB-157 клетки для сравнения. Такой подход позволит оценить эффект стромальных клеток на различных фенотипов раковых клеток.
Рисунок 1. Liquid Handling платформы. Жидкости обработчик состоит из участков, где канюли для смешивания, дозирования советы, Советы поле отходов, источника пластины и места назначения пластины размещены. Расположение каждой станции определено в протоколе. Канюли для смешивания загружаются один столбец пипетирования головы и используется для смешивания раствора в водной фазе DEX содержащий клеток в исходной пластине. Эти советы должны перерабатываться в коробке советы отходов и дозирования советы вставляются в той же колонке пипетирующего голове. Эти наконечники аспирации 0,3 мкл водной фазы, содержащей DEX клеток из исходного листа и выдачи его в конечном пластины с образованием клеток, содержащих капли фазы DEX течение фазы погружения ПЭГ уже в пункте назначения планшета. Наконец, эти советы также утилизировать в коробке советы отходов, чтобы завершить один цикл печати.
Рисунок 2. Формирование Сфероид. Жидкость обработчика распределяет 0,3 мкл водной фазы DEX (синий), содержащие клетки (зеленый) в скважину, содержащую водный раствор ПЭГ (розовый). Это приводит к формированию сфероида после 24 часов инкубации, как показано на рисунке справа. Масштабная линейка 200 мкм.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Сфероид целостность данных. (А) Распределение диаметра сфероидов измеренных от 96-луночный планшет, каждая точка представляет один сфероид. (Б) распределение частоты диаметров показывает нормальное распределение данных.
Рисунок 4. лекарствами отклика сфероидов. Жизнеспособность клеток в MDA-MB-157 раковых клеток молочной железы сфероидов уменьшается с увеличением концентрации цисплатина в течение 1 нМ-200 мкМ диапазоне. Пунктирная линия сигмовидной подходят к данным жизнеспособности.
Рисунок 5. Сотрудничество Культура Spheroids () Люминесцентная (слева) и фазового контраста (справа) изображения сфероидов MDA-MB-157 клеток рака молочной железы (синий) совместно культивировали с фибробластами (зеленый) на 50: 1. Соотношение. (Б) сфероидов MDA-MB-157 клеток представлены для сравнения. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spheroids представить реалистичную модель, чтобы лучше понять физиологию опухоли и эффективность препарата и полезным инструментом для обнаружения наркотиков против рака. Такие приложения могут извлечь большую пользу из простых методов генерации и обслуживания сфероид, когда требуется только стандартный лабораторное оборудование, жидкие средства обработки и сортировочного оборудования. Использование водного двухфазной системе спонтанно совокупные раковых клеток в пределах капельной фазы позволяет эффективное производство и техническое обслуживание сфероидов с роботами жидких обработчиков, а в месте лечения наркозависимости и конечной точки анализа клеточных реакций с использованием коммерческих реагентов и инструментов. Таким образом, эта технология является важным преимуществом по сравнению с существующими подходами 3D раковых клеток культур и представляет собой скрининга платформу для ускорения открытия новых лекарств.
Создание единых размеров сфероидов в микро-луночного планшета имеет решающее значение для отбора заявок с высокой пропускной способностью, чтобы обеспечить подобную базовой сотовой переменного токаУровень тельности во всех сфероидов. Использование жидких обработчиков с механизмом перемещения воздуха пипетирования, важно, чтобы оптимизировать процесс выдачи через количественной оценки эффекта основных параметров жидкости (обходиться обработки высоту, скорость потока выдачи, и предварительно атмосферный объем воздуха) на дозирования водной фазы DEX , Эта оптимизация позволяет пипетки голову заметают вязкий раствор DEX фазы и раковые клетки в скважины и производить однородные сфероидов. Хотя конкретные величины для этих трех параметров были определены в протоколе для жидкого обработчика СТО Браво, подобный подход должен быть применен при использовании других жидких обработчиков, чтобы определить оптимальные условия раздаточные, которые приводят к последовательной DEX фазы размером капли разливают в фазе погружения ПЭГ. Кроме того, можно использовать 96 подсказки и одновременно печатать сфероидов во все 96 лунок. Это, однако, значительно увеличивает количество клеток, требуемое для заполнения исходный пластину сводные DEX фазы, содержащей клетки. Независимо от выбора столбцам или весь пластинчатые подходы печати, очень важно, чтобы смешать содержимое исходного пластины перед стадией аспирации. Это гарантирует, что плотно суспензию клеток в фазе DEX является однородным и уменьшает вариации в размерах сфероидов.
Некоторые исследования показывают, что раковых клеток сфероиды имитировать несколько ключевых свойств бессосудистых опухолей, таких, как морфология и диффузии ограничений реагентов; следовательно, они представляют собой физиологически соответствующую модель для оценки эффективности новых и традиционных соединений против раковых клеток по сравнению с традиционными культурами монослой клеток. 8,17,18,21,23,37 Показано, что водный двухфазная система подход к производству сфероидов позволяет удобно скрининг наркотиков в одной тарелке, просто путем добавления и обновления лекарственного соединения в требуемых временных точках и автоматизированного скрининга жизнеспособности клеток с использованием стандартного устройства для чтения микро-плиты. Этоявляется одним из основных преимуществ над методами, такими как висит капель, которые требуют передачи сфероидов в стандартной пластины для анализа клеточных ответов к наркотикам. 21 Кроме того, известно, что поддерживающие клетки в опухоли микроокружения и их взаимодействия с раковых клеток вовлечены в различные злокачественные фенотипа раковых клеток. 33-35,38,39 Поэтому способность генерировать Сотрудничество культуры сфероидов рака и стромальных клеток с использованием водной техники двухфазный поможет оценить влияние опорных клеток опухоли микроокружения на ответах рака Клетки для различных методов лечения. Совместное культивирование эксперимент, проведенный в данном исследовании, служит доказательством правильности концепции, что эта технология может успешно генерировать сфероидов, содержащие раковые клетки и стромальных клеток. Будущие исследования будут использовать эту возможность и исследовать отличительные особенности моно- и со-культурных сфероидов, таких как распространение и наркотиков ответов. Кроме того, этоттехнология предлагает платформу для более точно имитировать в естественных условиях опухоли микросреды из других стромальных компонентов в модели опухоли. 40
Таким образом, этот протокол обеспечивает самопроизвольное образование сфероидов в 96-луночных планшетах без использования каких-либо внешних сил. Адаптация техники к роботизированной жидкости обработчика повышает скорость и эффективность производства сфероида в стандартном формате высокой пропускной способности. Совместимость технологии с коммерческой изображений и анализа анализирует платформы позволяет использовать различные инструменты, доступные в академических и промышленных лабораториях. Для будущих приложений, этот протокол позволит упорядочить скрининг наркотиков с культурами 3D клеток рака процедура техники. Кроме того, этот подход может быть легко изменена, чтобы сформировать сфероидов разных размеров, разных типов клеток, различных комбинаций рака и стромальных клеток в совместной культуре сфероидов, и масштабировать до более высокой пропускной микро-луночные планшеты тО дальнейшего ускорения противораковым скрининг наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
