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Bioengineering

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754

Introduction

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Ensayos basados ​​en células constituyen un instrumento importante para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. 1,2 Históricamente, se han empleado cultivos monocapa de células cancerosas para investigar la eficacia de los compuestos candidatos contra determinados tipos de células cancerosas. La facilidad de mantenimiento de los cultivos en monocapa en placas de cultivo estándar, la compatibilidad de placas estándar con herramientas robóticas comerciales para la adición de reactivos, y con los equipos de control para el análisis de aguas abajo de las respuestas celulares a los compuestos químicos son los principales beneficios que hacen que las culturas 2D una herramienta atractiva para las pruebas de drogas. 3 Desafortunadamente, ensayos de células monocapa a menudo fallan para predecir la eficacia de los compuestos in vivo, por lo que el desarrollo de fármacos y el descubrimiento de un proceso extremadamente costoso. 4,5 A pesar de la inversión y el esfuerzo significativo por las compañías farmacéuticas y unidades académicas, sólo ~ 1% de lucha contra el cáncer fueron aprobados fármacos en ensayos clínicospor la FDA en los últimos dos decenios. 6 Disparidad entre las culturas en 2D y el complejo entorno 3D de células cancerosas en vivo es una de las principales deficiencias de los sistemas de cultivo en monocapa. 7 Por lo tanto, el cribado de compuestos candidatos contra las células tumorales en un entorno que se asemeja más el ambiente del tumor 3D puede acelerar el desarrollo de nuevos fármacos para quimioterapia. 8

Esferoides celulares de cáncer presentan un modelo de tumor 3D relevante in vitro. 9,10 esferoides son grupos compactos que se forman a través del conjunto espontánea o inducida de células cancerosas en las superficies no adherentes o en suspensión usando técnicas tales como matraz de centrifugación, recubrimiento líquido, micro microfabricado . bien arrays, microfluídica, y las gotas que cuelgan 11-16 esferoides imitan las características clave de los tumores sólidos, incluyendo la geometría y el transporte limitado de oxígeno, nutrientes y compuestos de la droga en la zona central; Por lo tanto, se regeneran más estrechamente respon drogasSE de tumores sólidos en comparación con los cultivos monocapa. 17-19 A pesar de esta marcado beneficio, esferoides no se utilizan habitualmente para el cribado de compuestos químicos contra las células cancerosas. Dificultad de producir esferoides de tamaño uniforme en un entorno estándar de alto rendimiento que es compatible con la robótica disponibles en el mercado y herramientas de detección / imagen impide la incorporación de la cultura esferoide en línea de desarrollo de fármacos. Aunque los materiales y las placas personalizados se han convertido recientemente disponible en el mercado para hacer frente a esta necesidad, las consideraciones de costo disuaden de su uso generalizado.

Dos de las principales técnicas con la capacidad de producir esferoides tamaño consistentes en alto rendimiento de utilizar una nueva plataforma de gota colgante y micro pozos microfabricados. 13,16,20 Sin embargo, ambos enfoques requieren placas y dispositivos que son caros de fabricar e inconveniente para los usuarios de puntos finales especiales en centros de investigación básicos y las industrias farmacéuticas donde lo más importante efse hacen fuertes para el descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. A pesar de algunas mejoras en la estabilidad de las gotas que contienen células con un diseño reciente de colgar placas de caída, sólo uno de cada otro agujero de la placa todavía se utiliza durante el cultivo para evitar la propagación / fusión de gotas. 16 Esto disminuye significativamente el rendimiento experimental. Además de Drogas y la renovación es difícil con manual o pipeteo robotizado y esferoides deben ser transferidos a una placa estándar para el análisis bioquímico, porque esta configuración de la placa no es fácilmente compatible con los equipos de control convencional, tal como lectores de placas. 21 Micro-pozos fabricados utilizando litografía blanda también permitir tamaño controlado producción esferoide. 13,20 Sin embargo, la incompatibilidad de esta plataforma con herramientas de pipeteo estándar evita el tratamiento de esferoides individuales con diferentes compuestos de fármacos / concentraciones, exponiendo todos los esferoides a una sola condición de tratamiento. Por lo tanto, este método no es apropiado para altala investigación de compuestos rendimiento que exige la prueba simultánea de múltiples compuestos / concentraciones.

Para superar estos obstáculos, una nueva técnica para la producción de alto rendimiento de esferoides de células de cáncer de tamaño uniforme en placas de 96 pocillos estándar ha sido desarrollado. 22,23 El enfoque se basa en un sistema acuoso polimérico de dos fases (ATPS) con polietilenglicol ( PEG) y dextrano (dex) como polímeros formadores de fase. 24 ATPSs Recientemente se han utilizado en una variedad de aplicaciones biológicas celulares nuevas que permitan micropatterning celular y localizada entrega de reactivos biológicos a las células en medios altamente acuosas. 25-32 Para formar una esferoide, las células cancerosas se mezclan con la fase acuosa DEX y una gota sub-microlitros de la suspensión resultante se pipetean en una solución de fase acuosa PEG de la inmersión pocillo que contiene. La caída sigue siendo inmiscible de la fase de inmersión y las células se limita a facilitar la formación de un esferoide. Diablilloortantly, la fase de inmersión altamente acuosa proporciona nutrientes a las células del esferoide y minimiza el problema bien conocido de la evaporación medios de comunicación común a algunos otros ensayos que causa cambios en la osmolalidad medios de comunicación y las fluctuaciones de las concentraciones de fármaco. Esta técnica permite la producción esferoide y el tratamiento de drogas sólo utilizando reactivos comercialmente disponibles y herramientas de pipeteado en placas de 96 pocillos estándar. Es importante destacar que, el análisis de las respuestas celulares de esferoides se realiza en la misma placa utilizando ensayos bioquímicos estándar y lectores de placas. La facilidad de trabajar con SDFA y adaptabilidad del enfoque para el manejo de líquidos robótico hace alta generación de rendimiento tanto de mono-cultura y la co-cultura esferoides una técnica de laboratorio sencillo. Este nuevo enfoque será un gran paso adelante hacia la integración de esferoides de células cancerosas en los procesos de desarrollo y descubrimiento de fármacos con un mejor rendimiento de las pruebas y la rentabilidad (aumento del número de compuestos y redu probadosconsumo ced reactivo) y la eficiencia (reducción de manos a tiempo).

Un protocolo detallado para la producción robótico de esferoides de células de cáncer en placas de 96 pocillos utilizando el enfoque ATPS se describe a continuación. Además, se presentan los detalles del tratamiento farmacológico de esferoides resultantes y análisis de aguas abajo de respuestas celulares usando un ensayo bioquímico comercial.

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Protocol

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1. Preparación de polimérica acuosa sistema de dos fases (ATPS)

  1. Pesar 0,5 g de polietilenglicol (PEG) (MW: 35.000) y añadirlo a 9,5 ml de medio de crecimiento completo en un cónica 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) PEG fase acuosa.
    Nota: Adición de la mitad del medio a la cónica primero seguido de la adición del polímero y luego la cantidad restante de medio minimiza la adhesión del polímero a las paredes cónicas y ayuda a que el polímero se disuelve más rápido.
  2. Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) y añadirlo a 0,872 ml de medio de crecimiento completo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar 1 ml de 12,8% (w / v) de fase acuosa DEX.
  3. Vortex tanto soluciones durante aproximadamente 1 min para disolver los polímeros en el medio.
  4. Mantenga ambas soluciones en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora para asegurar la disolución y mezclas homogéneas. Mantenga las tapas por encima del nivel del agua para evitar la posibilidad de contaminación de las soluciones del bañoagua.
  5. Cargar la solución de fase de PEG en una jeringa de plástico estéril y pasarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras de tamaño de poro para eliminar las impurezas.
    Nota: llene la jeringa con la solución de PEG, colocarlo en el inserto del filtro en la parte superior de un tubo cónico y el uso de la fuerza, empuje lentamente la solución a través del filtro. Es normal experimentar la resistencia contra el movimiento del émbolo de la jeringa. Pérdida menor de la solución de polímero se produce como parte de la solución permanecerá en el filtro, pero la concentración de polímero no va a cambiar.
  6. Pipetear 10 l de la solución de fase DEX y diluir en 10 l de medio en un tubo separado para dar lugar a 6,4% (w / v) solución de fase DEX. Aspirar 100 l de la solución de fase de PEG y dispensar en una placa de Petri.
    1. Dispensar 0,5 l de la 6,4% (w / v) solución de fase de DEX en la solución de fase de PEG. Confirmar visualmente con éxito la formación de ATPS mediante la observación de una gota DEX bajo un microscopio. El límite gotadebe permanecer visible, indicando la presencia de dos fases acuosas estables, separadas.
  7. Almacenar la madre acuosa PEG y soluciones de fase de DEX en 4 ° C hasta su uso.
    Nota: Se recomienda que las soluciones de polímero se preparan fresco antes de cada experimento y se usan dentro de las 24 horas de almacenamiento.

2. Preparación para la impresión de cáncer esferoides celulares

  1. Se cultivan las células de cáncer de interés (por ejemplo, células MDA-MB-157 de cáncer de mama) a un 90% -100% monocapa confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar un medio compuesto por DMEM que contenía 10% de FBS, 1% de glutamina, y 1% de antibiótico.
    1. Cosecha células utilizando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y cargar la suspensión en una cónica 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo.
  2. Las celdas de carga en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requeridode células para una densidad celular esferoide deseado. Una monocapa confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas en un matraz T75 generalmente da ~ 7 x 10 6 células.
    Nota:. Densidad celular requerida para un volumen de gota para generar un solo esferoide dependerá del tipo de célula 22 Por ejemplo, una densidad de 1,5 x 10 4 o mayor para la MDA-MB-157 células se recomienda por 0,3 l gota fase de DEX a asegurar la formación de un solo esferoide.
  3. Centrifugar las células para una segunda vez durante 5 min a 173,3 xg y resuspender en un volumen apropiado de medio de crecimiento para concentrar la suspensión a una densidad celular deseada.
    Nota: Por ejemplo, si se cosecharon 7 x 10 6 células cancerosas, el volumen total de suspensión de células requerido para formar un esferoide de la densidad de 1,5 x 10 4 células en una gota de fase DEX 0,3 l será 140 l. Sin embargo debido a la dilución con la solución de fase DEX en el siguiente paso, sólo utilizar 70 l de medio de cultivo celular para resuspender las células.
  4. 4 células, 70 l de la solución de fase DEX se añaden a 70 l de suspensión celular.
  5. Mezclar bien la suspensión de células para asegurar una distribución uniforme de células y la mezcla de solución de DEX. Pipeteado arriba y abajo deben hacerse con cuidado para evitar la formación de burbujas.

3. Preparación para la impresión de los esferoides cocultivaron

  1. Se cultivan las células de cáncer (por ejemplo, MDA-MB-157 células de cáncer de mama humano) y células de apoyo (por ejemplo, fibroblastos humanos) a un 90% -100% monocapa confluente. Cosecha de cada tipo de células usando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante).
    1. Cargar cada suspensión en un cónica 15 ml, centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, y el sobrenadante aspirado de cada cónica. Resuspender las células de cada cónica en 1 ml de g completamedio recimiento.
      Nota: Los tintes fluorescentes tales como calceína AM (tinción de células vivas) y colorantes nucleares (Hoechst) se pueden utilizar para distinguir los dos tipos de células.
  2. Cargar cada tipo de célula por separado en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requerido de cada tipo de célula para una relación deseada de las células de cáncer de células de soporte en co-cultivadas esferoides. Monocapas confluentes de células MDA-MB-157 células y los fibroblastos cultivados en matraces T75 suelen dar ~ 7 x 10 ~ 6 y 6 x 10 6 células, respectivamente.
  3. Añadir el volumen correcto de la suspensión de células de sostén a las células cancerosas suspensión para dar una relación deseada de la cantidad de dos tipos de células. Por ejemplo, utilizar una proporción de 50 células cancerosas a 1 celular de fibroblastos.
  4. Centrifugar la cónica que contiene la suspensión celular se mezcló durante 5 min a 173,3 células XG y resuspender en un volumen apropiado para dar como resultado la densidad final que comprende de volúmenes iguales de medio de crecimiento y el 12,8% (w / v) DEX acuosasolución de fase (preparado en 1.2).
  5. Pipetear suavemente la suspensión celular resultante de arriba a abajo para asegurar la homogeneidad de la suspensión.

4. Impresión de esferoides tumorales en una placa de 96 pocillos

  1. Un día antes de los experimentos, recubrir placas no tratadas, de fondo redondo de 96 pocillos con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C durante 24 hr. Este recubrimiento evita la unión de células durante el período de cultivo.
  2. Dispensar 50 l de la filtró 5% (w / v) PEG fase acuosa en cada pocillo de una (placa de destino) placa de 96 pocillos.
  3. Con una pipeta, mezclar la suspensión celular (preparado en el paso 2 o el paso 3 de los mono y co-cultivo, respectivamente) y añadir 20 l de la suspensión de todos los demás bien de una columna de una placa de 384 pocillos (placa de fuente) .
  4. Encienda el manipulador de líquidos y "casa" la cabeza de pipeteado para registrar las coordenadas. A continuación, compile un protocolo previamente definido (por debajo de 4,6) para asegurar el material de laboratorio y los parámetros se definen correctaly. Este paso "homing" puede ser diferente para diferentes manejadores de líquidos.
    Nota: El flujo del protocolo, se muestra paso a paso a continuación en 4.6, será similar independientemente del manipulador de líquidos robótico utilizado; Sin embargo, la interfaz de programación puede ser diferente debido a la utilización de un software diferente.
  5. Colocar la placa fuente, la placa de destino, y las cajas de puntas de pipeta en las posiciones definidas en la estación de trabajo del manipulador de líquidos como se muestra en la Figura 1.
  6. Ejecutar el protocolo que incluye los siguientes pasos:
    1. Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado del manipulador de líquidos con la mezcla de puntas de pipeta (8 tips) desde la estación de trabajo (Figura 1).
    2. Mezclar la suspensión celular en pocillos de la placa fuente (Figura 1). Seleccionar un volumen de mezcla más pequeño que el volumen de suspensión celular en pocillos para evitar la formación de burbujas.
    3. Expulsar puntas en una caja de vertederos vacío (Figura 1). Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado con 10 l de dispensación puntas de pipeta (Figura 1).
    4. Aspirar 0,3 l de la suspensión de células de la placa fuente (Figura 1) en cada punta de la pipeta.
    5. Dispensar la suspensión de células en los pocillos de una columna de la placa de destino (Figura 1). Utilice una altura de dispensación de 0,5 mm y una velocidad de flujo de dispensación de menor que 1 l / seg.
    6. Repetir los pasos 4.6.1 a través de 4.6.6 hasta que la impresión de la columna por columna en toda la placa de destino es completa.
  7. Retire con cuidado la placa de destino de la superficie de trabajo y colocarla en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO 2. Mantener la placa horizontal al introducirla a la incubadora para evitar la interrupción de las gotas de la fase de ejecución directa que contienen células.
  8. Incubar la placa durante 24 horas para permitir la agregación de células en un esferoide dentro de la gota fase DEX.
<p class = "jove_title"> 5. Tratamiento de Drogas de esferoides de células cancerosas

Tenga en cuenta que el siguiente protocolo es para un tratamiento farmacológico de 4 días e incluye una renovación con el fármaco fresco después de día 2. Puede ser modificado para otros períodos de tratamiento.

  1. Confirmar visualmente la formación de esferoides en placas de 96 pocillos después de 24 horas. Si es necesario, pozos de imagen para la medición del tamaño de esferoides promediando los diámetros más pequeños y más grandes de cada esferoide.
  2. Preparar la solución de stock de un fármaco deseado mediante su disolución en un disolvente recomendado por el fabricante a una concentración de solubilidad predeterminado. Por ejemplo, el cisplatino se disuelva en agua a 2 mg / ml.
    Nota: Proteja la solución madre de la droga de la luz si el fármaco es sensible a la luz.
  3. Utilizando la técnica de dilución en serie, preparar concentraciones de fármaco diluido con medio de cultivo celular a partir de la solución madre preparada en la etapa anterior. Cada dilución se debe hacer dos veces la concentración deseada. Dilratios de ution variarán dependiendo de la concentración de stock de partida y concentraciones de trabajo deseada.
  4. Añadir 50 l de solución de fármaco preparada en el paso anterior a cada pocillo. Esto se puede hacer robóticamente o mediante pipeteo manual.
    Nota: Cada concentración del fármaco se diluye en medio a la concentración deseada por la fase acuosa PEG 50 l ya en cada pocillo.
    1. Utilice esferoides de dos columnas de una placa de 96 pocillos (n = 16) para cada concentración.
    2. En los pocillos de control, añadir sólo 50 l de medio de cultivo fresco a los 50 l de la fase acuosa PEG existentes.
  5. Incubar esferoides con el fármaco durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz.
  6. Después de 48 h de incubación, preparar diluciones frescas de la droga a concentraciones deseadas y renovar de drogas mediante la adición de 50 l de solución de fármaco fresco a cada pocillo.
    Nota: Los pozos ya contienen la concentración de fármaco deseado a partir de la primera droga tratamiento. Por lo tanto en esta fase de renovación, cada concentración se prepara a la concentración deseada, ya que no se producirá una dilución.
  7. Incubar esferoides con el medicamento durante otras 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz.

6. Análisis de la viabilidad celular en esferoides

  1. Después de 48 horas de incubación con el fármaco renovado (es decir, el tiempo total de tratamiento de esferoides con un fármaco es 4 días), medir el volumen total de medio en un pocillo mediante pipeteo manual.
    Nota: El volumen típico en un pocillo es de ~ 140 l (una pequeña disminución se produce debido a la evaporación).
  2. Calcular el volumen de reactivo de la viabilidad celular (por ejemplo, PrestoBlue) como la concentración de 10% del volumen total así. Añadir este volumen de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo.
    Nota: Con un volumen de medios de comunicación existentes de 140 l en un pozo, se requiere un volumen de 15,6 l para dar una concentración 10% del total así. Esto se calculadividiendo el volumen de medios existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 l).
  3. Se incuba la placa con el reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo durante 6 horas a 37 ° C, protegido de la luz.
  4. Colocar la placa en un lector de micro-placa y leer la señal de fluorescencia a 560 nm y 590 nm de excitación y de emisión de longitudes de onda, respectivamente.
  5. Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en los esferoides por la normalización de la señal fluorescente de los pocillos tratados con el de los pocillos de control después de promediar los valores de las mismas condiciones de tratamiento.

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Representative Results

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La estación de trabajo del manipulador de líquidos robótico se muestra en la Figura 1. La cabeza de pipeteado y todas las estaciones utilizadas en la impresión robótica de esferoides en la sección 4.6 se etiquetan. La imagen muestra el uso de dos estaciones diferentes de cajas de punta (un conjunto de consejos para la mezcla y el segundo conjunto para la aspiración / dispensación de mezcla de fase DEX-suspensión acuosa de células). Toda la instalación se encuentra en un armario estándar de seguridad biológica para mantener la esterilidad. La figura 2 muestra un esquema del proceso de "impresión" con el sistema de dos fases acuosa. Una punta de pipeta cargada con la suspensión de células en la fase acuosa DEX (azul, fase patrón) se reduce en un pozo de fondo redondo de una placa de 96 pocillos que contiene la fase acuosa PEG (rosa, la fase de inmersión) para dispensar su contenido cerca la parte inferior así. La caída de fase DEX resultante restringe a las células cancerosas de dispersión y alienta interacciones célula-célula que resultan enla agregación de las células y la formación de esferoides. La formación de esferoides es espontánea y ocurre dentro de 24 horas de incubación como se muestra en la imagen experimental de la figura 2. En la práctica, esto se lleva a cabo la impresión esferoide columna por columna en placas de 96 pocillos. Después de formar esferoides, medio de cultivo se renueva mediante la adición directa de medio fresco, convirtiendo el sistema de dos fases a una sola fase acuosa. Esta transición es debido a la reducción en concentraciones de PEG y DEX debajo de una concentración umbral requerido para la separación de PEG acuosas y DEX fases.

Dispensación de un mecanismo de pipeta de desplazamiento de aire convencional del manipulador de líquidos se paramétrica optimizado y se comprobó que una altura de dispensación de 0,5 mm, un caudal de dispensación de menores de 1 l / seg seguido dispensando 0,2 l de pre-aspirado volumen de aire produce el tamaño más consistente de DEX acuosa cae, y por lo tanto esferoides. 23 Figura dis 3areproduce la distribución de diámetro de 96 esferoides de una placa con un diámetro medio de 332 ± 31 micras. La experiencia demuestra que este enfoque genera típicamente esferoides con 8% -10% error estándar alrededor del diámetro medio. La Figura 3b muestra la distribución de frecuencia de diámetro de esferoides de la misma placa como en la Figura 3a, lo que demuestra que los diámetros se distribuyen normalmente.

A continuación, se demostró el potencial de este enfoque para el cribado de compuestos en placas de 96 pocillos estándar y análisis de las respuestas celulares en las mismas placas, sin necesidad de transferir esferoides a nuevas placas. La Figura 4 muestra un estudio dependiente de la dosis de la viabilidad de MDA -MB-157 de mama esferoides celulares de cáncer tratados con un fármaco quimioterapéutico clínica, cisplatino. Esferoides tratados con la droga y de control se incubaron con un reactivo PrestoBlue comercial (reactivo de la viabilidad celular). Células enzimáticamente activas redujeron el reaGent y resultó en un cambio en el color de los medios de comunicación y un cambio en la señal fluorescente. El cambio en la señal fue mayor con células vivas (por ejemplo, en esferoides de control). La viabilidad de las células cancerosas en esferoides disminuyó con el aumento de la concentración de fármaco por encima de 1 mM. Esta prueba resultó en una concentración de fármaco dosis letal 50% de LD50 = 4,67 M.

Esta tecnología sistema acuoso de dos fases para la cultura 3D permite la producción directa de modelos tumorales más realistas mediante la inclusión de otros componentes de microambientes celulares apoyo células del estroma, tales como. Se ha demostrado previamente que la inclusión de las células del estroma en cultivos 3D modula el crecimiento, la proliferación y la invasión de las células cancerosas. 33-35 como una prueba de concepto esferoides experimento, co-cultivo fueron generados mediante la combinación de MDA-MB-157 de mama humano las células cancerosas y fibroblastos humanos en una proporción de 50:. 1 36 Antes de los experimentos, se tiñeron las células MDA-MB-157 y fibroblastoscon un colorante nuclear (azul) y el tinte de células vivas (verde), respectivamente, para permitir la detección de células en imágenes fluorescentes. La figura 5a muestra fluorescentes y de fase imágenes de esferoides co-cultivo con una densidad de 1,5 x 10 4 células y un 50 :. 1 relación de las células cancerosas y fibroblastos Figura 5b muestra esferoides de control de MDA-MB-157 células para la comparación. Este enfoque permitirá evaluar el efecto de las células del estroma en varios fenotipos de células cancerosas.

Figura 1
Plataforma Manejo Figura 1. Líquido. El manejador de líquido consiste en estaciones donde mezcla consejos, consejos de dispensación, caja consejos de residuos, la placa de la fuente, y los lugares de destino de placas se colocan. La ubicación de cada estación se define en el protocolo. Puntas de mezcla se cargaron en una columna de la cabeza de pipeteado y se usan para mezclar la solución de la fase acuosa DEX que contiene células en la placa de fuente. Estos consejos son luego eliminados de la caja de escombreras y las puntas de dispensación se insertan en la misma columna de la cabeza de pipeteado. Estos consejos aspiran 0,3 l de la fase acuosa que contiene DEX células de la placa fuente y dispensar en la placa de destino para formar gotas que contienen células de la fase de DEX dentro de la fase de PEG de inmersión ya en los pocillos de la placa de destino. Finalmente estos consejos también son desechados en el cuadro de vertederos para completar un ciclo de impresión.

Figura 2
Figura 2. la formación de esferoides. El manipulador de líquidos dispensa 0,3 l de la fase acuosa DEX (azul) que contiene células (verde) en un pozo que contiene la solución acuosa de PEG (rosa). Esto resulta en la formación de un esferoide después de 24 horas de incubación como se muestra en la imagen a la derecha. Barra de escala de 200 micras.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. esferoide coherencia de datos. (A) La distribución de diámetro de esferoides medidos de una placa de 96 pocillos, cada punto representa un esferoide. (B) Distribución de frecuencias de diámetros muestra la distribución normal de los datos.

Figura 4
Figura 4. Respuesta de Drogas de esferoides. La viabilidad de las células en MDA-MB-157 esferoides celulares de cáncer de mama se reduce con el aumento en la concentración de cisplatino más de 1 nM-200 gama M. La línea punteada es un ajuste sigmoidal a los datos de viabilidad.

Figura 5
Figura 5. co-cultivo esferoides (a) fluorescente (izquierda) y de contraste de fase imágenes (derecha) de esferoides de MDA-MB-157 células de cáncer de mama (azul) co-cultivadas con fibroblastos (verde) en un 50:. 1 ratio. (B) Los esferoides de MDA-MB-157 células se muestran para comparación. Barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Esferoides presentan un modelo realista para entender mejor la fisiología del tumor y la eficacia del fármaco y proporcionar una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos anti-cáncer. Dichas aplicaciones se beneficiarían mucho de técnicas sencillas de generación y mantenimiento esferoide que sólo requieren material de laboratorio estándar, herramientas de manejo de líquidos y equipos de control. El uso de un sistema de dos fases acuosa células cancerosas espontáneamente agregados dentro de la fase de caída permite una producción eficiente y el mantenimiento de esferoides con manipuladores robóticos líquidos, y en el tratamiento de drogas situ y el análisis de punto final de respuestas celulares con reactivos comerciales y herramientas. Por lo tanto, esta tecnología es una gran ventaja sobre los enfoques existentes de cultivos de células de cáncer de 3D y presenta una plataforma de cribado para acelerar el descubrimiento de fármacos.

Generación de esferoides de tamaño uniforme dentro de una placa micro-así es crucial para las aplicaciones de cribado de alto rendimiento para asegurar una línea de base celular ac similaresnivel tividad en todos los esferoides. El uso de manipuladores de líquidos con un mecanismo de pipeteado de desplazamiento de aire, es importante para optimizar el proceso de dispensación a través de la cuantificación del efecto de los parámetros de manejo de líquidos clave (prescindir de altura, prescindir de velocidad de flujo, y pre-aspirado volumen de aire) en la dispensación de la fase acuosa DEX . Esta optimización permite que la cabeza de pipeteado para barrer a cabo la solución de fase DEX viscosa y las células cancerosas en los pozos y producir esferoides homogéneos. Aunque las cantidades específicas para estos tres parámetros se han determinado en el protocolo para el manipulador de líquidos SRT Bravo, un enfoque similar se debe emplear con otros manejadores de líquidos para determinar las condiciones óptimas de distribución que resultan en tamaño de gota fase DEX consistente dispensado en la fase de PEG inmersión. Además, es posible el uso de 96 puntas y para imprimir simultáneamente esferoides en los 96 pocillos. Sin embargo, esto aumenta significativamente el número de células requerido para llenar la placa de fuente con elFase acuosa que contiene células DEX. Independientemente de la selección de métodos de impresión por columnas o conjunto de placa, es crucial para mezclar el contenido de la placa de fuente antes del paso de aspiración. Esto asegura que la suspensión de células en la fase densa DEX es homogénea y reduce las variaciones en el tamaño de esferoides.

Varios estudios muestran que esferoides celulares de cáncer imitan varias propiedades clave de los tumores avasculares tales como la morfología y de difusión limitaciones de reactivos; por lo tanto presentan un modelo fisiológicamente relevante para evaluar la eficacia de compuestos nuevos y convencionales contra las células cancerosas en comparación con cultivos de células monocapa tradicionales. 8,17,18,21,23,37 Se muestra que el enfoque de sistema de dos fases acuoso para producir esferoides permite convenientemente la detección de drogas en la misma placa, simplemente mediante la adición y la renovación de un compuesto de drogas en los puntos de tiempo deseados y el cribado automatizado de la viabilidad celular usando un lector de microplaca estándar. Estees una gran ventaja sobre técnicas tales como gotas colgantes que requerirían la transferencia de esferoides a una placa estándar para el análisis de respuestas celulares a las drogas. 21 Además, se sabe que el apoyo a células en el microambiente tumoral y sus interacciones con las células de cáncer están implicadas en diversos fenotipos malignos de células cancerosas. 33-35,38,39 por tanto, la capacidad de generar esferoides de co-cultivo de cáncer y las células del estroma utilizando la tecnología acuosa de dos fases ayudarán a evaluar la influencia de células de soporte de microambiente tumoral en las respuestas de cáncer células a diversos tratamientos. El experimento de co-cultivo realizado en este estudio sirve como un concepto de prueba de que esta tecnología puede generar correctamente esferoides que contienen células cancerosas y las células del estroma. Los estudios futuros aprovechar esta capacidad e investigar las características diferenciales de esferoides mono y co-cultivadas tales como respuestas de proliferación y de drogas. Además, esteLa tecnología ofrece una plataforma para imitar más de cerca el vivo microambiente tumoral en al incluir otros componentes del estroma en el modelo de tumor. 40

En resumen, este protocolo permite la formación espontánea de esferoides en placas de 96 pocillos sin usar ninguna fuerza externa. La adaptación de la técnica a un manipulador de líquidos robótica mejora la velocidad y la eficiencia de la producción esferoide en un formato de alto rendimiento estándar. La compatibilidad de la tecnología con la imagen comercial y el ensayo analiza las plataformas permite el uso de diferentes instrumentos disponibles en los laboratorios académicos e industriales. Para las aplicaciones futuras, este protocolo permitirá agilizar la detección de drogas con cultivos de células de cáncer de 3D, una técnica de rutina. Además, este enfoque puede ser fácilmente modificado para formar esferoides de diferentes tamaños, diferentes tipos de células, diferentes combinaciones de células cancerosas y estroma en esferoides de co-cultivo, y puede escalar hasta un mayor rendimiento placas micro pocillos to acelerar aún más la detección de drogas anti-cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

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Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga
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Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

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