Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Robotic Production of Cancer Cell Sfäroider med en vatten tvåfassystem för drogtestning

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754

Introduction

Cellbaserade analyser ger ett viktigt verktyg för att utveckla och upptäckten av nya läkemedel mot cancer. 1,2 Historiskt har monolagerodling av cancerceller använts för att undersöka effekten av kandidatföreningar mot vissa typer av cancerceller. Den enkelt underhåll av monolagerkulturer i standardodlingsplattor, kompatibilitet standardplattor med kommersiella robot verktyg för tillsats av reagens och med screening utrustning för nedströms analys av cellulära svar på kemiska föreningar är de stora fördelarna som gör 2D kulturer en attraktiv verktyg för drogtestning. 3 Tyvärr, monolager cellanalyser ofta misslyckas med att förutsäga effekten av föreningar in vivo, vilket gör läkemedelsutveckling och upptäckt en extremt kostsam process. 4,5 Trots betydande investeringar och insatser av läkemedelsföretag och akademiska enheter, bara ~ 1% av anti-cancer läkemedel i kliniska prövningar godkändesav FDA under de senaste två decennierna. 6 Skillnader mellan 2D kulturer och den komplexa 3D-miljö av cancerceller in vivo är en stor brist på monoskikt odlingssystem. 7 Därför screening av kandidatföreningar mot tumörceller i en miljö som mer liknar 3D-tumörmiljön kan påskynda utvecklingen av nya cytostatika. 8

Cancer Cell sfäroider presentera en relevant 3D tumörmodell in vitro. 9,10 Sfäroider är kompakta kluster som bildar genom spontan eller inducerad sammansättning av cancerceller på icke-vidhäftande ytor eller i suspension med användning av tekniker såsom spinnkolv, flytande overlay, mikrofabricerad mikro- . väl arrayer, mikrofluidik och hängande droppar 11-16 Sfäroider härma viktiga funktioner i solida tumörer inklusive geometri och begränsade transporter av syre, näringsämnen och läkemedelssubstanser i den centrala zonen; följaktligen, de närmare regenerera drog response av solida tumörer jämfört med monolagerkulturer. 17-19 Trots detta markant fördel är spheroids inte rutinmässigt för screening av kemiska föreningar mot cancerceller. Svårighet att producera enhetliga stora spheroids i en standard hög genomströmning inställning som är kompatibel med kommersiellt tillgängliga robotteknik och screening / bildframställning hindrar inkorporering av sfäroid kulturen i läkemedelsutveckling pipeline. Även anpassade material och plattor har nyligen blivit kommersiellt tillgängliga att tillgodose det behovet, kostnadsöverväganden avskräcka en bred användning.

Två större med möjlighet att producera konsekventa stora sfäroider i hög genomströmning använda en ny droppe plattform och mikrofabricerade mikrobrunnar. 13,16,20 Men båda metoderna kräver speciella plattor och enheter som är dyra att tillverka och obekvämt för endpoint användare i kärn forskningscentra och läkemedelsindustrin, där den mest betydande effästningar för upptäckten av nya anticancerläkemedel görs. Trots vissa förbättringar i stabilitet cellinnehållande droppar med en nyligen utformning av hängande fallplåtar, endast varannan hål i plattan fortfarande används under odling för att undvika spridning / sammanslagning av droppar. 16 Detta minskar avsevärt experimentell genomströmning. Drog addition och förnyelse är svårt med manuell eller robot pipettering och sfäroider måste överföras till en vanlig platta för biokemisk analys eftersom denna platta konfiguration är inte lätt kan förenas med konventionell screening utrustning såsom plattläsare. 21 Mikro brunnar fabricerade använder mjuk litografi också tillåta kontrollerad storlek sfäroid produktionen. 13,20 emellertid oförenlighet denna plattform med standardpipetteringsverktyg förhindrar behandling av enskilda sfäroider med olika läkemedelssubstanser / koncentrationer, utsätta alla spheroids till en enda behandling tillstånd. Således är inte lämpligt för hög denna metodgenomströmning förening screening som kräver samtidig testning av flera föreningar / koncentrationer.

För att övervinna dessa hinder, har en ny teknik för hög genomströmning produktion av konsekvent stora cancercell spheroids i standard 96-hålsplattor utvecklats. 22,23 Ansatsen bygger på en polymer vatten tvåfassystem (ATPS) med polyetylenglykol ( PEG) och dextran (DEX) som fasbildande polymerer. 24 ATPSs har nyligen använts i en mångfald av nya cellbiologiska applikationer för att möjliggöra cell micropatterning och lokaliserad leverans av biologiska reagens till celler i höggradigt vattenhaltiga medier. 25-32 För att bilda en sfäroid, är cancerceller blandas med den vattenhaltiga DEX fasen och en sub-mikroliters droppe av den resulterande suspensionen pipetteras i en brunn innehållande nedsänkning vattenhaltig PEG-fasen lösning. Droppen förblir oblandbar från nedsänkning fasen och begränsar celler för att underlätta bildandet av en sfäroid. Importantly, ger den mycket vattenimmersionsfasen näringsämnen till cellerna i sfäroid och minimerar välkända problemet med medie avdunstning gemensam för några andra analyser som orsakar förändringar i medie osmolalitet och fluktuationer i läkemedelskoncentrationer. Denna teknik möjliggör sfäroid produktion och läkemedelsbehandling endast med användning av kommersiellt tillgängliga reagens och pipetteringsverktyg i standard 96-brunnars plattor. Viktigt är analys av cellulära svar av sfäroider utförs i samma platta med användning av biokemiska standardanalyser och plattläsare. Enkelheten i att arbeta med ATPS och anpassningsförmåga till den inställning till robotvätskehantering gör hög genomströmning generation både monokultur och samodling Sfäroiderna en enkel laboratorieteknik. Denna nya metod kommer att vara ett stort steg framåt mot integration av cancerceller spheroids i läkemedelsutveckling och upptäcktsprocesser med förbättrad testning genomströmning och kostnadseffektivitet (allt fler testade föreningar och reduced reagensförbrukning) och effektivitet (minska hands-on tid).

En detaljerat protokoll för robot produktion av cancercell sfäroider i 96-brunnars plattor med användning av ATPS tillvägagångssätt beskrivs nedan. Dessutom finns uppgifter om läkemedelsbehandling av resulte sfäroider och nedströms analys av cellulära svar med hjälp av en kommersiell biokemisk analys presenteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av Polymera Vatten tvåfassystem (ATPS)

  1. Väg 0,5 g polyetylenglykol (PEG) (molekylvikt: 35.000) och lägga till den i 9,5 ml fullständigt tillväxtmedium i en steril 15 ml koniskt för att framställa 10 ml av 5% (vikt / volym) vattenlösning av PEG-fasen.
    Obs: Lägga hälften av mediet till den koniska först följt av tillsats av polymeren och sedan resterande mängden medel minimerar vidhäftning av polymeren till de koniska väggar och hjälper polymeren upplösa snabbare.
  2. Väg 0,128 g dextran (DEX) (MW: 500.000) och lägga till 0,872 ml fullständigt tillväxtmedium i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör att förbereda en ml 12,8% (vikt / volym) vatten DEX fasen.
  3. Vortex både lösningar för ca 1 min för att lösa upp polymererna i mediet.
  4. Håll båda lösningarna i ett vattenbad vid 37 ° C under 1 h för att säkerställa upplösning och homogena blandningar. Håll locken ovanför vattennivån för att undvika risken för kontaminering av lösningar från badetvatten.
  5. Fyll på PEG-fasen lösningen i en steril, plastspruta och passera den genom ett sprutfilter av 0,2 | im porstorlek för att avlägsna orenheter.
    OBS: Fyll sprutan med PEG-lösning, placera den i insatsen av filtret ovanpå ett koniskt rör och använda våld, tryck långsamt lösningen genom filtret. Det är normalt att motståndet mot rörelse av sprutkolven. Mindre förlust av polymerlösningen sker såsom en del av lösningen förblir i filtret, men polymerkoncentrationen kommer inte att förändras.
  6. Pipettera 10 | il av DEX fasen lösningen och späd den i 10 | il medium i ett separat rör för att resultera i 6,4% (vikt / volym) DEX fas lösning. Aspirera 100 pl av PEG-fasen lösningen och dispensera den i en petriskål.
    1. Dispensera 0,5 pl av 6,4% (vikt / volym) DEX fas lösning i PEG-fasen lösningen. Visuellt bekräfta framgångsrika ATPS bildning genom att observera en DEX droppe under ett mikroskop. Nedgången gränsenbör förbli synliga, vilket indikerar närvaron av två stabila, separata vattenfaser.
  7. Förvara lager vattenhaltiga PEG och DEX enfaslösningar i 4 ° C fram till användning.
    OBS: Vi rekommenderar att polymerlösningar är beredda färska före varje experiment och användas inom 24 timmar om förvaring.

2. Förberedelse för utskrift av cancercell Sfäroider

  1. Väx cancerceller av intresse (t.ex. MDA-MB-157 bröstcancerceller) till en 90% -100% sammanflytande monolager. För MDA-MB-157 celler, använda ett medium som består av DMEM innehållande 10% FBS, 1% glutamin och 1% antibiotika.
    1. Harvest celler med hjälp av en cell dissociation buffert (enligt tillverkarens protokoll) och ladda suspensionen i en 15 ml konisk. Centrifugera den för 5 min vid 173,3 xg, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml komplett tillväxtmedium.
  2. Last celler på en hemocytometer och räkna dessa för att beräkna det erforderliga antaletav celler för en önskad sfäroid celltäthet. En sammanflytande monolager av MDA-MB-157 celler som odlats i en T75 kolv ger oftast ~ 7 x 10 6 celler.
    Anm.: Erforderlig celltäthet för ett droppvolymen för att generera en enda sfäroid kommer att bero på celltypen 22 Till exempel, en densitet av 1,5 x 10 4 eller större för MDA-MB-157-celler rekommenderas per 0,3 pl DEX fas droppe till säkerställa bildandet av en enda sfäroid.
  3. Centrifugera cellerna för en andra gång under 5 minuter vid 173,3 xg och slamma dem i en lämplig volym av odlingsmedium för att koncentrera suspensionen till en önskad celltäthet.
    Obs: Till exempel om 7 x 10 6 cancerceller skördades, den totala volymen av cellsuspension krävs för att bilda en sfäroid av 1,5 x 10 4 celltäthet i en 0,3 l DEX fasen droppe blir 140 pl. Men på grund av utspädning med DEX fasen lösningen i nästa steg, använd endast 70 ^ il cellodlingsmedium för att resuspendera cellerna.
  4. 4 celldensitet sfäroid, är 70 | il av DEX fasen lösningen sattes till 70 ul av cellsuspension.
  5. Blanda cellsuspensionen att säkerställa jämn fördelning av celler och blandning av DEX-lösning. Pipettera upp och ned bör göras försiktigt för att förhindra bubbelbildning.

3. Förberedelser för utskrift av Co-odlade Sfäroider

  1. Väx cancerceller (t ex, MDA-MB-157 humana bröstcancerceller) och stödceller (t.ex. humana fibroblaster) och en 90% -100% sammanflytande monoskikt. Avverkar varje celltyp med hjälp av en cell dissociation buffert (enligt tillverkarens protokoll).
    1. Fyll varje suspension i en 15 ml koniskt, centrifugera dem för 5 min vid 173,3 xg, och aspirera supernatanten från varje konisk. Resuspendera cellerna i varje konisk i 1 ml komplett gillv ä xt-medium.
      Anm: Fluorescerande färgämnen såsom Calcein AM (levande cell fläck) och nukleära färgämnen (Hoechst) kan användas för att skilja mellan de två celltyper.
  2. Fyll varje celltyp separat på en hemocytometer och räkna dessa för att beräkna det erforderliga antalet av varje celltyp för ett önskat förhållande av cancerceller till stödjande celler i samodlade sfäroider. Konfluerande monolager av MDA-MB-157 celler och fibroblaster odlade i T75-kolvar ger oftast ~ 7 x 10 6 och ~ 6 x 10 6 celler, respektive.
  3. Lägg rätt volym från suspensionen av stödjande celler till cancerceller suspensionen för att ge ett önskat förhållande mellan antalet två celltyper. Använd till exempel ett förhållande på 50 cancerceller till 1 fibroblastcell.
  4. Centrifugera den koniska innehållande den blandade cellsuspensionen i 5 min vid 173,3 xg och återsuspendera cellerna i en lämplig volym för att resultera i slutliga densiteten bestående av lika stora volymer odlingsmedium och 12,8% (vikt / volym) vattenlösning av DEXfas-lösning (framställd i 1,2).
  5. Pipett försiktigt den resulte cellsuspensionen upp och ner för att säkerställa homogenitet suspensionen.

4. Tryckning av Tumör Sfäroider i en 96-brunnar

  1. En dag före experimenten, belägga ej behandlade, rundbottnade 96-brunnars plattor med en% (vikt / volym) Pluronic vid 37 ° C under 24 h. Denna beläggning förhindrar cellvidhäftning under odlingsperioden.
  2. Dispensera 50 pl av den filtrerade 5% (vikt / volym) vattenlösning av PEG-fasen i varje brunn i en 96-brunnsplatta (destinationsplatta).
  3. Med pipett blanda cellsuspensionen (framställd i steg 2 eller steg 3 för mono- och co-kultur, respektive) och tillsätt 20 pl av suspensionen till varannan väl från en kolumn i en 384-brunnar (källa platta) .
  4. Slå på vätskehanteraren och "hem" pipetteringshuvudet för att registrera koordinater. Sedan sammanställer en tidigare definierad protokoll (nedan i 4.6) för att säkerställa labb och parametrar definieras korrektly. Denna "målsökande" steg kan vara olika för olika flytande hanterare.
    Anm: Flödet av protokollet, som visas steg för steg nedan i 4,6, kommer att vara liknande oberoende av robot vätskehanteraren används; emellertid kan programmeringsgränssnittet se annorlunda på grund av användningen av olika programvaror.
  5. Placera källplatta, destinationsplatta, och pipettspetsar lådor vid definierade positioner på arbetsstationen av vätskehanteraren såsom visas i figur 1.
  6. Utför det protokoll som omfattar följande steg:
    1. Belastning en kolumn med fat från pipettering chef vätskehanteraren med blandnings pipettspetsar (8 tips) från arbetsstationen (Figur 1).
    2. Blanda cellsuspensionen i brunnar av källplattan (figur 1). Välj ett blandningsvolym mindre än cellsuspensionen volymen i brunnar för att undvika bubbelbildning.
    3. Mata spetsarna i en tom soptippar låda (figur 1). Belastning en kolonn av fat från pipetteringshuvud med 10 | il dispense pipettspetsar (Figur 1).
    4. Aspirera 0,3 pl av cellsuspensionen från källplattan (figur 1) in i varje pipettspets.
    5. Fördela cellsuspensionen i brunnar i en kolumn av destinationsplatta (fig 1). Använd en dispensehöjd på 0,5 mm och en dispense flöde på mindre än 1 l / sek.
    6. Upprepa steg 4.6.1 genom 4.6.6 tills kolonnen för kolumn utskrift i hela destinationsplatta är klar.
  7. Försiktigt bort destinationsplattan från ytan arbetsstation och placera den i en fuktig inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Behåll plattan horisontell när du bär den i inkubatorn för att undvika störningar i DEX fas droppar innehållande celler.
  8. Inkubera plattan i 24 timmar för att möjliggöra aggregering av celler i en sfäroid inom DEX fasen droppe.
<p class = "jove_title"> 5. Drug behandling av cancer cell Sfäroider

Notera att följande protokoll är för en 4-dagars drogbehandling och inkluderar en förlängning med färsk drog efter dag 2. Den kan ändras för andra behandlingsperioder.

  1. Visuellt bekräfta sfäroid bildning i 96-brunnars plattor efter 24 h. Om det behövs, bild brunnar för mätning av storleken på sfäroider som genomsnittet de minsta och största diameter på varje sfäroid.
  2. Bered stamlösningen av ett önskat läkemedel genom upplösning i ett lösningsmedel som rekommenderas av tillverkaren vid en koncentration förbestämd löslighet. Exempelvis upplöses cisplatin i vatten vid 2 mg / ml.
    Obs: Skydda stamlösningen av läkemedlet från ljus om läkemedlet är ljuskänsliga.
  3. Använda seriespädningsteknik, förbereda utspädda läkemedelskoncentrationer med cellodlingsmedium från stamlösningen bereds i föregående steg. Varje spädning skall utföras två gånger den önskade koncentrationen. Dilmepannor nyckeltal varierar beroende på utgångsaktiekoncentrationen och önskad arbets koncentrationer.
  4. Lägg 50 | il läkemedelslösning framställd i föregående steg till varje brunn. Detta kan göras med robot eller genom manuell pipettering.
    Notera: Varje läkemedelskoncentration kommer att spädas i hälften till den önskade koncentrationen av 50 | il vattenhaltig PEG-fasen redan i varje brunn.
    1. Använd sfäroider från två kolonner av en 96-brunnars platta (n = 16) för varje koncentration.
    2. I kontrollbrunnar, tillsätt endast 50 | il av färskt odlingsmedium till de befintliga 50 pl av den vattenhaltiga PEG-fasen.
  5. Inkubera sfäroider med läkemedlet under 48 h vid 37 ° C och 5% CO2, skyddad från ljus.
  6. Efter 48 h av inkubation, förbereda färska spädningar av läkemedel vid önskade koncentrationer och förnya drogen genom tillsats 50 | il färskt läkemedelslösning till varje brunn.
    Obs: Brunnarna innehåller redan den önskade läkemedelskoncentrationen från den första drogen treatment. Därför i denna förnyelse fasen är varje koncentration bereds vid den önskade koncentrationen eftersom ingen utspädning uppstår.
  7. Inkubera sfäroider med läkemedlet för ytterligare 48 h vid 37 ° C och 5% CO2, skyddad från ljus.

6. Analys av Cellular viabilitet i Sfäroider

  1. Efter 48 timmars inkubation med förnyad läkemedel (dvs, är totala tiden för behandling av sfäroider med en drog 4 dagar), mäta den totala volymen av medium i en brunn genom manuell pipettering.
    Obs: Typisk volym i en brunn är ~ 140 l (en liten minskning uppstår på grund av avdunstning).
  2. Beräkna volymen av cellviabilitet reagens (t.ex. PrestoBlue) som 10% koncentration av den totala brunnsvolym. Lägg denna volym av cellviabilitet reagens till varje brunn.
    Obs: Med en befintlig medievolymen på 140 ul i en brunn, krävs en volym på 15,6 l för att ge en koncentration 10% av den totala bra. Detta beräknas genomdividera befintliga medievolymen med 9 (140 pl / 9 = 15,6 l).
  3. Inkubera plattan med cellviabiliteten reagens sattes till varje brunn under 6 h vid 37 ° C, skyddat från ljus.
  4. Placera plattan i en mikroplattläsare och läsa fluorescenssignalen vid 560 nm och 590 nm excitations- och emissionsvåglängder, respektive.
  5. Beräkna procent livskraft celler i sfäroider genom att normalisera den fluorescerande signalen från behandlade brunnar till den i kontrollbrunnar efter medelvärdes värdena från samma behandlingsförhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbetsstationen hos robot vätskehanterare visas i figur 1. Den pipetteringshuvud och alla stationer som används i robot tryckning av sfäroider i avsnitt 4.6 är märkta. Bilden visar användningen av två olika stationer för spetslådor (en uppsättning tips för blandning och den andra uppsättningen för aspire / dispensering av cellsuspension-vatten DEX fasblandning). Hela installationen är inhyst i en standard biologiska säkerhetsskåp för att upprätthålla sterilitet. Figur 2 visar ett schema för den "utskrift" processen med det vattenhaltiga tvåfassystemet. En pipettspets laddad med cellsuspensionen i den vattenhaltiga DEX fasen (blå, mönstrings fas) sänks ner i en rundbottnad brunn i en 96-brunnars platta innehållande den vattenhaltiga PEG-fasen (rosa, nedsänkning fas) för att dispensera sitt innehåll nära brunnens botten. Den resulte DEX fas droppe begränsar cancercellerna från att dispergera och uppmuntrar cell-cell interaktioner som resulterar iaggregering av celler och sfäroid bildning. Sfäroid formation är spontan och sker inom 24 h av inkubation som visas i den experimentella bilden i figur 2. I praktiken är detta sfäroid utskrift utförs kolonn-efter-kolonn i 96-brunnsplattor. Efter sfäroider bildas, är odlingsmediet förnyas genom direkt tillsats av färskt medium, omvandling av tvåfassystemet till en enda vattenhaltig fas. Denna övergång beror på minskningen av koncentrationen av PEG och DEX under ett tröskelvärde koncentration som krävs för separation av vatten PEG och DEX faserna.

Utmatning från en konventionell luftförskjutnings pipettering mekanism vätskehanteraren ades parametriskt optimeras och det befanns att en dispenseringshöjd på 0,5 mm, en dispenseringsflödeshastighet av mindre än 1 | il / sekund, följt av utmatning av 0,2 | il av färdigaspireluftvolym producerar den mest konsekventa storleken på vatten DEX droppar, och därmed sfäroider. 23 Figur 3a disspelar fördelningen av diametern hos 96 sfäroider från en platta med en medeldiameter av 332 ± 31 | im. Tidigare erfarenheter visar att detta tillvägagångssätt genererar vanligtvis sfäroider med 8% -10% standardavvikelse runt medeldiameter. Figur 3b visar fördelningen av diameter sfäroider av samma platta frekvens som i figur 3a, som visar att diametrar normalt distribueras.

Därefter potentialen i denna strategi för förening screening i standard 96-hålsplattor och analys av cellulära svar i samma plattor, utan ett behov av att överföra spheroids till nya plattor demonstreras. Figur 4 visar en dosberoende studie av livskraft MDA -MB-157 bröstcancerceller sfäroider behandlade med en klinisk kemoterapeutiska läkemedel, cisplatin. Drogbehandlade och kontroll sfäroiderna inkuberades med ett kommersiellt PrestoBlue reagens (cellviabiliteten reagens). Enzymatiskt aktiva celler reducerade reagent och resulterade i en förändring i media färg och en förskjutning i den fluorescerande signalen. Förskjutningen i signalen var störst med levande celler (t.ex. i kontroll sfäroider). Den livskraft cancerceller i sfäroider minskade med ökande läkemedelskoncentration över 1 ^ M. Detta test resulterade i en 50% dödlig dos läkemedelskoncentration av LD50 = 4,67 ^ M.

Denna vatten tvåfassystem teknik för 3D kultur möjliggör enkel produktion av mer realistiska tumörmodeller genom att inkludera andra komponenter i cellulära mikromiljöer såsom stöd stromaceller. Det har tidigare visats att även stromaceller i 3D kulturer modulerar tillväxt, spridning och invasion av cancerceller. 33-35 Som ett proof-of-concept experiment co-kultur sfäroider genererades genom att kombinera MDA-MB-157 human bröst cancerceller och humana fibroblaster vid ett förhållande av 50:. en 36 Före experiment, var MDA-MB-157 och fibroblastceller färgademed en nukleär färgämne (blå) och levande cell färgämne (grön), respektive, för att möjliggöra detektion av celler i fluorescerande bilder. Figur 5a visar fluorescerande och fas bilder av co-kultur sfäroider med en densitet av 1,5 x 10 4 celler och en 50 :. 1 förhållande av cancerceller och fibroblaster Figur 5b visar styr sfäroider av MDA-MB-157-celler för jämförelse. Detta tillvägagångssätt kommer att möjliggöra utvärdering av effekten av stromala celler på olika fenotyper av cancerceller.

Figur 1
Figur 1. Vätskehantering Platform. Vätskehanteraren består av stationer där blandningstips, dispense tips avfall tips rutan, källplatta, och destination plattplatser placeras. Placeringen av varje station definieras i protokollet. Blandningsspetsar lastas på en kolonn av pipetteringshuvudet och användas för att blanda lösningen av vattenhaltig DEX fasen innehållande celler i källplattan. Dessa tips är sedan bortskaffas i rutan soptippar och dispense tips infogas på samma kolumn för pipettering huvudet. Dessa tips aspirera 0.3 il av vatten DEX fasen innehåller celler från källplattan och fördela den i destinationsplattan för att bilda cellinnehållande droppar av DEX fasen inom nedsänkning PEG fasen redan på destinationsplattbrunnarna. Slutligen dessa tips är också omhändertas i rutan soptippar för att slutföra en cykel för tryckning.

Figur 2
Figur 2. Sfäroid Formation. Vätskehanteraren doserar 0.3 il av vatten DEX fasen (blå) innehåller celler (grön) i en brunn som innehåller vatten PEG-lösning (rosa). Detta resulterar i bildandet av en sfäroid efter 24 h av inkubation som visas i bilden till höger. Scale bar 200 | im.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Sfäroid Konsistens Data. (A) Fördelningen av diametern av sfäroider, mätt från en 96-brunnars platta, representerar varje punkt en sfäroid. (B) Frekvens fördelning av diametrar visar normalfördelning av data.

Figur 4
Figur 4. Drug Response för Sfäroider. Den livskraft celler i MDA-MB-157 bröstcancerceller sfäroiderna minskar med ökad koncentration av cisplatin över 1 nM-200 iM sortiment. Den streckade linjen är en sigmoidal passning till data livskraft.

Figur 5
Figur 5. Co-Kultur Sfäroider (a) Lysrör (vänster) och fas-kontrast (höger) bilder av sfäroider av MDA-MB-157 bröstcancerceller (blå) samodlades med fibroblaster (grön) med en 50: 1. förhållande. (B) Sfäroider av MDA-MB-157-celler visas som jämförelse. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spheroids presentera en realistisk modell för att bättre förstå tumör fysiologi och läkemedlets effektivitet och ge ett användbart verktyg för anti-cancer läkemedel. Sådana tillämpningar skulle ha stor nytta av enkla sfäroid generation och underhållstekniker som bara kräver standardlaboratorieutrustning, flytande verktyg hanterings- och sorteringsutrustning. Användningen av en vattenbaserad tvåfassystem att spontant samlade cancerceller inom droppfasen möjliggör effektiv produktion och underhåll av sfäroider med robot flytande hanterare, och in situ läkemedelsbehandling och slutpunkt analys av cellulära svar med kommersiella reagenser och verktyg. Således är denna teknik en stor fördel jämfört med befintliga metoder för 3D cancercellkulturer och presenterar en screening plattform för att påskynda läkemedelsutveckling.

Generera enhetliga stora sfäroider inom en mikrobrunnsplatta är avgörande för hög kapacitet program för att säkerställa en liknande baslinje cellulär activitet nivå i alla sfäroider. Använda flytande hanterare med en luftvolym pipettering mekanism, är det viktigt att optimera doseringsprocessen genom kvantifiering av effekten av viktiga vätskehanteringsparametrar (avstå höjd, dosera flöde, och pre-aspireluftvolym) på dispense av vatten DEX fasen . Denna optimering tillåter pipettering huvudet för att sopa ut den viskösa DEX fasen lösning och cancerceller i brunnar och producera homogena sfäroider. Även särskilda kvantiteter för dessa tre parametrar har fastställts i protokollet för SRT Bravo vätskehanterare bör ett liknande tillvägagångssätt användas med andra flytande hanterare för att bestämma optimala dispense förhållanden som resulterar i en konsekvent DEX fasen droppstorlek dispens i nedsänkning PEG fasen. Dessutom är det möjligt att använda 96 tips och att samtidigt skriva ut spheroids in alla 96 brunnar. Detta dock avsevärt ökar antalet celler som krävs för att fylla källplatta medvattenhaltiga DEX fas innehållande celler. Oavsett val av kolumnvisa eller hel-tryckplatta metoder, är det viktigt att blanda innehållet i källplattan före aspirationssteg. Detta säkerställer att den täta cellsuspensionen i DEX fasen är homogen och minskar variationer i storleken på sfäroider.

Flera studier visar att cancerceller spheroids härma flera viktiga egenskaper hos avaskulära tumörer såsom morfologi och diffusionsbegränsningar av reagenser; därmed de presentera ett fysiologiskt relevant modell för att utvärdera effekten av nya och konventionella föreningar mot cancerceller jämfört med traditionella monolager cellkulturer. 8,17,18,21,23,37 Det visas att vatten tvåfassystemet inställning till att producera spheroids tillåter lämpligen drogscreening i samma platta, helt enkelt genom tillsats och förnyelse av en läkemedelsförening vid önskade tidpunkter och automatiserad screening av cellviabiliteten med en vanlig mikroplattläsare. Dettaär en stor fördel jämfört med tekniker såsom hängande droppar som skulle kräva att överföra spheroids till en vanlig platta för analys av cellulära svar till droger. 21 Vidare är det känt att stödjande celler i tumören mikromiljö och deras interaktioner med cancerceller är inblandade i olika maligna fenotyper av cancerceller. 33-35,38,39 därför förmågan att generera co-kultur sfäroider av cancer och stromaceller använder vatten tvåfas teknik kommer att hjälpa utvärdera inverkan av stödceller av tumörmikromiljö på svar av cancer celler till olika behandlingar. Den samodling experiment i denna studie fungerar som ett proof-of-concept att denna teknik framgångsrikt kan generera spheroids innehåller cancerceller och stromaceller. Framtida studier kommer utnyttja denna kapacitet och undersöka differential egenskaper mono- och co-odlade sfäroider såsom spridning och drogsvar. Dessutom har dennateknik ger en plattform för att närmare efterlikna in vivo tumörmikromiljö genom att inkludera andra stromala komponenter i tumörmodell. 40

Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll spontan bildning av sfäroider i 96-hålsplattor utan att använda några externa krafter. Att anpassa tekniken till en robot vätskehanterare ökar hastigheten och effektiviteten i sfäroid produktionen i en vanlig hög genomströmning format. Kompatibiliteten av tekniken med kommersiella avbildning och analys analyserar plattformar möjliggör användning av olika instrument som finns tillgängliga i akademiska och industriella laboratorier. För framtida tillämpningar, kommer detta protokoll effektivisera läkemedelsscreening med 3D cancercellkulturer en rutin teknik. Dessutom kan denna metod lätt modifieras för att bilda sfäroider av olika storlekar, olika celltyper, olika kombinationer av cancer och stromaceller i samodling sfäroider, och skalas upp till högre genomströmning mikrobrunnsplattor to ytterligare påskynda läkemedel mot cancer screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

Tags

Bioteknik Cancer Cell Sfäroid 3D kultur Robotic hög genomströmning Co-kultur drogundersökning
Robotic Production of Cancer Cell Sfäroider med en vatten tvåfassystem för drogtestning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D.,More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter