Introduction
Celgebaseerde proeven een belangrijk instrument voor de ontwikkeling en ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker. 1,2 Historisch monolayer kweken van kankercellen zijn gebruikt om de werkzaamheid van kandidaat verbindingen tegen specifieke soorten kankercellen te onderzoeken. De onderhoudsvriendelijkheid van monolaagkweken in standaard kweekplaten, de verenigbaarheid van standaard platen met commerciële robotachtige hulpmiddelen voor toevoeging van reagentia en Screening materieel downstream analyse van de cellulaire responsen op chemische verbindingen zijn belangrijke voordelen die 2D culturen render aantrekkelijk instrument voor drug testen. 3 Helaas monolaag cel assays vaak niet de werkzaamheid van de verbindingen in vivo te voorspellen, waardoor ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen een uiterst kostbaar proces. 4,5 Ondanks aanzienlijke investeringen en inspanningen van farmaceutische bedrijven en academische eenheden slechts ~ 1% van anti-kanker medicijnen in klinische studies werden goedgekeurddoor de FDA in de afgelopen twee decennia. 6 ongelijkheid tussen 2D culturen en complexe 3D omgeving van kankercellen in vivo een belangrijke tekortkoming van monolaag kweeksystemen. 7 Daarom screenen van kandidaatverbindingen tegen tumorcellen in een omgeving die meer lijkt de 3D-tumor-omgeving kan de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor chemotherapie te versnellen. 8
Kankercel sferoïden vormen een relevante 3D tumormodel in vitro. 9,10 sferoïden zijn compacte clusters die door spontane of geïnduceerde samenstel van kankercellen op niet-klevende oppervlakken of in suspensie met technieken als spinner kolf, vloeibare bedekking, microfabricated micro- vormen . goed arrays, microfluidics en opknoping druppels 11-16 sferoïden bootsen hoofdkenmerken van solide tumoren zoals geometrie en beperkte transport van zuurstof, voedingsstoffen en geneesmiddelverbindingen in de centrale zone; vandaar, ze nauwer regenereren drug verantse van vaste tumoren ten opzichte van monolayer kweken. 17-19 Desondanks duidelijke voordeel, sferoïden worden niet routinematig gebruikt voor het screenen van chemische verbindingen tegen kankercellen. Moeilijkheid van het produceren van een uniforme en kleinbedrijf bolletjes in een standaard high throughput instelling die compatibel zijn met de handel verkrijgbare robotica en screening / imaging-tools is belemmert integratie van spheroïde cultuur in de ontwikkeling van geneesmiddelen pijplijn. Hoewel de aangepaste materialen en borden onlangs commercieel beschikbaar zijn geraakt aan deze behoefte te voorzien, kostenoverwegingen afschrikken hun wijdverbreide gebruik.
Twee belangrijke technieken met het vermogen van de productie consistente en kleinbedrijf sferoiden in high throughput gebruik maken van een nieuwe hangende druppel platform en microfabricated microputjes. 13,16,20 Echter, beide benaderingen vereisen speciale borden en apparaten die duur om te fabriceren en onhandig voor de eindgebruikers zijn in de kern van onderzoekscentra en de farmaceutische industrie, waar de meeste grote efforten voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker worden gemaakt. Ondanks enkele verbeteringen in de stabiliteit van-cel met druppels met een recente ontwerp van opknoping druppel platen, wordt slechts om de andere gat van de plaat nog steeds gebruikt tijdens de cultuur te verspreiden / samenvoegen van druppels te vermijden. 16 Dit vermindert aanzienlijk experimentele doorzet. Drugsverslaving en vernieuwing is moeilijk met manuele of gerobotiseerde pipetteren en spheroids moet in een standaard plaat voor biochemische analyse over te dragen, omdat deze plaat configuratie is niet gemakkelijk compatibel met conventionele screening apparatuur zoals plaat lezers. 21 Micro-putten vervaardigd met behulp van zachte lithografie ook toestaan gecontroleerde grootte spheroïde productie. 13,20 Echter, onverenigbaarheid van dit platform met standaard pipetteren gereedschap voorkomt het behandelen van individuele bolletjes met verschillende drug verbindingen / concentraties, het blootstellen van alle bolletjes op een enkele behandeling staat. Aldus is deze methode niet geschikt voor highthroughput screening verbinding die gelijktijdig testen van verschillende verbindingen / concentraties vereist.
Om deze obstakels te overwinnen, is een nieuwe techniek voor hoge doorvoer productie van gelijkvormige kankercel sferoïden in standaard 96-well platen ontwikkeld. 22,23 De aanpak is gebaseerd op een polymeer waterige tweefasensysteem (ATPS) en polyethyleen glycol ( PEG) en dextran (DEX) als fase-vormende polymeren. 24 ATPSs zijn onlangs gebruikt in een verscheidenheid van nieuwe celbiologische toepassingen cel micropatterning inschakelen en gelokaliseerde aflevering van biologische reagentia aan cellen in zeer waterige media. 25-32 een vorm sferoïde, zijn kankercellen gemengd met de waterige fase DEX en een sub-microliter daling van de resulterende suspensie wordt gepipetteerd in een putje met de onderdompeling waterige PEG-fase oplossing. De druppel blijft mengbare van de onderdompeling fase en beperkt cellen de vorming van een sferoïde vergemakkelijken. Kabouterortantly, de hoogst waterige onderdompeling fase levert voedingsstoffen naar de cellen van de bolvormige en minimaliseert het bekende probleem van media verdamping gemeen andere assays die veranderingen in media osmolaliteit en schommelingen geneesmiddelconcentraties veroorzaakt. Deze techniek maakt bolvormige productie en behandeling met geneesmiddelen alleen gebruikmaking van commercieel verkrijgbare reagentia en pipetteren gereedschappen in standaard 96-well platen. Belangrijk is de analyse van cellulaire reacties van sferoïden in hetzelfde plaat met standaard biochemische assays en plaatlezers. Het gemak van het werken met ATPS en het aanpassingsvermogen van de aanpak van de robot liquid handling maakt high throughput generatie van zowel mono-cultuur en de co-cultuur sferoiden een eenvoudige laboratoriumtechniek. Deze nieuwe aanpak zal een grote stap voorwaarts zijn in de richting van integratie van de kankercel sferoïden in ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen processen met verbeterde testen doorvoer en kosteneffectiviteit (toename van het aantal geteste verbindingen en reduced reagensverbruik) en efficiëntie (het verminderen van hands-on tijd).
Een gedetailleerd protocol voor gerobotiseerde productie van kankercel sferoïden in 96-well platen met de ATPS methode wordt hieronder beschreven. Verder worden bijzonderheden van therapie van verkregen sferoïden en stroomafwaarts analyse van de cellulaire responsen met een commercieel biochemische assay gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van polymere waterige tweefasensysteem (ATPS)
- Weeg 0,5 g polyethyleenglycol (PEG) (MW: 35,000) toevoegen aan 9,5 ml compleet kweekmedium in steriele 15 ml conische voorbereiden 10 ml van 5% (w / v) waterige PEG fase.
Opmerking: de helft van het medium toevoegen aan de conische eerste, gevolgd door het toevoegen van het polymeer en daarna het resterende medium minimaliseert hechting van het polymeer aan de kegelvormige wanden en helpt het polymeer op te lossen sneller. - Weeg 0,128 g dextran (DEX) (MW: 500,000) toevoegen aan 0,872 ml compleet kweekmedium in steriele 1,5 ml microcentrifugebuis te bereiden 1 ml 12,8% (w / v) waterige DEX fase.
- Vortex beide oplossingen gedurende ongeveer 1 min tot de polymeren in het medium oplossen.
- Bewaar beide oplossingen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur om het oplossen en homogene mengsels te waarborgen. Houd de kappen boven het waterniveau om de mogelijkheid van contaminatie van oplossingen uit het bad te vermijdenwater.
- Laad de PEG-fase oplossing in een steriele plastic spuit en deze door een spuitfilter van 0,2 urn poriegrootte onzuiverheden te verwijderen.
Let op: Vul de spuit met de PEG-oplossing, plaats deze in de baard van de filter op de top van een conische buis en het gebruik van geweld, duw langzaam de oplossing door het filter. Het is normaal om weerstand ervaren tegen de beweging van de zuiger. Kleine verlies van de polymeeroplossing treedt als sommige van de oplossing in het filter achterblijven, maar de polymeerconcentratie niet veranderen. - Pipetteer 10 ul van de DEX fase oplossing en verdund in 10 ui medium in een afzonderlijke buis resulteren in 6.4% (w / v) DEX fase oplossing. Zuig 100 pl van het PEG fase oplossing en breng deze in een petrischaal.
- Verdeel 0.5 ul van 6,4% (w / v) DEX fase oplossing in de PEG-fase oplossing. Bevestig visueel succesvolle ATPS vorming door het observeren van een DEX daling onder een microscoop. De daling van de grensmoet zichtbaar blijven, die op de aanwezigheid van twee stabiele, aparte waterige fasen.
- Bewaar de voorraad waterige PEG en DEX fase oplossingen 4 ° C tot gebruik.
Opmerking: Het is aanbevolen dat polymeeroplossingen verse voorafgaand aan elk experiment worden bereid en binnen 24 uur van de opslag.
2. Voorbereiding voor het afdrukken van Cancer Cell Sferoïden
- Groei kankercellen van belang (bijvoorbeeld MDA-MB-157 borstkankercellen) tot 90% -100% confluente monolaag. Bij MDA-MB-157 cellen gebruiken medium bestaande uit DMEM met 10% FBS, 1% glutamine en 1% antibiotica.
- Oogst cellen met behulp van een celdissociatiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant) en laadt de ophanging in een 15 ml conische. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 173,3 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml compleet kweekmedium.
- Load cellen op een hemocytometer en tel zij de vereiste getal tecellen een gewenst sferoïde celdichtheid. Een confluente monolaag van MDA-MB-157-cellen gekweekt in een T75 kolf geeft gewoonlijk ~ 7 x 10 6 cellen.
Opmerking:. Vereist celdichtheid een druppelvolume genereren een sferoïde is afhankelijk van het celtype 22 bijvoorbeeld een dichtheid van 1,5 x 10 4 of groter voor MDA-MB-157 cellen wordt aanbevolen in 0,3 pl DEX fase drop zorgen voor de vorming van een enkele spheroïde. - Centrifugeer cellen voor een tweede keer gedurende 5 minuten bij 173,3 xg en resuspendeer in een geschikte hoeveelheid kweekmedium aan de suspensie geconcentreerd tot een gewenste celdichtheid.
Opmerking: Als bijvoorbeeld 7 x 10 6 kankercellen werden geoogst, het totale volume celsuspensie vereist een bolvormige 1,5 x 10 4 celdichtheid in 0,3 pl DEX fase druppelvorm wordt 140 pl. Maar door verdunning met DEX fase oplossing in de volgende stap, alleen 70 pi celkweekmedium om cellen te resuspenderen. - Meng de celsuspensie uniforme verdeling van cellen en mengen van DEX oplossing te waarborgen. En neer te pipetteren moet voorzichtig worden uitgevoerd om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
3. Voorbereiding voor het afdrukken van Co-gekweekte Sferoïden
- Groei kankercellen (bijvoorbeeld MDA-MB-157 menselijke borstkankercellen) en steuncellen (bijvoorbeeld humane fibroblasten) tot 90% -100% confluente monolaag. Oogst elk celtype met een celdissociatiebuffer (volgens het protocol van de fabrikant).
- Plaats elk suspensie in een 15 ml conische, centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 173,3 xg, en zuig supernatant uit elk conisch. Resuspendeer cellen van elk conisch 1 ml compleet gGROEI medium.
Opmerking: Fluorescerende kleurstoffen zoals Calcein AM (levende cel kleuring) en nucleaire kleurstoffen (Hoechst) kan worden gebruikt om de twee celtypen te onderscheiden.
- Plaats elk suspensie in een 15 ml conische, centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 173,3 xg, en zuig supernatant uit elk conisch. Resuspendeer cellen van elk conisch 1 ml compleet gGROEI medium.
- Plaats elk celtype afzonderlijk op een hemocytometer en tel ze het vereiste aantal van elk type cel te berekenen voor een gewenste verhouding van kankercellen steuncellen in co-gekweekte sferoïden. Confluente monolagen van MDA-MB-157-cellen en fibroblasten gekweekt in T75 kolven geven meestal ~ 7 x 10 ~ 6 en 6 x 10 6 cellen.
- Voeg de juiste hoeveelheid van de suspensie van steuncellen kankercellen suspensie tot een gewenste verhouding van het aantal van twee celtypen geven. Gebruik bijvoorbeeld een verhouding van 50 kankercellen 1 fibroblast cel.
- Centrifugeer de conische bevattende gemengde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 173,3 xg en resuspendeer cellen in een geschikt volume resulteert in uiteindelijke dichtheid omvattende gelijke volumes groeimedium en 12,8% (w / v) waterige DEXfase-oplossing (bereid in 1.2).
- Zachtjes pipet de resulterende celsuspensie op en neer om de homogeniteit van de suspensie blijft.
4. Afdrukken van bolvormige tumoren in een 96-well plaat
- Één dag voor experimenten, laag onbehandelde, ronde bodem met 96 putjes met 1% (w / v) Pluronic bij 37 ° C gedurende 24 uur. Deze coating voorkomt cel bevestiging over de kweekperiode.
- Pipetteer 50 ul van de gefiltreerde 5% (w / v) waterige PEG fase in elk putje van een 96-well plaat (Bestemmingsbord).
- Met behulp van een pipet, meng de celsuspensie (bereid in stap 2 of stap 3 voor respectievelijk mono- en co-cultuur) en voeg 20 ul van de opschorting met elk ander goed van de ene kolom van een 384-wells plaat (bron plaatje) .
- Zet de vloeibare handler en "thuis" het pipetteren hoofd om de coördinaten te registreren. Vervolgens stellen een vooraf gedefinieerde protocol (hieronder 4.6) te waarborgen en laboratorium parameters correct gedefinieerdly. Deze "homing" stap kan verschillend zijn voor verschillende vloeibare handlers zijn.
Opmerking: De stroom van het protocol aangegeven stap voor stap hieronder 4.6, zal gelijk zijn ongeacht de robot vloeistofhandler gebruikt; echter, de programmeerinterface afwijken door het gebruik van verschillende software. - Plaats de bronplaat, de bestemming plaat en pipet tips boxen op gedefinieerde posities op het werkstation van de vloeistof handler zie figuur 1.
- Uitvoeren van het protocol dat de volgende stappen omvat:
- Laad een kolom van vaten uit het pipetteren hoofd van de vloeistof handler mengen pipettips (8 tips) vanaf het werkstation (figuur 1).
- Meng de celsuspensie in putjes van de bronplaat (figuur 1). Selecteer een mengvolume kleiner dan de celsuspensie volume in putten belvorming te voorkomen.
- Uitwerpen tips in een lege afval tips doos (Figuur 1). Laad een kolom van vaten uit het pipetteren kop met 10 ul afgeven pipetpunten (figuur 1).
- Zuig 0.3 ul van de celsuspensie uit de bronplaat (figuur 1) in elke pipetpunt.
- Breng de celsuspensie in putjes van een kolom van de bestemming plaat (Figuur 1). Gebruik afgifte hoogte van 0,5 mm en een afgifte stroomsnelheid van kleiner dan 1 pl / sec.
- Herhaal de stappen 4.6.1 door 4.6.6, totdat de kolom-voor-kolom afdrukken in de gehele bestemming plaatje is compleet.
- Verwijder voorzichtig de bestemming plaat van het werkstation oppervlak en plaats deze in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Handhaaf de plaat horizontaal wanneer u deze verplaatst naar de incubator te verstoren van DEX fase druppels bevattende cellen te voorkomen.
- Incubeer de plaat voor 24 uur tot aggregatie van cellen mogelijk te maken in een bolvormige binnen de DEX fase druppel.
Merk op dat de volgende protocol is voor een 4-daagse behandeling met geneesmiddelen en omvat een verlenging met verse drug na dag 2. Het kan worden aangepast voor andere periodes behandeling.
- Bevestig visueel sferoïde vorming in 96-well platen na 24 uur. Indien nodig, beeld putjes van grootte van sferoïden door het gemiddelde van de kleinste en grootste diameter van elke sferoïde.
- Bereid de voorraadoplossing van het gewenste geneesmiddel door te lossen in een oplosmiddel aanbevolen door de fabrikant op een voorafbepaalde concentratie oplosbaarheid. Zo lossen cisplatine in water bij 2 mg / ml.
Opmerking: Bescherm de voorraad oplossing van het geneesmiddel uit het licht als het geneesmiddel is lichtgevoelig. - De seriële verdunning techniek bereiden verdund geneesmiddelconcentraties met celkweekmedium van de voorraadoplossing bereid in de vorige stap. Elke verdunning moet tweemaal de gewenste concentratie worden. Dilution verhoudingen zal variëren afhankelijk van het uitgangsmateriaal voorraad concentratie en gewenste concentraties werken.
- Voeg 50 pl geneesmiddeloplossing bereid in de vorige stap aan elk putje. Dit kan een robot of door handmatige pipetteren worden gedaan.
Opmerking: Elke geneesmiddelconcentratie wordt verdund in de helft tot de gewenste concentratie door 50 ui waterige PEG fase reeds in elk putje.- Gebruik sferoïden twee kolommen van een 96-well plaat (n = 16) voor elke concentratie.
- In controleputjes, voeg slechts 50 pl vers kweekmedium om de bestaande 50 pl van de waterige fase PEG.
- Incubeer sferoïden met het geneesmiddel gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, beschermd tegen licht.
- Na 48 uur incubatie, vers bereid verdunningen van het geneesmiddel op gewenste concentraties en drug verlengen door toevoeging van 50 pl vers geneesmiddeloplossing aan elk putje.
Opmerking: De putjes de gewenste geneesmiddelconcentratie bevatten reeds vanaf de eerste drug tehandeling. Daarom in deze vernieuwing fase elke concentratie wordt bereid in de gewenste concentratie omdat geen verdunning optreedt. - Incubeer sferoïden met het geneesmiddel nog 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, beschermd tegen licht.
6. Analyse van de cellulaire levensvatbaarheid in Sferoïden
- Na 48 uur incubatie met hernieuwde geneesmiddel (dwz totale tijd van behandeling van sferoïden met een geneesmiddel 4 dagen), meet de totale hoeveelheid drager in een putje handmatig pipetteren.
Opmerking: Typische volume in één goed is ~ 140 ul (een kleine daling optreedt als gevolg van verdamping). - Bereken het volume van de cel levensvatbaarheid reagens (bijvoorbeeld PrestoBlue) 10% concentratie van het totale wellvolume. Voeg dit volume van cellevensvatbaarheid reagens aan elke well.
Opmerking: Bij een bestaande media volume van 140 pl in een put wordt een volume van 15,6 pl vereist om een concentratie van het totaal 10% te goed. Dit wordt berekend doorhet verdelen van de bestaande media volume met 9 (140 pl / 9 = 15,6 pi). - Incubeer de plaat met de cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje toegevoegd gedurende 6 uur bij 37 ° C, beschermd tegen licht.
- Plaats de plaat in een micro-plaat lezer en lees de fluorescentie-signaal bij 560 nm en 590 nm excitatie en emissie golflengtes, respectievelijk.
- Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cellen in sferoïden van genormaliseerd fluorescentiesignaal van behandelde putten die controle putjes na het middelen van de waarden van dezelfde behandelingsomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het werkstation van de robot vloeistof handler wordt getoond in figuur 1. De pipetteren kop en alle stations die in de robot drukken van sferoïden in paragraaf 4.6 zijn voorzien. De afbeelding toont het gebruik van twee verschillende stations voor tip dozen (één set tips voor het mengen en de tweede set voor het opzuigen / doseren van celsuspensie-waterige DEX fase mengsel). De gehele opstelling is gehuisvest in een standaard bioveiligheidskast om steriliteit te behouden. Figuur 2 toont een schema van de "printing" proces het waterige tweefasensysteem. Een pipet tip geladen met de celsuspensie in de waterige fase DEX (blauw patroon fase) wordt neergelaten in een rondbodem putje van een 96-wells plaat met de waterige PEG fase (roze, onderdompeling fase) om de inhoud nabij afgeven de put bodem. De resulterende DEX fase druppel beperkt de kankercellen zich verspreiden en bevordert cel-cel interacties die leidenaggregatie van cellen en bolvormige formatie. Sferoïde vorming spontaan gebeurt binnen 24 uur incubatie zoals in de experimentele beeld van figuur 2. In de praktijk wordt deze sferoïde afdrukken uitgevoerd kolom per kolom in 96-well platen. Na sferoïden gevormd wordt kweekmedium vernieuwd door directe toevoeging van vers medium, omzetten van het tweefasensysteem tot een waterfase. Deze overgang komt door afname van de concentraties van PEG en DEX onder een drempel concentratie vereist voor het scheiden van waterige PEG en DEX fasen.
Afgifte van een conventionele luchtverplaatsing pipetteren mechanisme van de vloeistof handler werd parametrisch geoptimaliseerd en bleek dat een afgifte hoogte van 0,5 mm, een afgifte debiet kleiner dan 1 gl / sec, gevolgd door het afgeven 0,2 pl vooraf aangezogen luchtvolume produceert de meest consistente grootte waterige DEX druppels en dus Steroiden. 23 Figuur 3a disspeelt de verdeling van diameter 96 sferoïden ene plaat met een gemiddelde diameter van 332 ± 31 urn. Ervaring leert dat deze benadering genereert typisch sferoïden met 8% -10% standaardafwijking van het gemiddelde diameter. Figuur 3b toont de frequentieverdeling diameter van sferoïden van dezelfde plaat als figuur 3a, waaruit blijkt dat diameters normaal verdeeld.
Vervolgens, het potentieel van deze benadering voor samengestelde screening standaard 96-well platen en analyse van cellulaire responsen in dezelfde platen, zonder gebruik te sferoïden nieuwe platen dragen aangetoond. Figuur 4 toont een dosisafhankelijke studie levensvatbaar MDA -MB-157 borstkankercellen sferoïden behandeld met een klinisch chemotherapeutisch geneesmiddel, cisplatine. -Geneesmiddel behandelde en controle bolletjes werden met een commerciële PrestoBlue reagens (cel levensvatbaarheid reagens). Enzymatisch actieve cellen verminderde de reagent en resulteerde in een verandering in de media kleur en een verandering van het fluorescentiesignaal. De verschuiving in het signaal was het grootst met levende cellen (bijvoorbeeld in controle bolletjes). De levensvatbaarheid van kankercellen in sferoïden af met toenemende geneesmiddelconcentratie dan 1 uM. Deze test resulteerde in een 50% letale dosis drug concentratie LD50 = 4.67 uM.
Deze waterige tweefasensysteem technologie voor 3D-kweek het probleemloos productie van realistischer tumormodellen door op alle bestanddelen van cellulaire micromilieu zoals ondersteunende stromale cellen. Eerder is aangetoond dat het opnemen van stromale cellen in 3D culturen moduleert groei, proliferatie en invasie van kankercellen. 33-35 als proof-of-concept experiment co-kweek sferoïden werden gegenereerd door het combineren van MDA-MB-157 menselijke borst kankercellen en humane fibroblasten in een verhouding van 50: 1. 36 Voorafgaand aan experimenten werden MDA-MB-157 en fibroblast cellen gekleurdmet een nucleaire kleurstof (blauw) en levende cellen kleurstof (groen), respectievelijk detectie van cellen mogelijk fluorescerende beelden. Figuur 5a toont fluorescerende en fase afbeeldingen van co-cultuur sferoïden met een dichtheid van 1,5 x 10 4 cellen en 50 :. 1 verhouding van kankercellen en fibroblasten Figuur 5b toont controle sferoïden van MDA-MB-157 cellen voor vergelijking. Deze benadering zal stellen waarbij het effect van stromale cellen op verschillende fenotypen van kankercellen.
Figuur 1. Liquid Handling Platform. De vloeistof handler bestaat uit stations waar mengtips, doseertips afval tips doos, bron plaat, en de bestemming plaat locaties worden geplaatst. De locatie van elk station wordt gedefinieerd in het protocol. Mengtips worden geladen op een kolom van het pipetteren kop en gebruikt om de oplossing van de waterige fase te mengen DEX bevattende cellen in de bronplaat. Deze tips worden vervolgens afgevoerd in de afvalbak tips en het doseren tips worden op dezelfde kolom van het pipetteren hoofd gestoken. Deze tips aspireren 0,3 pl van de waterige DEX fase die cellen uit de bron bord en verdeel deze in de bestemming plaat-cel met druppels van de DEX fase binnen de onderdompeling PEG fase reeds in de bestemming putjes te vormen. Tot slot van deze tips zijn ook afgevoerd in de afvalbak tips om een cyclus van afdrukken te voltooien.
Figuur 2. Sferoïde Vorming. Het vloeibare handler doseert 0,3 pl van de waterige DEX fase (blauw) bevattende cellen (groen) in een put de waterige PEG oplossing met (roze). Dit resulteert in de vorming van een sferoïde na 24 uur incubatie zoals in de afbeelding rechts. Schaalbalk 200 micrometer.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Sferoïde Samenhang gegevens. (A) Verdeling diameter van sferoïden gemeten van een 96-well plaat, vertegenwoordigt elk punt een sferoïde. (B) Frequentie verdeling van diameters toont normale verdeling van de data.
Figuur 4. Drug Reactie sferoïden. De levensvatbaarheid van cellen in MDA-MB-157 borstkankercellen sferoïden vermindert met een toename in de concentratie van cisplatine dan 1 nM, 200 pM range. De stippellijn is een sigmoidale fit om de levensvatbaarheid van gegevens.
Figuur 5. Co-cultuur sferoïden (a) TL (links) en fasecontrast (rechts) beelden van sferoïden van MDA-MB-157 borstkankercellen (blauw) samen gekweekt met fibroblasten (groen) en 50: 1. verhouding. (B) sferoïden van MDA-MB-157 cellen worden ter vergelijking getoond. Schaalbalk 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sferoïden presenteren een realistisch model om beter te begrijpen tumor fysiologie en werkzaamheid van het geneesmiddel en een nuttig hulpmiddel voor anti-kanker drug discovery. Dergelijke toepassingen zouden veel baat hebben bij eenvoudige spheroïde generatie en onderhoud technieken die alleen standaard laboratorium, liquid handling gereedschappen en screening apparatuur vereisen. Het gebruik van een waterige tweefasensysteem spontaan aggregaat kankercellen in de onderstaande fase maakt een efficiënte productie en onderhoud van sferoïden met robotachtige vloeibare handlers, en in situ behandeling met geneesmiddelen en eindpunt analyse van de cellulaire responsen commerciële reagentia en instrumenten. Derhalve is deze technologie een groot voordeel ten opzichte van bestaande methoden van 3D kanker celculturen en presenteert een screeningsplatform drug discovery bespoedigen.
Het genereren van uniforme en kleinbedrijf bolletjes binnen een micro-well plaat is cruciaal voor high throughput screening toepassingen om een soortgelijke basislijn cellulaire ac zorgentiviteitsgraad in alle bolletjes. Met vloeibare handlers met een luchtverplaatsing pipetteren mechanisme is het belangrijk de afgifte te optimaliseren door kwantificering van het effect van belangrijke vloeistofverwerking parameters (afzien hoogte afzien stroomsnelheid en pre-aangezogen luchthoeveelheid) op het afgeven van de waterige fase DEX . Deze optimalisatie maakt het pipetteren hoofd te vegen uit de viskeuze DEX fase oplossing en kankercellen in putten en produceren homogeen spheroids. Hoewel er geen specifieke hoeveelheden voor deze drie parameters zijn bepaald in het protocol voor de SRT Bravo vloeibare handler, moet een soortgelijke aanpak worden gebruikt met andere vloeibare handlers om optimale dosering omstandigheden die leiden tot een consistente DEX fase druppelgrootte gedispenseerd in de onderdompeling PEG-fase te bepalen. Bovendien is het mogelijk om 96 tips gebruiken en gelijktijdig drukken sferoïden in alle 96 wells. Dit verhoogt echter het aantal cellen nodig is om de bron plaat met het vullenDEX waterige fase bevattende cellen. Ongeacht selecteren kolomgewijs of hele drukplaat nadert, is het cruciaal om de inhoud van de bronplaat voor aspiratie stap mengen. Dit zorgt ervoor dat de dichte celsuspensie in de DEX homogeen is en vermindert variaties in de grootte van sferoïden.
Verschillende studies tonen aan dat de kankercel sferoiden nabootsen een aantal belangrijke eigenschappen van avasculaire tumoren zoals morfologie en diffusiebeperkingen van reagentia; vandaar vormen zij een fysiologisch relevant model voor evaluatie van de effectiviteit van nieuwe en conventionele verbindingen tegen kankercellen in vergelijking met traditionele monolaag celkweken. 8,17,18,21,23,37 Het blijkt dat de waterige tweefasensysteem benadering produceren sferoiden laat gunstig drug discovery in dezelfde plaat, simpelweg door toevoeging en vernieuwing van een geneesmiddel verbinding op de gewenste tijdstippen en geautomatiseerde screening van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een standaard micro-plate reader. Ditis een belangrijk voordeel tegenover technieken zoals opknoping druppels die zouden moeten mogelijk sferoïden een standaardplaat voor de analyse van cellulaire reacties op geneesmiddelen. 21 Bovendien is het bekend dat steuncellen in de tumor micro-omgeving en hun interacties met kankercellen zijn betrokken bij verschillende kwaadaardige fenotypes van kankercellen. 33-35,38,39 daarom de mogelijkheid om co-cultuur sferoïden kanker genereren en stromale cellen met het waterige tweefasensysteem technologie zal de invloed van steuncellen van tumor micro op responsen van kanker evalueren cellen aan verschillende behandelingen. De co-kweek experiment uitgevoerd in deze studie dient als proof-of-concept dat deze technologie met succes kan genereren sferoïden die kankercellen en stromale cellen. Toekomstig onderzoek zal deze mogelijkheid benutten en te onderzoeken differentiële kenmerken van mono- en samen gekweekt bolletjes zoals proliferatie en drugs reacties. Daarnaast is dezetechnologie biedt een platform om de in vivo tumor micro beter nabootsen door op alle stromale componenten in het tumormodel. 40
Kortom, dit protocol maakt spontane vorming van sferoïden in 96-well platen zonder enige externe krachten. Aanpassing van de techniek om een robot vloeistofhandler verhoogt de snelheid en efficiëntie van sferoïde productie in een standaard high throughput formaat. De verenigbaarheid van de technologie met commerciële beeldvorming en test analyseert platforms mogelijk maakt gebruik van verschillende instrumenten beschikbaar in academische en industriële laboratoria. Voor toekomstige toepassingen, zal dit protocol drug screening met 3D kanker celculturen een routine techniek te stroomlijnen. Bovendien kan deze benadering eenvoudig worden aangepast om sferoïden van verschillende afmetingen, verschillende celtypen verschillende combinaties van kanker en stromale cellen in co-cultuur sferoïden te vormen en worden opgeschaald hogere doorvoersnelheid micro-putjes to verder te versnellen anti-kanker medicijn screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
