Introduction
Hücre bazlı analizler geliştirme ve yeni bir anti-kanser ilaçların bulunması için önemli bir araç sağlar. 1,2 Tarihsel, kanser hücrelerinin tek tabakalı kültürleri kanser hücrelerinin belirli türlerine karşı aday bileşiklerinin etkinliğini araştırmak üzere istihdam edilmiştir. standart kültür plakaları içinde tek tabakalı kültürler bakım kolaylığı, reaktifler ilave edildikten ticari robotik araçlar ile standart levha uyumluluğu ve kimyasal bileşikler hücresel tepkilerin alt analizi için tarama ekipmanı ile 2D Kültürlerin çekici bir araç kılan en önemli yararlar uyuşturucu testi için. 3 yazık ki, tek tabakalı hücre deneyleri genellikle ilaç geliştirme ve keşif son derece pahalı verme süreci, in vivo bileşiklerin etkinliğini tahmin etmek başarısız. 4,5 ilaç şirketleri ve akademik birimler, sadece ~% 1 önemli yatırım ve çaba rağmen Kanser karşıtı klinik çalışmalarda ilaç onaylanmıştırSon yirmi yıl içinde FDA tarafından. 2B kültürleri ve in vivo olarak kanser hücrelerinin, karmaşık 3 ortamı arasında 6 eşitsizlik tek tabakalı kültürü sistemlerinin önemli bir eksikliktir. 7 Bu nedenle, ortamda tümör hücrelerine karşı Aday bileşiklerin tarama daha yakından benzemektedir 3D tümör çevre roman kemoterapi ilaçlarının gelişimini hızlandırmak olabilir. 8
Kanser hücresi sferoidler, in vitro olarak ilgili bir 3D tümör modeli sunar. 9,10 olan sferoitler hususiyetlerini yapışmayan yüzeylerde ya da dönen bir şişede, sıvı kaplama, mikrofabrike mikro gibi teknikler kullanılarak süspansiyon içinde kanser hücrelerinin kendiliğinden ya da neden olduğu bir montaj ile oluşturan yoğun kümeleri . diziler, mikroakışkanlar ve asılı damla de 11-16 sferoitler geometri ve merkezi bölgeye oksijen, besin ve ilaç bileşiklerinin sınırlı ulaşım dahil olmak üzere katı tümörlerin temel özelliklerini taklit; dolayısıyla, onlar daha yakından uyuşturucu yanıtlayanların yenidentek tabakalı kültürleri ile karşılaştırıldığında katı tümörlerin bir bileşiğe dönüştürülebilir. Bu belirgin yarar rağmen 17-19 sferoidler rutin kanser hücrelerine karşı kimyasal bileşiklerin taranması için kullanılmamaktadır. Piyasada mevcut robotik ve tarama / görüntüleme araçları ile uyumlu bir standart yüksek kapasiteli ortamda üniforma ölçekli spheroidler üreten Zorluk ilaç geliştirme boru hattına sfero kültürünün birleşmesini engellemektedir. Özel malzemeler ve plakalar son zamanlarda bu ihtiyacı gidermek için piyasada mevcut hale gelmiştir rağmen, maliyet düşünceler onların yaygın kullanımını engellemek.
Yeni asılı damla platformu ve mikrofabrike mikro-kuyuları kullanmak yüksek verimlilik tutarlı ölçekli spheroidler üretme yeteneği ile iki önemli teknikler. 13,16,20 Ancak, her iki yaklaşım özel plakaları ve imal pahalı ve uç nokta kullanıcılar için sakıncalı olan cihazlar gerektirir temel araştırma merkezleri ve ilaç sanayi, en büyük ef içindeyeni anti-kanser ilaç keşfi için kale yapılır. Damla plakaları asılı bir son tasarımı ile hücre içeren damla istikrar bazı iyileşmelere rağmen, plakanın sadece her delik hala damla yayılması / birleştirilmesi önlemek için kültür sırasında kullanılır. 16 Bu önemli ölçüde deneysel verim azalır. İlaç ilave ve yenileme kılavuzuna veya robotik pipetle zor ve bu plaka konfigürasyonu gibi plaka okuyucu gibi geleneksel tarama donanımları ile kolayca uyumlu olmadığı için sferoidler biyokimyasal analiz için standart bir plaka aktarılır gerekir. 21 Mikro-kuyuları da yumuşak litografi kullanarak imal Kontrollü boyutu sfero üretimine izin. 13,20 Ancak, standart pipet araçları ile bu platformun uyumsuzluk tek bir tedavi durumu tüm sferoitleri açığa farklı ilaç bileşikleri / konsantrasyonları ile bireysel küremsi tedavi önler. Bu nedenle, bu yöntem için uygun değildirçok sayıda bileşik / konsantrasyonları aynı anda test gerektirir akış bileşik taraması.
Bu engellerin üstesinden gelmek için, standart 96 oyuklu plakalar içinde sürekli boyutlu kanser hücresi sferoitlerin yüksek verimli üretimi için yeni bir teknik geliştirilmiştir. 22,23 yaklaşım polietilen glikol ile bir polimer sulu bir, iki fazlı bir sistem (ATPS) (dayanır faz oluşturucu polimerler PEG) ve dekstran (Dex). 24 ATPSs son hücre micropatterning sağlamak için yeni bir hücre, biyolojik bir dizi uygulamada kullanılabilir ve son derece sulu ortam içinde hücrelerin biyolojik tepkin maddelerin sağlanmasını lokalize edilmiştir. 25-32 bir oluşturmak küremsi, kanser hücreleri, sulu deksmedetomidin faz ve elde edilen süspansiyon bir alt mikrolitre damla karıştırılır iyi olarak ihtiva eden daldırma sulu PEG faz çözeltisi içine pipetlenir. damlası sfero oluşumunu kolaylaştırmak için daldırma aşaması sınırladığını hücrelerden karışmayan kalır. İthortantly yüksek sulu daldırma aşaması sfero hücrelerine besin sağlar ve ortam osmolalitesinin değişiklikler ve ilaç konsantrasyonlarının dalgalanmalara neden olur başka deneyler için ortak ortam buharlaştırma ile bilinen bir sorun en aza indirir. Bu teknik, küremsi üretim ve yalnızca standart 96 oyuklu plakalar içinde ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve pipetleme araçlarını kullanarak ilaç tedavisi sağlar. Önemli bir şekilde, küremsilerin hücresel tepkilerin analizi standart biyokimyasal tahlilleri ve plaka okuyucu kullanarak aynı plakada gerçekleştirilir. Robotik sıvı taşıma yaklaşım ATP ve adaptasyon ile çalışma kolaylığı mono-kültür ve ko-kültür hem de yüksek verim nesil basit bir laboratuar tekniği sferoitlerin yapar. Bu yeni yaklaşım, geliştirilmiş test hacmi ve test bileşiklerin ve Redu artan sayıda maliyet-etkililik (ilaç geliştirme ve keşif süreçlerine kanser hücresi sferoitlerin entegrasyonu yönünde atılmış büyük bir adım olacakCED reaktif tüketimi) ve verimlilik (zaman eller azaltıcı).
ATPS yaklaşım kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde kanser hücresi sferoitlerin robot üretimi için ayrıntılı bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir. Buna ek olarak, sonuçta elde edilen sferoitlerin ve ticari bir biyokimyasal analizi kullanılarak hücresel tepkilerin alt analizi ilaç tedavisi ayrıntıları sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Polimer sulu iki fazlı bir sistem 1. Hazırlama (ATPS)
- Polietilen glikol (PEG) (MW 35,000) ve 0.5 g tartılır ve sulu faz, PEG (w / v)% 5, 10 ml hazırlamak için, steril bir 15 ml konik tam büyüme ortamı 9,5 ml ekleyin.
Not: İlk polimer ekleyerek ve ardından konik orta yarısını eklenmesi sonra orta kalan miktarı konik duvarlara polimerin yapışmasını en aza indirir ve polimer daha hızlı çözülür yardımcı olur. - Dekstran (Dex) ve 0.128 g (MW 500,000) tartılır ve% 12.8 (w / v) sulu bir DEX faz 1 ml hazırlamak için, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tam büyüme ortamı 0.872 ml ekleyin.
- Yaklaşık 1 dakika vorteksleyin, her iki çözelti ortam içinde polimerlerin çözünmesi için.
- Bir çözünme ve karışımın homojen bir karışım sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içinde, her iki çözüm tutun. Banyosundan çözümler bulaşma olasılığını önlemek için su seviyesinin üzerinde kapaklarını tutmaksu.
- Steril, plastik şırıngaya PEG fazlı bir çözelti yükleyin ve yabancı maddelerin çıkarılması için 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresinden geçirilir.
Yavaş yavaş filtre ile çözüm itmek, PEG çözeltisi ile şırınga doldurun bir konik tüpün üst ve kuvvet kullanarak filtre ekleme yerleştirin: Not. Bu enjektör pistonunun hareketine karşı direnç olması normaldir. Çözeltisinin bir kısmının filtre kalır, ancak polimer konsantrasyonu değişmez olarak polimer çözeltisinin küçük kaybı oluşur. - Pipet 10 DEX faz çözeltisi ul ve ayrı bir tüp içinde ortamdan 10 ul seyreltilmesi% 6.4 (ağırlık / hacim) deksmedetomidin fazlı bir çözelti ile sonuçlandırılabilir. Aspire 100, PEG faz çözeltisi ul bir Petri çanağı içine dağıtın.
- PEG faz çözeltisi içine deksmedetomidin faz çözeltisi (ağırlık / hacim)% 6.4, 0.5 ul koyun. Görme mikroskop altında DEX damla gözlemleyerek başarılı ATPS oluşumunu onaylayın. damla sınıriki sabit, ayrı sulu fazın varlığına işaret eden görülebilir kalmalıdır.
- Kullanana kadar 4 ° C stok sulu PEG ve DEX faz çözümleri saklayın.
Not: Polimer solüsyonları, önceki her bir deney için taze olarak hazırlanmıştır ve depolama, 24 saat içinde kullanılması önerilmektedir.
Baskı Kanseri Hücre küremsilerin 2. Hazırlık
- % 90 -100% konfluent tek tabaka için de (örneğin, MDA-MB-157 göğüs kanseri hücre) kanser hücrelerinin büyütün. MDA-MB-157 hücreleri için, DMEM,% 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 antibiyotik içeren oluşan bir ortamı kullanmaktadır.
- (Üreticinin protokolüne göre) ve 15 ml konik bir süspansiyon yük hücre ayırma tamponu kullanılarak hasat hücreleri. , 173.3 x g'de 5 dakika için santrifüj süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon hücreleri tam büyüme ortamı, 1 ml.
- Yük hücreleri bir hemositometrede üzerine ve onları saymak gerekli sayısını hesaplamak içinistenen bir küremsi hücre yoğunluğu için hücre. T75 şişesi içinde yetiştirilen, MDA-MB-157 hücrelerinin konfluent tek tabaka genellikle ~ 7 x 10 6 hücre sağlar.
Not:. 1.5 x 10 4 veya MDA-MB-157 hücreleri için daha büyük bir damla hacmi için gerekli hücre yoğunluğu, bir tek küremsi hücre tipine bağlı olacaktır oluşturmak için örneğin 22, bir yoğunluk için 0.3 ul deksmedetomidin faz damla başına önerilir Tek bir sfero oluşumunu sağlamak. - 173.3 x g'de 5 dakika boyunca ikinci bir kez santrifüj hücreleri ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna kadar süspansiyon konsantre büyüme ortamı, uygun hacimde bunları yeniden süspanse edin.
Not: 7 x 10 6 kanser hücreleri hasat edilmiştir, örneğin, bir 0.3 ul deksmedetomidin faz damla 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğunun bir küremsi oluşturulması için gerekli olan hücre süspansiyonu, toplam hacmi 140 | il olacaktır. Bununla birlikte bağlı bir sonraki aşamada deksmedetomidin faz çözeltisi ile seyreltme ile, sadece hücreler tekrar süspansiyon hücre kültür ortamı, 70 ul kullanın. - İyice hücreleri ve deksmedetomidin çözeltisi karıştırma homojen dağılımını sağlamak için bir hücre süspansiyonu karıştırılır. Pipetleme yukarı ve aşağı kabarcık oluşmasmı önlemek üzere yavaşça yapılması gerekmektedir.
Eş-kültür küremsi Baskı için 3. Hazırlık
- Büyüme kanser hücreleri (örneğin, MDA-MB-157 insan meme kanseri hücreleri) ve 90% -100% konfluent tek tabaka destek hücreler (örneğin, insan fibroblastları). (Üreticinin protokolüne göre) bir hücre ayırma tamponu kullanılarak, her hücre türü hasat edilir.
- Her konik 5 173.3 xg'de dakika ve aspire süpernatant onları santrifüj, 15 ml konik içine her süspansiyon yükleyin. Tam g, 1 ml her bir konik hücreleri tekrarrowth ortamı.
Not: Calcein AM (canlı hücre lekesiz) ve nükleer boya (Hoechst) gibi floresan boyalar iki hücre tipleri ayırt etmek için kullanılabilir.
- Her konik 5 173.3 xg'de dakika ve aspire süpernatant onları santrifüj, 15 ml konik içine her süspansiyon yükleyin. Tam g, 1 ml her bir konik hücreleri tekrarrowth ortamı.
- Bir hemasitometre üzerinde ayrı ayrı hücre tipi yükleyin ve ko-kültür sferoitler hücreleri desteklemek için kanser hücrelerinin arzu edilen bir oran için, her hücre türü için gerekli sayısını hesaplamak için say. T75 şişeleri içinde yetiştirilen Konfluent, MDA-MB-157 hücrelerinin tek tabakaları ve fibroblast genellikle, sırası ile, yaklaşık 7 x 10 6 ve ~ 6 x 10 6 hücreleri vermek.
- Iki hücre türünün sayısının istenilen oranı verecek şekilde kanser hücreleri süspansiyonuna hücrelerdeki durdurulması- doğru hacim. Örneğin, 1 fibroblast hücre 50 kanser hücreleri oranı kullanılır.
- Santrifüj, uygun bir hacim içinde 173.3 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri, 5 dakika boyunca karıştırılmış bir hücre süspansiyonu ihtiva eden konik sulu deksmedetomidin (w / v) eşit bir büyüme ortamı hacmi ve% 12.8 içeren son yoğunluğuna sonuçlandığı(1.2 hazırlandı) fazlı çözelti.
- Yavaşça süspansiyon homojenliği sağlamak için yukarı ve aşağı ortaya çıkan hücre süspansiyonu pipetle.
96 oyuklu bir plaka içerisine Tümör sferoitlerin 4. Baskı
- Bir gün önce deneyler için,% 1 kat muamele edilmemiş, yuvarlak dipli 96 oyuklu plakalar, 24 saat boyunca 37 ° C 'de (w / v) Pluronik. Bu kaplama, kültür süresi boyunca, hücre yapışmasını önler.
- Süzüldü% 5, 50 ul koyun 96 oyuklu bir plaka (hedef plaka) her bir oyuğuna, sulu PEG faz (a / h).
- Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu karışımı (aşama 2 veya sırasıyla mono ve ko-kültür, Aşama 3'te hazırlanan) ve 384 oyuklu plakanın bir kolonu (kaynak plaka) ile ilgili de her süspansiyonun 20 ul .
- Sıvı işleyici ve "ev" koordinatlarını kaydetmek için pipet kafa açın. Ardından laboratuar aletlerinin sağlamak için (4.6 aşağıda) önceden tanımlanmış protokol derlemek ve parametreleri doğru tanımlanırly. Bu "güdümlü" bir adım, farklı sıvı işleyicileri için farklı olabilir.
Not: protokol akışı, adım-adım aşağıda 4.6 olarak, ne olursa olsun kullanılan robotik sıvı işleyici benzer olacaktır gösterilmiştir; Ancak, programlama arayüzü sayesinde farklı yazılım kullanımı farklı görünebilir. - Şekil 1'de gösterildiği gibi sıvı işleyici iş istasyonunda belirlenen pozisyonlarda kaynak plaka, plaka hedef ve pipet ucu kutuları yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları içeren protokolü yürütün:
- Yük istasyonunda (Şekil 1) den pipet uçları (8 ipuçları) karıştırma sıvı işleyici pipet kafasından varil bir sütun.
- Kaynak plaka (Şekil 1), oyuklarında hücre süspansiyonu karıştırılır. Kabarcık oluşumunu önlemek için kuyular hücre süspansiyonu hacmi daha küçük bir karıştırma birimi seçin.
- Boş bir atık ipuçları kutusu (Şekil 1) içine ipuçlarını çıkarın. Yük 10 ul dağıtım pipet uçları ile pipet kafasından varil bir sütun (Şekil 1).
- Her bir kaynağı havalandır pipet içine kaynak plaka hücre süspansiyonunun 0.3 ul (Şekil 1).
- Hedef plakanın bir kolonu (şekil 1) ve kuyu içine bir hücre süspansiyonu koyun. 0.5 mm'lik bir dağıtıcı yüksekliği ve 1'den küçük ul / sn bir dağıtıcı akış hızı kullanın.
- Tüm hedef plakasına kolon-by-kolonu baskı tamamlanana kadar tekrarlayın 4.6.6 ile 4.6.1 adımları.
- Dikkatle iş istasyonu yüzeyinden hedef plaka kaldırmak ve CO 2 37 ° C'de nemli inkübatör yerleştirin ve% 5. Hücreleri içeren DEX faz damlalarının bozmamak için kuvöz içine taşırken plaka yatay koruyun.
- Deksmedetomidin faz damla içinde bir küremsi, hücrelerin toplanmasını sağlamak için 24 saat boyunca plaka inkübe edin.
Aşağıdaki protokol 4 gün ilaç tedavisi ve diğer tedavi dönemleri için modifiye edilebilir günden sonra 2. taze ilaç ile bir yenileme içerdiğini unutmayın.
- Görsel olarak, 24 saat sonra, 96 gözlü plakalar içinde küremsi oluşumu teyit edilmiştir. Her sfero küçük ve en büyük çap ortalamasını alarak küremsilerin boyutunun ölçülmesi için görüntü kuyu Gerekirse.
- Önceden tespit edilmiş bir çözünürlük konsantrasyonda üretici tarafından tavsiye edilen bir solvent içinde eritilmesi ile arzu edilen bir ilacın stok çözelti hazırlayın. Örneğin, mi, 2 mg / su içinde sisplatin çözülür.
Not: İlaç ışığa duyarlı ise ışıktan ilacın stok solüsyonu koruyun. - Seri seyreltme tekniği kullanarak, önceki aşamada hazırlanmış olan stok çözeltisinden hücre kültür ortamı ile sulandırılmış ilaç konsantrasyonları hazırlamak. Her bir seyreltme iki kez, istenen konsantrasyon yapılmalıdır. DilKatkı oranları başlangıç stok konsantrasyonuna bağlı olarak değişir ve çalışma konsantrasyonlarını arzu edecektir.
- Her bir oyuğa, önceki aşamada hazırlanan ilaç solüsyonu 50 ul ekle. Bu robot veya manuel pipetleme yapılabilir.
Not: her bir ilaç konsantrasyonu, her yuva içinde daha önce 50 ul sulu bir PEG faz ile istenen konsantrasyona devre seyreltilir.- Her bir konsantrasyon için, 96-çukurlu bir tablaya (n = 16) iki adet sütun sferoidler kullanın.
- Kontrol kuyuları olarak, sulu bir PEG fazın mevcut 50 ul taze kültür ortamı 50 ul ekle.
- Işıksız bir ortamda 37 ° C'de 48 saat% 5 CO2 için ilaç ile sferoidler inkübe edin.
- Inkübasyondan 48 saat sonra, arzu edilen konsantrasyonlarda ilacın taze dilüsyonları hazırlanması ve her bir oyuğa taze ilaç çözeltisinin 50 ul ekleyerek ilaç yeniler.
Not: kuyular zaten ilk ilaç t istenen ilaç konsantrasyonu içerirreatment. Seyreltme ortaya çıkar çünkü Bu nedenle, bu yenileme evresinde, her bir konsantrasyonu, arzu edilen bir konsantrasyonda hazırlanır. - Işıksız bir ortamda 37 ° C'de başka bir 48 saat süre ile ilaç ve% 5 CO2 ile sferoidler inkübe edin.
6. küresellerde hücresel viabileteyi analizi
- Yenilenen ilaç (örneğin, bir ilaç ile küremsilerin toplam tedavi süresi 4 gün) ile inkübasyondan ve 48 saat sonra iyi kılavuzlarını pipetleme ile bir ortamın toplam hacmini ölçün.
Not: Bir kuyuda tipik hacmi 140 ul (küçük bir düşüş buharlaşma nedeniyle oluşur) ~ olduğunu. - Toplam oyuk hacmi içinde% 10 konsantrasyonda hücre canlılığı reaktifi (örneğin, PrestoBlue) hacminin hesaplayın. Her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi bu hacim.
Not: iyi olarak 140 ul olan bir ortam hacmi ile, 15.6 ul bir hacim de, toplam% 10'luk bir konsantrasyon vermek için gereklidir. Bu hesaplanır9 (140 ul / 9 = 15.6 ul) mevcut medya hacmine bölünmesi. - Işıksız bir ortamda 37 ° C 'de 6 saat süre ile her bir göze ilave hücre canlılığı maddesi ile plaka inkübe edin.
- Bir mikro-plaka okuyucusu içinde plakayı ve sırasıyla 560 nm ve 590 nm'lik eksitasyon ve emisyon dalga boyunda floresan sinyalini okur.
- Aynı muamele şartlarından değerlerinin ortalaması sonra kontrol kuyularının edilene işlenmiş olan gözeneklerden elde floresan sinyali normalize edilmesi ile küremsi hücrelerin yüzde canlılığı hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Robotik sıvı işleyici iş istasyonu. Şekil 1'de gösterildiği pipetleme baş ve bölüm 4.6 sferoidlerinin robotik baskıda kullanılan tüm istasyonlar etiketli edilir. Görüntü ucu kutuları için iki farklı istasyonda (bir karıştırma ipuçları grubu ve hücre süspansiyonu sulu deksmedetomidin faz karışımının / dağıtılmasını emilmesi için ikinci kümesinin) kullanımını göstermektedir. tüm kurulum kısırlık korumak için bir standart biyolojik güvenlik kabini içinde yer almaktadır. 2 sulu iki-fazlı sistemi ile "baskı" sürecinin bir şematik tasvir Şekil. Sulu faz deksmedetomidin (mavi, model verme safhası) hücre süspansiyonu ile yüklü bir pipet ucu yakın içeriği dağıtmak için sulu PEG fazı (pembe, daldırma faz) ihtiva eden bir 96-yuvalı plakanın bir yuvarlak tabanlı bir kuyunun içine indirilir kuyu alt. Elde DEX faz açılan dağıtma kanser hücrelerini kısıtlar ve neden hücre-hücre etkileşimleri teşvikhücre ve küremsi oluşumu birikmesi de bulunmaktadır. Küremsi formasyonu kendiliğinden ve Şekil 2'nin deneysel resimde görüldüğü gibi kuluçkalama, 24 saat içinde gerçekleşir. Pratik olarak bu küremsi baskı, 96 oyuklu plakalar içinde kolonu ile bir kolon-gerçekleştirilir. Parçacıklarının formu sonra, kültür ortamı, tek bir sulu faz, iki fazlı bir sistem dönüştürme, taze ortam ilave edilerek doğrudan yenilenir. Bu geçiş, sulu PEG ve deksmedetomidin fazların ayrılması için gerekli bir eşik konsantrasyonlarının altında PEG konsantrasyonlarda azaltılması ve deksmedetomidin kaynaklanmaktadır.
Sıvı tutucu geleneksel bir hava ikame pipetleme mekanizmasından dağıtıcı parametrik optimize edildi ve, bulunmuştur ki, 0.5 mm, önceden emilen hava hacmi üretmektedir 0.2 ul tevzi ardından daha küçük, 1 ul / sn bir dağıtıcı akış oranında bir dağıtıcı yüksekliği Sulu DEX en tutarlı boyutu düşer ve dolayısıyla sferoidler. 23 Şekil 3a dis332 ± 31 um arasında bir ortalama çapa sahip bir plaka 96 küremsilerin çapı dağılımı oynar. Önceki deneyimler bu yaklaşımın tipik ortalama çapı yaklaşık 8% -10% standart hata ile sferoitleri üretir olduğunu göstermektedir. 3b çapları normal dağılım olduğunu gösteren, Şekil 3a aynı plaka sferoitlerin çapı frekans dağılımını göstermektedir.
Daha sonra, yeni plakalara sferoidler aktarmak için bir gerek olmadan, standart 96 oyuklu plakalar, aynı plakalar içinde hücresel tepkilerin analizi Bileşik elemesi için bu yaklaşımın potansiyel olduğu gösterilmiştir. Şekil 4, MDA canlılığı, doza bağımlı bir çalışma göstermektedir -MB-157 göğüs kanseri hücre sferoidler klinik kemoterapötik ilaç, sisplatin ile işlemden geçirildi. İlaç ile tedavi edilen ve kontrol sferoidler ticari PrestoBlue reaktifi (hücre canlılığı reaktifi) ile inkübe edildi. Enzimatik olarak aktif hücrelerin rea azaltılmışgent ve ortam renk değişikliğine ve flüoresan sinyalinde bir değişime yol açtı. sinyal kayması canlı hücreler (örneğin, kontrol küremsilerde) ile en büyüktü. sferoitler kanser hücrelerinin yaşayabilirliği 1 uM üzerinde ise artan ilaç konsantrasyonu ile birlikte azalmıştır. Bu test, LD50 = 4.67 uM bir% 50 oranında ölümcül bir doz ilaç konsantrasyonu ile sonuçlanmıştır.
3D kültür Bu sulu iki-fazlı sistem teknolojisi, stromal hücreler destek gibi hücresel mikroçevrelerde diğer bileşenler de dahil olmak üzere daha gerçekçi tümör modellerinin basit üretimine olanak tanır. 3D kültürlerde stromal hücreler de dahil olmak üzere daha önce gösterilmiştir MDA-MB-157 insan meme birleştirerek oluşturulan bir kanıtı-of-concept deneyi, ko-kültür sferoidler olarak büyümesini, çoğalmasını ve kanser hücrelerinin işgali. 33-35 modüle 50 arasında bir oranda, kanser hücreleri ve insan fibroblastlarının:. 1 36 Deneylerden önce, MDA-MB-157 ve fibroblast hücreleri lekelinükleer boya (mavi) ve canlı hücre boya (yeşil), sırasıyla, floresan görüntü hücrelerin saptanmasını sağlamak için. Şekil 5a, 1.5 x 10 4 hücre olan bir yoğunlukta bir 50 ile ko-kültür parçacıkları arasında floresan ve faz görüntüler gösterir :., kanser hücreleri ve fibroblastlar 1 oranında Şekil 5b, karşılaştırma için, MDA-MB-157 hücrelerinin kontrol sferoidler gösterir. Bu yaklaşım, kanser hücrelerinin çeşitli fenotipleri üzerine stromal hücrelerin etkisini değerlendiren sağlayacaktır.
Şekil 1. Sıvı Taşıma Platformu. Sıvı işleyicisi ipuçları karıştırma istasyonları, dağıtım ipuçları, atık ipuçları kutusunda, kaynak plakadan oluşur ve hedef plaka yerleri yerleştirilir. Her bir istasyon konumu protokolü tanımlanır. Karıştırma uçları pipetleme başın bir kolon üzerine yüklendi ve sulu deksmedetomidin fazın çözelti karıştırmak için kullanılan kaynak plakası hücreleri ihtiva etmektedir. Bu ipuçları daha sonra atık ipuçları kutusuna atılmaktadır ve dağıtım ipuçları pipetleme başın aynı kolona eklenir. Bu ipuçları, kaynak plaka hücreleri içeren sulu DEX faz 0.3 ul aspire ve hedef plaka kuyularda zaten daldırma PEG faz içinde DEX faz hücre içeren damla oluşturmak için hedef plakası içine dağıtmak. Sonunda bu ipuçları da baskı bir döngüsünü tamamlamak için atık ipuçları kutusuna atılmaktadır.
Şekil 2. Sferoid Formasyonu. Sıvı işleyicisi iyi sulu PEG çözeltisi içeren (pembe) içine sulu DEX faz (mavi) hücreleri (yeşil) içeren 0.3 ul dağıtır. Sağ resimde gösterildiği gibi kuluçkalama, 24 saat sonra bir sferoit olması ile oluşumu ile sonuçlanır. Ölçek çubuğu 200 um.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3. Sferoid Tutarlılık Veri., 96 oyuklu bir plaka ölçülen küremsilerin çapı (a) dağılımı, her bir nokta bir sfero temsil eder. (B) çaplarda Frekans dağılımı verilerinin normal dağılım göstermektedir.
Küremsilerin Şekil 4. İlaç Tepki. MDA-MB-157 göğüs kanseri hücre küremsi gözdeki hücrelerin sağ kalabilirliği 1 nM-200 uM aralığında sisplatin konsantrasyonundaki artış ile birlikte azalır. kesikli çizgi canlılık verilerine bir sigmoid seçimdir.
Şekil 5. Ortak-kültür sferoitler hususiyetlerini: (a) Floresan (sol) ve faz kontrastlı bir küremsi (sağ) görüntüler, MDA-MB-157 göğüs kanseri hücreleri (mavi) birlikte kültürlenmiş bir 50 fibroblastlar (yeşil) ile:. 1 oranı. MDA-MB-157 hücrelerinin (b) 'sferoitlerin karşılaştırma için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sferoidler iyi tümör fizyolojisini ve ilaç etkinliğini anlamak ve anti-kanser ilaç keşfi için yararlı bir araç sağlamak için gerçekçi bir modeli sunuyoruz. Bu tür uygulamalar büyük ölçüde yalnızca standart laboratuar aletlerinin, sıvı taşıma araçları ve tarama ekipmanı gerektirmeyen basit sfero üretimi ve bakım teknikleri yararlanacak. sulu iki-fazlı sistemde açılan faz içinde kendiliğinden agrega kanser hücrelerinin kullanılması verimli üretim ve robotik sıvı işleyicilerle sferoitlerin bakım ve yerinde ilaç tedavisi ve ticari reaktif ve araçları ile hücresel yanıtların son nokta analizinde izin verir. Böylece, bu teknoloji büyük bir avantaj 3D kanser hücre kültürleri mevcut yaklaşımlar üzerinde ve ilaç keşfi hızlandırmak için bir tarama platformu sunuyor.
Bir mikro-plaka içinde muntazam boyutlu sferoitleri Yaratma benzer bazal hücre ac sağlamak için, yüksek kapasiteli tarama uygulamaları için önemlidirTüm küremsilerde bilirlik seviyesi. Bir hava çıkarma pipetleme mekanizması ile sıvı işleyici kullanarak, sulu bir DEX fazının dağıtma anahtar sıvı kullanım parametreleri (Ön emilen hava hacmi, yükseklik dağıtmak akış hızı dağıtmak ve benzeri) etkisinin ölçümü ile dağıtma işlemini optimize etmek için önemlidir . Bu optimizasyon pipetleme kafa kuyulara viskoz DEX faz çözümü ve kanser hücrelerini dışarı süpürme ve homojen sferoidler üretmek için izin verir. Bu üç parametre için özel miktarlarda SRT Bravo sıvı işleyici için protokol tespit edilmiş olmasına rağmen, benzer bir yaklaşım, daldırma, PEG faza dağıtıldığı tutarlı deksmedetomidin faz damla boyutu neden uygun dağıtma koşulları belirlemek için diğer sıvı işleyicileri kullanılması gerekmektedir. Buna ek olarak, 96 ucun kullanılabilmesi ve aynı zamanda 96 kuyu içine sferoidler baskı yapmak mümkündür. Bu ancak anlamlı olan kaynak plaka doldurmak için gerekli hücrelerin sayısını artırırSulu deksmedetomidin faz ihtiva eden hücreler. Ne olursa olsun kolon-bilge ya da tam plaka baskı yaklaşımları seçme, bu aspirasyon aşamasından önce kaynak plakasının içeriği karıştırmak için çok önemlidir. Bu deksmedetomidin fazda yoğun hücre süspansiyonu homojen hale ve parçacıklarının büyüklüğü değişiklikleri azaltır sağlar.
Çeşitli çalışmalar, kanser hücresi sferoidler gibi reaktiflerin morfolojisi ve difüzyon sınırlamaları gibi avasküler tümörlerin birkaç anahtar özelliklerini taklit olduğunu göstermektedir; bu nedenle, geleneksel tek tabakalı hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında kanser hücrelerine karşı yeni ve bilinen bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için, fizyolojik olarak uygun bir model sunmaktadır. 8,17,18,21,23,37 Bu belgede, üretim için sulu iki-fazlı bir sistem yaklaşımı Küresel şekiller, uygun sadece ilavesi ve istenen zaman noktalarında bir ilaç bileşiğinin yenilenmesi ve standart bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak hücre canlılığı otomatik tarama ile aynı plakada ilaç tarama sağlar. Buörneğin, kanser hücreleri ile tümör mikro-hücreleri desteklemek ve bunların etkileşimlerinin rol oynadığı bilinmektedir ilaçlara hücresel tepkilerin analizi için standart bir plaka küremsilerin transfer gerektirir. Ayrıca 21 asılı damla gibi tekniklere kıyasla önemli bir avantajdır Sulu, iki faz teknolojisini kullanarak, çeşitli kötü huylu Bu nedenle, kanser hücreleri fenotipleri. 33-35,38,39 kanser ko-kültür sferoidler oluşturma yeteneği ve stromal hücrelerin kanser cevaplara tümörün mikro hücrelerinin destek etkisini değerlendirmek yardımcı olur Çeşitli tedavilere hücreler. Bu çalışmada yapılan ko-kültür deney bu teknoloji başarıyla kanser hücrelerini ve stromal hücreler içeren sferoitleri üretebilir bir kanıtı-of-concept olarak hizmet vermektedir. Gelecek çalışmalar bu yeteneği koşum ve çoğalması ve ilaç yanıtları gibi mono ve ko-kültür sferoitlerin diferansiyel özelliklerinin araştırılması olacaktır. Buna ek olarak, buteknoloji daha yakından tümör modelinde diğer stromal bileşenleri dahil ederek in vivo tümör mikro taklit bir platform sunuyor. 40
Özet olarak, bu protokol, herhangi bir dış kuvvetleri kullanılmadan, 96 oyuklu plakalar içinde sferoitlerin kendiliğinden oluşmasını sağlar. Bir robot sıvı işleyici tekniği uyarlanması standart yüksek verim formatında hız ve sfero üretiminin verimliliğini artırır. Ticari görüntüleme ve tahlil ile teknolojinin uyumluluğu akademik ve endüstriyel laboratuvarlarda mevcut farklı enstrümanlar kullanılarak sağlar platformlar analiz eder. Gelecekteki uygulamalar için, bu protokol 3D kanser hücre kültürleri bir rutin tekniği ile uyuşturucu taraması düzene olacaktır. Buna ek olarak, bu yaklaşım kolayca farklı boyutları, farklı hücre tipleri, ko-kültür sferoitler kanser ve stromal hücrelerin farklı kombinasyonları sferoidler oluşturmak üzere modifiye edilebilir, ve daha yüksek verim, mikro-yuvalı plakalar t kadar ölçeklendirilebiliro daha anti-kanser ilaç taraması hızlandırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
